马齿苋中一种芳基类化合物的提取分离方法及其应用
阅读说明：本技术 马齿苋中一种芳基类化合物的提取分离方法及其应用 (Extraction and separation method of aryl compound in purslane and application thereof ) 是由 英锡相 郭胜男 何凡 于 2021-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及中药提取、分离领域,尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的一种新化合物及其提取分离方法。所述的新化合物,分子式为C-(44)H-(42)O,并且根据结构命名为((1S,1’S,1’’S,1’’’S)-(oxybis(benzene-2,1,3-triyl))tetrakis(ethane-1,1-diyl))tetrabenzene。还提供上述新化合物的提取分离方法,依次采用40%-60%乙醇回流提取、硅胶柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH-20纯化以及HPLC分离制备。其结构采用紫外、红外、质谱、氢谱、碳谱及二维核磁波谱解析的方法确定为一种新化合物。该化合物具有抗炎、抗肿瘤作用,本发明新化合物及其盐或衍生物可以作为其他化合物合成先导物,以及新药开发和药理活性研究的原料,用于制备抗炎、抗肿瘤的药物或保健品。(The invention relates to the field of extraction and separation of traditional Chinese medicines, in particular to a novel compound extracted, separated and identified from purslane and an extraction and separation method thereof. The novel compound has a molecular formula of C 44 H 42 O and is named according to the structure ((1) S ,1' S ,1'' S ,1''' S )‑(oxybis(benzene‑2,1,3‑triyl)) tetrakis (ethane-1,1-diyl)) tetrabezene. Also provides an extraction and separation method of the new compound, which sequentially adopts 40-60% ethanol reflux extraction, silica gel column chromatography, ODS medium-pressure column, Sephadex LH-20 purification and HPLC separation preparation. The structure of the compound is determined to be a new compound by adopting a method of ultraviolet, infrared, mass spectrum, hydrogen spectrum, carbon spectrum and two-dimensional nuclear magnetic spectrum analysis. The compound has anti-inflammatory and anti-tumor effects, and the novel compound and the salt or the derivative thereof can be used as a lead for synthesizing other compounds, and raw materials for developing new drugs and researching pharmacological activity, and are used for preparing anti-inflammatory and anti-tumor drugs or health care products.)
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的一种新化合物及其提取分离方法。
背景技术
马齿苋（Portulaca oleracea L.），又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科植物。马齿苋性喜肥沃土壤，耐旱亦耐涝，生命力强，分布广泛，资源丰富。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。
现代药理学研究表明，马齿苋具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：生物碱类、黄酮类、萜类、香豆素类、有机酸类、挥发油、多糖、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。
目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的一种新化合物，经研究发现本发明的新化合物具有抗炎、抗肿瘤的作用，同时提供一种针对本发明化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种从马齿苋药材中分离出的芳基化合物，其特征在于，所述化合物的分子式为C44H42O，命名为((1S,1'S,1''S,1'''S)-(oxybis(benzene-2,1,3-triyl))tetrakis(ethane-1,1-diyl))tetrabenzene，化学结构式为：
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本发明还提供了一种从马齿苋药材中分离出的芳基化合物的提取分离方法，其特征在于，所述提取分离方法的具体步骤包括：
步骤1：取马齿苋干燥药材，采用50%乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2：将步骤1中浓缩液上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3：将步骤2中所得物再经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤4：将步骤3中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20，以甲醇洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤5：对步骤4中所得浓缩物进行HPLC分离制备，以乙腈-0.1%甲酸作为流动相进行等度洗脱，制备得到一种新的化合物。
