大豆糖转运体基因GmSWEET39的应用

文档序号：1609402 发布日期：2020-01-10 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 大豆糖转运体基因GmSWEET39的应用 (Application of soybean sugar transporter gene GmSWEET39 ) 是由李艳苗龙盖钧镒张凯杨松楠于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了大豆糖转运体基因GmSWEET39的应用。大豆糖转运体基因GmSWEET39在培育高含油量的植物新品种或转基因植物中的应用。该基因在栽培豆中具有3种启动子序列Pro1,Pro2,和Pro3；两种编码序列CDS1和CDS2。Pro3和CDS2为控制大豆籽粒油脂含量的优异变异。过量表达GmSWEET39优异变异序列的拟南芥和大豆发根,转化植株的含油量显著提高。对大豆重组自交系群体中具有不同启动子或CDS类型的后代家系进行含油量比较,证实Pro3和CDS2为GmSWEET39的优异变异,该基因的优异变异类型将作为大豆育种计划中油脂含量遗传改良的宝贵基因资源。(The invention discloses application of a soybean sugar transporter gene GmSWEET 39. Application of soybean sugar transporter gene GmSWEET39 in breeding new plant varieties or transgenic plants with high oil content. The gene has 3 promoter sequences Pro1, Pro2 and Pro3 in cultivated beans; two coding sequences CDS1 and CDS 2. Pro3 and CDS2 are excellent variations for controlling the oil content of soybean seeds. Arabidopsis thaliana and soybean with over-expression GmSWEET39 excellent variant sequence are rooted, and the oil content of the transformed plant is obviously improved. The oil content comparison of the progeny families with different promoters or CDS types in the soybean recombinant inbred line population proves that Pro3 and CDS2 are excellent variation of GmSWEET39, and the excellent variation type of the gene can be used as a precious gene resource for genetic improvement of oil content in a soybean breeding plan.)

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了大豆糖转运体基因GmSWEET39的应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是我国具有重要战略意义的农作物，也是世界上饲料和食品中最重要的豆科作物，因为高品质的大豆种子中含有超过40％的蛋白质和20％的油脂含量。虽然种子中蛋白质成分通常约为油脂的两倍，但大豆却是世界上产量最高的油料作物，为全球贡献了29％的食用油份额。大豆油及其衍生物是包装食品中普遍存在的成分，尤其是饼干和一些休闲食品。随着人们对植物油的需求增加以及消费者对膳食优质脂肪酸意识的提高，油脂含量和品质都引起了大豆育种工作者的关注。因此大豆籽粒油脂有利基因的发掘和利用对大豆品质改良、满足人类生产需求具有重要意义。

糖是生物体的主要碳源及能量来源，在植物生长发育中起着重要作用。SWEET(sugar will eventually be exported transporters)是近些年被鉴定的一类糖转运蛋白，由三个跨膜结构域串联重复组成的七螺旋结构，并由反向连接子跨膜结构域连接。SWEET能够促进糖沿着浓度梯度穿过细胞膜，为糖进行长距离运输、在非光合组织中发挥作用做准备，分析SWEET蛋白介导的糖转运与油脂积累之间的关系和克隆优异的SWEET基因对于分子改良具有优异籽粒油脂含量的大豆品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对大豆籽粒油脂性状改良育种，提供一个糖转运体基因GmSWEET39(Glyma.15g049200)在油脂积累方面的功能及应用。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

大豆糖转运体基因GmSWEET39在培育高含油量的植物新品种或转基因植物中的应用。

该GmSWEET39基因在栽培豆中具有3种启动子序列(Pro1,Pro2,和Pro3)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2和SEQ ID.NO.3；两种编码序列(CDS1和CDS2)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。Pro3和CDS2为控制大豆籽粒油脂含量的优异变异。

含有大豆糖转运体基因GmSWEET39的重组表达载体在培育高含油量的植物新品种或转基因植物中的应用。

所述的大豆糖转运体基因GmSWEET39启动子序列优选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.3中的一种，进一步优选如SEQ ID NO.3所示。

所述的大豆糖转运体基因GmSWEET39的CDS序列优选自SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5中的一种，进一步优选如SEQ ID NO.5所示。

