阅读说明：本技术 一种采用花序浸染快速高效遗传转化二穗短柄草的方法 (Method for rapid and efficient genetic transformation of brachypodium distachyon by inflorescence dip-dyeing ) 是由 李鹏 储昭庆 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种采用花序浸染快速高效遗传转化二穗短柄草的方法,包括：A、农杆菌EHA105的转化和阳性克隆的鉴定；B、农杆菌浸染二穗短柄草花序；C、转基因二穗短柄草T0代阳性植株获得。本发明通过农杆菌介导的浸染花序遗传转化方法,避免了愈伤组织的培养过程,而且可节省大量的时间,为作物的遗传改良提供了有效的快速获得转基因植株的方法。(The invention discloses a method for rapid and efficient genetic transformation of brachypodium distachyon by inflorescence dip-dyeing, which comprises the following steps: A. transformation of agrobacterium EHA105 and identification of positive clones; B. the agrobacteria dip-dyeing of the inflorescence of the two-spike brachypodium; C. transgenic brachypodium distachyon T0 generation positive plants. The invention avoids the culture process of callus by the agrobacterium-mediated genetic transformation method of the dip-dyed inflorescence, can save a large amount of time, and provides an effective and rapid method for obtaining transgenic plants for genetic improvement of crops.)

一种采用花序浸染快速高效遗传转化二穗短柄草的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用花序浸染快速高效遗传转化二穗短柄草的方法。

背景技术

禾本科植物包含600多个属10000多个种，小麦、大麦、黑麦和燕麦等早熟禾亚科是其中最具有经济价值的类群。早熟禾亚科作物大多具有大而复杂的基因组，如大麦基因组为5096Mb，x＝7；而六倍体普通小麦的基因组则为17000Mb，具有A、B和D三个完全独立的基因组，3x＝21，这使得麦类作物的基因组和功能基因组研究面临巨大的挑战。

水稻是第一个完成全基因组测序的禾本科植物，但水稻作为模式植物研究温带禾谷类粮食作物却存在很多难以克服的困难。首先水稻与麦类植物亲缘关系较远，早在5千万年前就与温带禾谷类粮食作物处在不同的进化分枝上，基因组间的共线性也不理想；另外，水稻需要严格的栽培条件，且植株高大，生长周期长，不适合在试验室条件下大量密植。

短柄草属(Brachypodium)属禾本科(Poaceae)早熟禾亚科(Pooideae)，包含约10个种，其中短柄草是多年生，基本染色体数是9，2n＝2x＝18，1C＝470Mb；而二穗短柄草是一年生，基本染色体数是5，有2倍体、4倍体和6倍体等不同倍性材料，基因组约为272Mb，是拟南芥基因组的2倍，而小于水稻基因组(441Mb)，基因组中含有不到15％的DNA重复序列。二倍体生态型Bd21不需要春化诱导便能开花结实，生命周期约3个月。二穗短柄草与粮食作物小麦、大麦、燕麦、黑麦等同属早熟禾亚科，早于禾本科发生了染色体加倍事件，紧密的系统发生学关系使得短柄草比水稻更适合作为麦类作物的模式植物。早熟禾亚科中重要的粮食作物，如小麦和大麦等，因为广泛的基因重组导致基因组巨大且复杂，可以利用二穗短柄草的基因组序列信息通过比较基因组学对其进行金银识别和基因组分析；BAC(BacterialArtificial Chromsomes)物理图谱显示，二穗短柄草与水稻和高粱在基因含量和基因家族结构上也十分相似，这使得二穗短柄草可以作为禾本科所有植物的功能基因组研究模型。

除此之外，二穗短柄草作为模式材料还具有如下优势：株型小，成熟的植株高度约为20cm，几乎与拟南芥相同，容易进行高通量的遗传学操作和突变体筛选等工作。容易培植，减少试验维护成本。生命周期短，Bd21生态型从种子到种子只需3个月，通过春化和光照诱导可以调控某些二倍体品系的开花时间。二穗短柄草的花药和柱头被内稃和外稃紧紧包裹，因此天然状态下为自花授粉，易形成自交和近交系。