进一步地，所述步骤1中50%乙醇回流提取，50%乙醇用量为药材的8倍～16倍。
进一步地，所述步骤2中所用乙酸乙酯流动相洗脱程序为等度洗脱；硅胶目数100目～200目。
进一步地，所述步骤3和步骤4中ODS和Sephadex LH-20的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
进一步地，所述步骤3中所用甲醇和水的体积比为60∶40、70∶30、80∶20和90∶10；填料粒度为20µm～40µm。
进一步地，所述步骤4中所用甲醇洗脱程序为等度洗脱。
进一步地，所述步骤5中所用乙腈-0.1%甲酸体积比为75∶25，该化合物保留时间为12.77min。
本发明还提供了一种如上所述方法制备从马齿苋药材中分离出的芳基化合物的用途，其特征在于，所述用途可用于制备抗炎、抗肿瘤的药物或保健品。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明中所述马齿苋化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于马齿苋的一种新化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用50%乙醇回流提取、硅胶柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH-20及HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出一种新化合物，该方法操作步骤仅为五步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用水提取及乙酸乙酯洗脱，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，均大于98%，此外经研究表明此化合物具有抗炎、抗肿瘤作用，因此本发明化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎、抗肿瘤的药物。
附图说明
图1为本发明化合物的紫外光谱图。
图2为本发明化合物的红外光谱图。
图3为本发明化合物的高分辨质谱图。
图4为本发明化合物的1H-NMR光谱图。
图5为本发明化合物的13C-NMR光谱图。
图6为本发明化合物的HMBC光谱图。
图7为本发明化合物的HSQC光谱图。
图8为本发明化合物的1H-1H COSY光谱图。
图9为本发明化合物的ROESY光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。
实施例1。
本发明提供一种化合物，分子式分别为C44H42O，命名为((1S,1'S,1''S,1'''S)-(oxybis(benzene-2,1,3-triyl))tetrakis(ethane-1,1-diyl))tetrabenzene，化学结构式为：
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所述化合物根据结构命名为((1S,1'S,1''S,1'''S)-(oxybis(benzene-2,1,3-triyl))tetrakis(ethane-1,1-diyl))tetrabenzene，表1为该化合物的1H-NMR与13C-NMR（DMSO-d 6）的数据。
表1：本发明化合物的核磁数据
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实施例2本发明一种新化合物的结构鉴定与推导。
淡黄色油状物，易溶于甲醇，不溶、微溶于水。UV（MeOH）λmax：210nm、245nm、275nm，IR（KBr）νmax：3041cm-1、2861cm-1、1641cm-1、1612cm-1、1565cm-1和1230cm-1。HR-ESI(+)TOF-MS给出m/z：587.3302[M+H]+的准分子离子峰，分子量为586.3236。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C44H42O，不饱和度为24。在1H-NMR和13C-NMR中可以看出，一些信号在1H-NMR和13C-NMR中都是加倍的。在结构测定时，先将每个双峰视为一个信号。通过这种方式最终解释了关于双倍信号的起源。
根据1H-NMR，该化合物的四个烯氢信号为δH6.74（1H，t，J=7.62）；δH6.79 （1H，t，J=7.62）；δH6.88（2H，d，J=7.62）；δH6.98（2H，d，J=7.62），结合1H-1H COSY谱的H-5（δH6.74）分别与H-4和H-6相关，说明化合物中存在1,2,3-三取代苯环。HMBC光谱显示了H-5与C-1，C-3相关，H-6与C-2，C-1'相关，H-4与C-2，C-1''相关，H-1'与C-6，C-2相关以及H-1'''与C-4和C-2相关，表明C-1和C-3分别与C-1'和C-1'''相连。1H-1H COSY显示从H-1'与H-2'相关，H-1'''与H-2'''相关，以及HMBC显示H-2'与C-1''相关和H-1'与C-2，C-6，C-2''，C-6''相关；H-2'''与C-1''''相关和H-1'''与C-2，C-4，C-2'''，C-6'''相关，确认有两个乙苯分别位于C-1和C-3。并且根据从H-3″与C-5″、C-1″的HMBC相关；H-5''与C-3''，C-1''；H-4''与C-2''，C-6''；H-2''与C-1'，C-4''；H-6''与C-1'，C-4''分别相关，进一步证实在C-1'上有一个单取代的苯环，C-1'''也是如此。基于C-2的化学位移（δ150.90）来连接氧原子是合理的。因为有些信号在1H-NMR和13C-NMR中都是加倍的，可以假设C-2通过氧连接到相同的结构上。并且在质谱图中找到了该结构的分子离子峰。根据以上信息，可确定此新化合物为上述结构。
本发明还提供上述新化合物的提取分离方法，具体步骤为：
步骤1：称取马齿苋干燥药材250kg，采用50%乙醇回流提取，50%乙醇用量为药材的10倍，煎煮提取两次，每次煎煮2h，水提液滤过，合并滤液，加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯（115L）等度洗脱，其中硅胶为100目～200目，室温以上，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3：将步骤2中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20μm～40μm，用甲醇-水（60∶40、70∶30、80∶20和90∶10，v/v）梯度洗脱（加压，使流速为1mL/min，温度为室温），得到16个部位（即梯度洗脱得16个瓶，每瓶100mL），经薄层色谱进行检测，显色，将70%和80%部位，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；