大豆糖转运体基因GmSWEET39的启动子和/或CDS序列在筛选高籽粒油脂含量的植物中的应用。

所述的大豆糖转运体基因GmSWEET39启动子序列优选如SEQ ID NO.3所示，所述的大豆糖转运体基因GmSWEET39的CDS序列优选如SEQ ID NO.5所示。

有益效果：

本发明提供的糖转运体基因GmSWEET39在高油和低油大豆品种中的差异表达分析，表明该基因在大豆籽粒油脂积累中起到重要作用。在80份不同含油量的大豆品种中发现该基因的表达丰度与含油量显著正相关。通过对不同品种的GmSWEET39基因进行启动子及CDS测序，该基因具有3种启动子序列和两种编码(CDS)序列。对不同启动子或CDS类型的品种进行含油量比较，发现Pro3和CDS2为控制大豆籽粒油脂含量的优异变异。将GmSWEET39优异变异序列***到过量表达载体中并进一步遗传转化产生过量表达的拟南芥和大豆发根，可显著提高转化植株的含油量。同时，对大豆重组自交系群体中具有不同启动子或CDS类型的后代家系进行含油量比较，证实Pro3和CDS2为GmSWEET39的优异变异，该基因的优异变异类型将作为大豆育种计划中油脂含量遗传改良的宝贵基因资源。

附图说明

图1GmSWEET39基因在高油品种和低油品种不同时期籽粒中的相对表达量分析；其中，DAF：days after flowering，开花后的天数。

图2 80份大豆品种油脂含量及GmSWEET39基因在不同品种大豆籽粒中的表达水平；其中，趋势线利用局部加权散点平滑方法拟合绘制。

图3GmSWEET39基因启动子及CDS序列在80份大豆品种中的变异情况。

图4比较含有GmSWEET39基因不同启动子类型及不同CDS类型的大豆品种间籽粒油脂含量。

图5CDS1型、CDS2型及公知公用的Williams 82参考基因组GmSWEET39基因翻译后的氨基酸序列比较。

图6转基因拟南芥检验GmSWEET39基因等位效应：过量表达不同CDS型GmSWEET39基因对拟南芥种子脂肪酸含量的影响。

图7转基因大豆发根检验GmSWEET39基因等位效应。

图8大豆重组自交系群体检验GmSWEET39基因等位效应

A图：155个后代家系油脂含量频数分布；其中，ZYD2612和NN92-128分别指示两亲本油脂含量；B图：比较含有GmSWEET39基因不同启动子类型及不同CDS类型的后代家系籽粒油脂含量。

具体实施方式

实施例1 GmSWEET39基因在极端油脂含量的大豆材料不同时期籽粒中的表达分析

晋豆20是来自山西的含有24％种子油含量的大豆育成品种，马料豆是来自江西的含有17.5％种子油含量的大豆地方品种，二者油脂含量差异较大。为比较GmSWEET39基因在两品种籽粒中的表达水平，田间收集开花后10天、20天、30天和40天时期的籽粒提取RNA，并通过实时荧光定量检测基因的表达量。具体流程如下：晋豆20和马料豆两个品种夏季以2米行长播种在实验田中，在盛花期期间每天上午5：00-7：00用不同颜色的线对大豆当天盛开的花挂花，并进行记录以标记不同颜色的线对应大豆的开花时间。在第一次挂花结束后的第10天开始收集大豆幼胚以供表达量测定。根据DAF(Days after flowering，开花后天数)设定采样时间，取样时期为10DAF-40DAF，取样时间点间隔10天。所取样品立即放于液氮中，并存储于-80℃超低温冰箱以长时间保存，待所有样品采集完成后进行RNA提取。

各品种不同时期籽粒样品参照植物总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整度，随后用反转录试剂盒对符合质量要求的RNA合成cDNA，并利用NanoDrop-2000分光光度计检测cDNA样品的浓度。将所有cDNA样品稀释至相同浓度后用作荧光定量(qRT-PCR)的模板。各籽粒样品中GmSWEET39的相对表达量采用罗氏荧光定量PCR仪进行测定，每个反应20μl体系，具体反应条件如下：95℃预变性30s；59℃退火30s；72℃延伸45s，40个循环后检测每个样品的Ct值，采用2^-ΔΔCt方法计算各样品中GmSWEET39的相对表达水平。以该基因在马粒豆开花后10天的籽粒中的表达量作为对照(相对表达量值为1)，结果发现该基因在开花后30天的籽粒中表达量最高，而且在高油品种晋豆20中的表达量显著高于低油品种马料豆(图1)。基于该基因在极端油脂含量的大豆品种中的表达分析，初步判断GmSWEET39与籽粒油脂含量密切相关。