遗传转化方法获得转基因材料，是进行基因功能分析和改良作物性状的必要手段。而目前二穗短柄草的遗传转化，均是通过幼胚或者成熟胚诱导愈伤组织、农杆菌浸染愈伤组织、进而诱导愈伤分化出芽和根，这样复杂的程序来获得转基因植株，整个过程最快也需要3-4个月，而且还存在一定的体细胞突变。而本发明所提供的农杆菌浸染花序的转化方法，简单易行，省去愈伤诱导、培养和分化等繁琐过程，避免了其组织培养中对于实验设备和实验技术的高要求，以及激素配比的准确调节，节省大量时间和人力、物力，大大节约了实验成本；由于避开了组织培养阶段，还可排除因组织培养中出现的体细胞变异；该方法获得的转基因植株遗传稳定性好，符合孟德尔遗传规律，并且可以直接收获种子，用于进一步纯合子的筛选。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种采用花序浸染快速高效遗传转化二穗短柄草的方法。本发明的方法具有操作简便、转化周期短、转化效率高、假阳性低等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种采用花序浸染快速高效遗传转化二穗短柄草的方法，包括如下步骤：

A、农杆菌转化

在农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA，第一次冰浴，然后液氮处理，再水浴处理；再第二次冰浴后加入YEB液体培养基中振荡培养，取出培养后的菌液涂于含抗生素的固体YEB培养基上倒置培养，获得阳性农杆菌单菌落；

B、农杆菌浸染二穗短柄草花序

将阳性农杆菌单菌落接种与含抗生素的YEB培养基中振荡培养，然后进行扩大培养，至OD600值达0.8-1.2后，离心，重悬得农杆菌悬浮液；将待转化的二穗短柄草花序浸没在农杆菌悬浮液中进行浸染，然后进行暗培养，再正常环境培养，待长出新的小穗后，以同样的方法浸染，重复2-3次，即得浸染后的二穗短柄草；

C、转基因二穗短柄草T0代阳性植株的获得

将步骤B获得的浸染后的二穗短柄草培养至种子成熟后，剥去外壳，消毒后播种于含潮霉素的1/2MS培养基表面，长出幼苗后移栽至土壤中，正常培养，即得转基因二穗短柄草T0代阳性植株。

优选地，步骤A中，所述质粒DNA的加入量为0.1-1μg/50μl农杆菌感受态细胞；

所述第一次冰浴时间为30min，液氮处理时间为5min，水浴处理为37℃水浴5min，第二次冰浴时间为2-5min。

优选地，步骤A中，所述振荡培养为：28℃、220rpm振荡培养3-5h；

所述倒置培养为：28℃倒置培养2-3天。

优选地，步骤B中，所述振荡培养为：28℃振荡培养过夜；

所述扩大培养为：将振荡培养后的农杆菌单菌落接种至含抗生素的YEB培养基中，使初始OD600值为0.2-0.6，28℃、220rpm振荡培养3-4h；

所述离心条件为：4000rpm下离心15min；

所述重悬液包括MS液体培养基、Silwet L-77 0.01-0.04％、乙酰丁香酮100-400μmol/L，pH＝5.6-6.4；所得农杆菌悬浮液的OD600值为0.8-1.2。其中，Silwet L-77为表面活性剂，能通过减少液体的表面张力、有利于农杆菌的吸附来可提高转化效率，但浓度过高会对植物产生毒害，甚至导致植物枯萎；乙酰丁香酮作为悬浮液成分，其使用浓度至关重要。乙酰丁香酮通过诱导农杆菌基因组中vir基因的活化，激活毒性区上其他基因的表达，使T-DNA成功导入，提高转化效率。浓度过低，转化效率降低；浓度过高，对植物会产生毒害作用。