步骤4：将步骤3中所得部位经预处理的Sephadex LH-20柱层析，以甲醇等度洗脱，得到26个部位（即梯度洗脱得26个瓶，每瓶50mL），经薄层色谱进行检测，显色，将13和14部位，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述Sephadex LH-20的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；
步骤5：将步骤4中所得显色部位经HPLC分离制备，以乙腈和0.1%甲酸体积比为75∶25作为流动相，检测波长为210nm和280nm，分离制备得到本发明一种新化合物，归一法测定纯度均大于98%。
实施例3本发明新化合物的抗炎作用。
1主要材料。
1.1药品和试剂：实验所用新化合物由上述方法制备，纯度为98%以上，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青公司）；LPS（美国Sigma公司）；IL-6、TNF-α、PGE2的ELISA试剂盒（美国Cayman公司）；细胞裂解液、Griess试剂（碧云天生物技术有限公司）。
1.2 细胞株：RAW264.7巨噬细胞（美国ATCC细胞库）。
1.3 分组：分为对照组、LPS组和实验组，各一组。
2 实验方法。
2.1 细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0%的胎牛血清，l%抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37.5℃，CO2培养箱中培养。
2.2 MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明新化合物（1μM～50μM），孵育1h后向LPS组和实验组分别加入终浓度为1μg/mL的LPS，另设调零组（含DMSO溶媒的培养液），每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，温度37℃，5%CO2条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔吸光值。
2.3 ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE2：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/mL，每孔1mL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜，实验组加入本发明新化合物（1μM～20μM），培育1h后，在每孔加入LPS（终浓度为1μg/mL），共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定马齿苋来源新化合物处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2的含量。
3 实验结果。
实验结果表明本发明含过氧键新化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-6、TNF-α和炎症介质NO、PGE2，且呈浓度依赖。
细胞相对存活率实验结果如表2所示。
表2：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响
注：*P<0.05与对照组比较（高浓度组有显著性差异）。
ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE2结果如表4所示。
表3：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2含量的影响
注：平均数±标准差，n=3，*P<0.05与对照组比较，#P<0.05与LPS组比较。
实施例4本发明新化合物的抗肿瘤作用
1 主要材料。
1.1 药品和试剂：实验所用新化合物由上述方法制备，纯度大于98%，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青公司）。
1.2 细胞株：人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB（中科院上海细胞库）。
1.3 分组：分为对照组、实验组和调零组(含DMSO溶媒的培养液)。
2 实验方法。
2.1 细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0%的胎牛血清，l%抗菌素（100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素），置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2.2 MTI法检测细胞增殖，取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明新化合物，每组设3个复孔，加药后置于37℃，5%CO2培养箱中培养48h。将含药培养液吸去，加入体积比为4∶1的无血清培养液和MTT（终质量浓度为5mg/mL)共100mL，继续孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入150μL的DMSO，放于震荡器上震荡以使结晶完全溶解（5min），酶标仪在570nm波长下检测各孔的吸光度（A）值。然后，计算各浓度化合物对细胞生长的抑制率,抑制率公式：细胞生长抑制率=(1－A加药孔／A对照孔)×100％，再应用SPSS软件处理数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC50值。
3 实验结果。
实验结果表明本发明新化合物对人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB、的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增大，抑制率也明显升高，即呈浓度依赖。本发明新化合物对上述八种肿瘤细胞IC50值见表5。
表4：本发明对各细胞株作用后的影响
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综上所述，本发明提供特殊化合物及其提取分离方法，依次采用50%乙醇回流提取、硅胶柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH-20柱层析以及HPLC分离纯化，成功的分离得到一种新化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗肿瘤及抗炎作用，因此本发明特殊化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。