实施例2 GmSWEET39基因在不同大豆品种籽粒中的表达量与含油量相关性

从南京农业大学大豆种质资源库中随机选取来自中国不同生态区的80份大豆品种进行油脂含量及GmSWEET39基因表达量测定。首先利用傅里叶变换近红外光谱仪测得不同大豆种子总油脂含量(油分占种子干重的百分比)。收获各品种成熟后的种子并充分烘干，每个品种随机称取50g种子分别磨粉，将豆粉放于样品池中，采集不同样品的吸收光谱，测定总油脂含量。基于实施例1中该基因在开花后30天的籽粒中表达水平最高(图1)，然后取80份大豆品种开花后30天的籽粒提取RNA进行测定GmSWEET39的表达量。以低油品种豌豆早(含油量17.21％)中GmSWEET39的表达水平作为对照，80份大豆品种中该基因表达量呈现较大变异，进一步分析不同品种中GmSWEET39的相对表达量与籽粒油脂含量的相关性，并结合局部加权回归方法分析，结果发现二者呈显著正相关(r＝0.63，P＝4.35e-10)(图2)。

实施例3该GmSWEET39基因在栽培豆中序列变异及优异等位变异分析

选取来自中国不同生态区的80份大豆品种，以各品种的DNA为模板，使用引物对GmSWEET39-Seq-Pro-F(AAAGGAATACGGCGTGGTCT，SEQ ID NO.6)和GmSWEET39-Seq-Pro-R(GAAGCAAAGAAACAAGAAGATGAGC，SEQ ID NO.7)进行PCR扩增，获得GmSWEET39 1.5kb长度启动子片段；以各品种的cDNA为模板，使用引物对GmSWEET39-Seq-CDS-F(GTTGCTCATCACATCCCCCA，SEQ ID NO.8)和GmSWEET39-Seq-CDS-R(GGCGGCCGTAAGCAATTAAA，SEQ ID NO.9)进行PCR扩增，获得GmSWEET39基因CDS片段。对不同品种的GmSWEET39基因启动子及CDS进行测序分析，用ClustalX和MEGA 5.0软件对不同材料的序列进行比对分析，以检测不同材料间的变异位点及GmSWEET39的序列多态性(图3)。结果发现启动子区域具有7个SNP变异位点和2个InDel变异位点，这9个变异位点将GmSWEET39启动子分为3种不同启动子单倍型(Pro1-Pro3)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2和SEQ ID.NO.3；CDS区域具有3个SNP变异位点和1个InDel变异位点，这4个变异位点将GmSWEET39的CDS分为2种不同CDS单倍型(CDS1-CDS2)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

进一步比较含有不同启动子单倍型的种质间油脂含量,发现包含Pro1-Pro3单倍型的种质平均油脂含量分别为17.97％、18.8％和21.33％，包含Pro3单倍型的种质平均油脂含量显著高于Pro1及Pro2单倍型的种质平均油脂含量(P＝9.17e-3和P＝7.0e-8)；对含有不同CDS单倍型(CDS-type)的种质间油脂含量进行比较，结果发现包含CDS1和CDS2单倍型的种质平均油脂含量分别为19.18％和21.06％，而且含有CDS2单倍型的种质平均油脂含量显著高于CDS1单倍型的种质平均油脂含量(P＝5.99e-5)(图4)。不同CDS单倍型种质油脂含量差异可能与GmSWEET39的第6个外显子存在2bp长度的InDel变异相关。与CDS2型序列相比，该变异导致CDS1型编码序列延长，转录的氨基酸由249个增至268个(图5)。以上结果说明GmSWEET39的Pro3及CDS2等位变异类型是控制大豆籽粒油脂含量的优异类型。