更优选地，所述扩大培养前的初始OD600值为0.2-0.3，进行扩大培养后，至OD600值达0.8-1.0；所得农杆菌悬浮液的OD600值为0.8-1.0。

最优选地，所述扩大培养前的初始OD600值为0.3，进行扩大培养后，至OD600值达0.8；所得农杆菌悬浮液的OD600值为0.9。；

所述重悬液包括Silwet L-77 0.02％，乙酰丁香酮200μmol/L，pH＝5.8。

优选地，步骤B中，所述浸染时间为10s，暗培养时间为24h，正常环境培养7-10天。

优选地，步骤C中，所述消毒处理具体为：75％乙醇消毒2-10min，30％次氯酸钠溶液消毒5-10min，然后无菌水漂洗3次；

所述幼苗长有白色长根、含2-3片叶片。

更优选地，所述消毒处理具体为：75％乙醇消毒5min，30％次氯酸钠溶液消毒10min，然后无菌水漂洗3次；

优选地，步骤C中，所述1/2MS培养基中，潮霉素浓度为20-80mg/L。更优选潮霉素浓度为50mg/L。

优选地，所述二穗短柄草的生态型为Bd21、Bd21-3、Bd1-1、Bd2-3中的一种，但不限于此；所述农杆菌菌株为EHA105、LBA4404、EHA101、EHA105、GV3101和AGL1中的一种，但不限于此；所述质粒DNA为含有潮霉素抗性基因(HYG(R))的pCAMBIA1300，或其他含有潮霉素抗性基因(HYG(R))的植物双元表达载体；潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述含抗生素的固体YEB培养基、含抗生素的YEB培养基中，所含抗生素为卡那霉素和利福平，抗生素的浓度为50mg/L。

优选地，步骤A和C中，对所述阳性农杆菌单菌落、转基因二穗短柄草T0代阳性植株进行鉴定采用的PCR体系为：在每20μL反应体系中，Taq DNA聚合酶0.2-1.5U，dNTP各0.2-0.5μmol/L，引物0.2-1.0μmol/L，10-150ng模板DNA；采用的引物如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

上游引物和下游引物序列分别为5’ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA3’(SEQ IDNO.1)、5’CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTG3’(SEQ ID NO.2)；

采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次，72℃延伸10min，4℃保存。

更优选地，所述PCR体系为：在每20μL反应体系中，Taq DNA聚合酶1.0U，dNTP各0.25μmol/L，引物0.5μmol/L，50ng模板DNA。

本发明所用的YEB培养基、MS培养基均为市售常规产品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

传统的二穗短柄草遗传转化方法中，组织培养操作复杂，技术性高，而且还存在一定的体细胞突变。本发明利用农杆菌介导的浸染花序遗传转化方法，避免了组织培养和再生过程，可以直接收获种子，大大缩短了转化周期，且避免了组织培养中对于实验设备和实验技术的高要求，以及激素配比的准确调节；由于避开了组织培养阶段，还可排除因组织培养中出现的体细胞变异；本发明方法更为简便，操作性更强，有较高的转化效率，并且该方法获得的转基因植株遗传稳定性好，符合孟德尔遗传规律，并且可以直接收获种子，用于进一步纯合子的筛选。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为质粒pCAMBIA1300图谱；

图2为菌落PCR鉴定农杆菌电泳图,M：标准分子量DNA，下同，1-8:8个农杆菌单菌落；

图3为潮霉素筛选所获得阳性苗待选株生长状态图；其中，图3a展示阳性苗地上部分生长状态，图3b展示阳性苗根部生长状态；

图4为潮霉素筛选非阳性苗与阳性苗待选株生长状态对比图，左侧三棵为未转化成功的植株，右侧三棵为转化所获得的阳性苗待选株；

图5为阳性苗待选株PCR鉴定电泳图，WT：野生型，1-8：阳性苗待选株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