实施例4 GmSWEET39基因控制籽粒油脂含量的优异变异在拟南芥及大豆发根中的应用

以马料豆品种的cDNA为模板，使用引物对GmSWEET39-35S-CDS1/2-F(AGGCGCGCCATGCCCACTCACCATGCTT，SEQ ID NO.10)和GmSWEET39-35S-CDS1-R(CCTTAATTAAATCCTTGGCATCCTTCTCTTGA，SEQ ID NO.11)进行PCR扩增，获得GmSWEET39的CDS1型片段；同时以晋豆20品种的cDNA为模板，使用引物对GmSWEET39-35S-CDS1/2-F(AGGCGCGCCATGCCCACTCACCATGCTT，SEQ ID NO.10)和GmSWEET39-35S-CDS2-R(CCTTAATTAATCATCCACTTCCTCTGCGATT，SEQ ID NO.12)进行PCR扩增，获得GmSWEET39的CDS2型片段。用限制性内切酶Asc I和Pac I对扩增产物进行双酶切，将酶切产物***到AscI和Pac I双酶切后的载体pCAMBIA3301中，将GmSWEET39^CDS1或GmSWEET39^CDS2置于花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S后面的多克隆位点处。在拟南芥中分别过量表达两种不同CDS单倍型(GmSWEET39^CDS1和GmSWEET39^CDS2)，同时转化pCAMBIA3301空载体作为对照。气相色谱方法测定GmSWEET39过量表达株系及空载对照株系中的脂肪酸含量，结果发现相对于空载对照，过量表达GmSWEET39^CDS2的株系能够显著提高拟南芥成熟籽粒中的脂肪酸含量，其中OE-2株系提高37％、OE-14株系提高24％、OE-19株系提高33％；然而过量表达GmSWEET39^CDS1的拟南芥成熟籽粒中脂肪酸含量与空载对照无显著差异(图6)。以上结果表明GmSWEET39^CDS2是控制油脂性状的CDS优异类型。

转基因大豆发根是一种在大豆植株中快速检测候选基因功能的方法，利用带有绿色荧光蛋白报告基因GFP的载体pBinGFP4进行大豆发根转化，能够在荧光显微镜下快速鉴定阳性根，方便于阳性根的后期功能研究。以晋豆20品种的cDNA为模板，使用引物对GmSWEET39-CDS2-F1(TTGGCGCGCCAAATGCCCACTCACCATGCTTCC，SEQ ID NO.13)和GmSWEET39-CDS2-R1(TCCGTCGACCCCGGGGGTACCTCCACTTCCTCTGCGATTGAAGA，SEQ ID NO.14)进行PCR扩增，获得GmSWEET39的CDS2型片段。同时以晋豆20品种的DNA为模板，使用引物对GmSWEET39-Pro3-F(GTTAATTAAGAATTCGAGCTCTGTTCTTTAATTAAGCGTCAAG，SEQ ID NO.15)和GmSWEET39-Pro3-R(TTGGCGCGCCAAGATGGATCCTCTGAAGCTATTAGG，SEQ ID NO.16)进行PCR扩增，获得GmSWEET39的Pro3型启动子片段。用限制性内切酶Asc I和Kpn I对CDS2片段进行双酶切，同时用限制性内切酶Sac I和Asc I对Pro3片段进行双酶切，将酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接获得GmSWEET39^Pro3-GmSWEET39^CDS2片段，然后将该片段***到Sac I和Kpn I双酶切后的载体pBinGFP4中，去除原载体35S序列，获得GmSWEET39^Pro3:GmSWEET39^CDS2过表达质粒。为获得35S启动型重组质粒，以晋豆20品种的cDNA为模板，使用引物对GmSWEET39-CDS2-F2(CGGGGTACCATGCCCACTCACCATGCTTC，SEQ ID NO.17)和GmSWEET39-CDS2-R2(CGCGGATCCTCCACTTCCTCTGCGATTGAA，SEQ ID NO.18)进行PCR扩增，获得GmSWEET39的CDS2型片段。用限制性内切酶Kpn I和Bam HI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物***到Kpn I和Bam HI双酶切后的载体pBinGFP4中，将GmSWEET39^CDS2置于35S启动子后面的多克隆位点处。在大豆发根中分别以35S及GmSWEET39^Pro3作为重组质粒的启动子过量表达GmSWEET39^CDS2，荧光显微镜下收集过量表达的发根并用气相色谱方法测定发根中脂肪酸含量，显示空载对照发根中总脂肪酸占其鲜重的0.114％；过量表达35S:GmSWEET39^CDS2的发根中总脂肪酸占其鲜重的0.141％；过量表达GmSWEET39^Pro3:GmSWEET39^CDS2的发根中总脂肪酸占其鲜重的0.137％。对不同类型发根脂肪酸含量进行显著性差异分析，发现过量表达35S:GmSWEET39^CDS2和GmSWEET39^Pro3:GmSWEET39^CDS2与空载对照间差异显著(图7)。以上结果表明GmSWEET39^CDS2及GmSWEET39^Pro3是控制脂肪酸合成的优异变异类型。