如无特殊说明，本发明所述各实验材料及生物用品均为市售常规产品，所用生物学手段均为本领域技术人员常用方法实施。

实施例1

1、农杆菌的转化和阳性克隆的鉴定

50μl农杆菌感受态细胞(采用的农杆菌菌株为EHA105)中加入含潮霉素抗性基因(HYG(R)，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的质粒DNA(pCAMBIA1300，图谱如图1所示)0.1-1μg，之后冰浴30min；放入液氮中5min，然后立即放入37℃水浴5min；取出离心管，冰浴2-5min，加入0.5ml YEB液体培养基，28℃、220rpm振荡培养3-5h；取出菌液涂于含相应抗生素卡那霉素和利福平(浓度均为50mg/L)的YEB固体培养基上，培养箱中28℃倒置培养2-3天；挑取单菌落，做菌落PCR鉴定，PCR体系为：在20μL反应体系中，Taq DNA聚合酶1.0U，dNTP各0.25μmol/L，引物0.5μmol/L，50ng模板DNA；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次，72℃延伸10min，4℃保存。

上游引物和下游引物序列分别为5’ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA3’(SEQ IDNO.1)、5’CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTG3’(SEQ ID NO.2)，扩增长度1026bp。

由图2可以看出，挑取的8个单菌落，在1000bp附近，有目的条带，说明均为质粒转化的阳性克隆。

2、农杆菌浸染二穗短柄草花序

取上述鉴定阳性的农杆菌单菌落，接种于含相应抗生素卡那霉素和利福平(浓度均为50mg/L)的5ml YEB培养基中，28℃振荡培养过夜；检测农杆菌OD600值，取适量加入至含相应抗生素的50ml新鲜YEB培养基，使初始OD600值0.3-0.4，28℃、220rpm振荡培养3-4h，使OD600达到0.8左右；4000rpm，离心15min，用新鲜配制的重悬液重悬菌体，使OD600在0.8左右；将待转化的二穗短柄草花序(约50天左右植株)，浸没在农杆菌悬浮液中10s，保证每个小穗均被浸染；保鲜膜包裹浸染过的小穗，暗培养24h后，取下保鲜膜，正常环境培养；10天左右，待新的小穗长出后，同样方法浸染，以后再重复2-3次。

所述重悬液为MS液体培养基(含蔗糖30g/L)，并加入Silwet L-77 0.005-0.04％,乙酰丁香酮50-400μmol/L,pH＝5.5-6.5。

3、转基因二穗短柄草T0代阳性植株的筛选与鉴定

待浸染过的二穗短柄草的种子成熟后，剥去外壳，消毒处理至无菌状态：75％乙醇消毒5min，30％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水漂洗3次，播种于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基表面。14天后，由图3可以看出，部分萌发后的幼苗，根部正常白色(箭头所示)，并已长出2-3叶，为阳性苗待选植株。由图4看出，非阳性苗无根或者根部极短且褐化，叶片未正常生长，与阳性苗待选株差异显著。

将阳性苗待选株移栽至土壤介质中，正常培养。待长出5-6叶，剪下一片提取DNA，做PCR鉴定，能扩增出目的条带的所对应植株即为转基因T0代阳性苗。PCR体系为：在20μL反应体系中，Taq DNA聚合酶1.0U，dNTP各0.25μmol/L，引物0.5μmol/L，50ng模板DNA；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次，72℃延伸10min，4℃保存。

上游引物和下游引物序列分别为5’ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA3’(SEQ IDNO.1)、5’CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTG3’(SEQ ID NO.2)，扩增长度1026bp。

由图5看出，在1000bp位置，未做转化的野生型(WT)无目的条带，与理论一致；5号植株未扩增出目的条带，不是阳性植株；除5号外，1-8号的其他植株均有目的条带，说明这些为转化成功的阳性植株。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海辰山植物园

<120> 一种采用花序浸染快速高效遗传转化二穗短柄草的方法

<130> DD03193

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaaagc ctgaactcac cgcga 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca 780

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ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

aaatag 1026