实施例5 GmSWEET39基因控制籽粒油脂含量的优异变异在大豆重组自交系群体中的应用栽培大豆南农92-128(NN92-128)为黄色种皮、种子油脂含量为21.35％、含有SWEET39基因Pro3及CDS2单倍型；野生大豆ZYD2612为黑色种皮、种子油脂含量为15.66％、含有SWEET39基因Pro1及CDS1单倍型。选取以NN92-128为母本、ZYD2612为父本构建的重组自交系群体，进一步分析纯合后代家系的油脂含量及GmSWEET39基因的单倍型分布特点。该群体155个后代株系的油脂含量呈近似正态分布，变异范围为13.94％-24.07％(图8A)。

分别通过特异引物(SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.9)扩增不同株系SWEET39基因的启动子及CDS序列，经测序分析发现该群体后代家系中SWEET39基因包含两种不同启动子单倍型(Pro1和Pro3)和两种不同CDS单倍型(CDS1和CDS2)。对群体中含有不同启动子类型株系进行油脂含量比较，发现具有Pro3类型的株系平均油脂含量(19.52％)显著高于具有Pro1类型的株系平均油脂含量(18.36％)(P＝1.71e-3)；对群体中含有不同CDS类型株系进行油脂含量比较，发现具有CDS2类型的株系平均油脂含量(19.5％)显著高于具有CDS1类型的株系平均油脂含量(18.15％)(P＝8.06e-4)(图8B)。RIL群体中不同启动子单倍型及不同CDS单倍型的油脂含量变化趋势与自然群体中相一致，也与转基因拟南芥及转基因大豆发根的结果相一致，说明Pro3和CDS2可以被作为控制籽粒油脂含量的优异变异类型。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆糖转运体基因GmSWEET39的应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1534

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

aaaggaatac ggcgtggtct ggctttggac tccagcaata aacgaattac agcaggaggt 60

ggcggtacat aaagaagaac aaattcaaat aataacaaat attgttgatg gtgtatctta 120

tcttgtcgta ctcctactcc tacctattgc ataactagaa gaaatggaaa aaacgagatg 180

cctttgacgc acgaaaaacc ttcaatttgc acacaaaaaa tcaactagct cacactatga 240

gacaaacgag taacagaacg gcatagaaag tgtgtcacat tcacaccaag acgcaccatc 300

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taagatatat ataataaaaa taattcaaaa catcaaatat tttattttta tgtcattata 540

taattaatga taatatattt acacatctta actcaaatag gtaataaaat ttttttctaa 600

ctaaatgtat ttttgataaa taaggataaa ttatatgata attttacaaa catatatata 660

ggaaataaaa ataaaatata agtatattat aaatttatga ataaaaatat atgcatgtgt 720

ataaatttta tttgaattag attgaattga ttttgaaatt caaatccaaa atccagtcta 780

ataaaattta atttttcaat tttttgatcc gtttaatttt caatttattt gattattaat 840

ttttgggatc gactttatta agccacgtta gattggataa acaaccctgc ttccgagggg 900

atgtttgcaa gggtcacgtg aatcgatccc tacccctacc tctaacacat tccccgtatc 960

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aaaatgaaaa gtttctatgt acttaaaaat aattggtaca attttttaaa aaattagaca 1140

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

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ggcggtacat aaagaagaac aaattcaaat aataacaaat attgttgatg gtgtatctta 120

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<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

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