阅读说明：本技术 一种同时定位两个性状相关基因的方法 (Method for simultaneously positioning two character related genes ) 是由 张晓军 于晓娜 王月福 张绍静 郭蕊 颜凡壮 赵瑞华 宋丹蕾 李季华 李瑶瑶 司 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子遗传学和分子育种技术领域,公开了一种利用重组表型分组分析同时定位两个性状相关基因位点的方法,基于基因组重测序或转录组测序的重组表型个体组的分析同时定位两个独立性状相关基因位点,具体为：利用两个性状有差异的亲本构建分离群体,在群体内选择两个性状的表型为不同亲本型的重组表型个体,将其分为两类：一类为性状A为母本型&性状B为父本型,另一类为性状A父本型&性状B父本型,通过对双亲和这两类个体组的混池或个体的基因组的重测序或转录组测序,计算个体组中双亲不同的SNP所对应的确定亲本型的SNP频率的差值,实现同时定位两个性状相关的基因位点。(The invention belongs to the technical field of molecular genetics and molecular breeding, and discloses a method for simultaneously positioning two character related gene loci by utilizing recombinant phenotype grouping analysis, wherein the analysis of a recombinant phenotype individual group based on genome resequencing or transcriptome sequencing simultaneously positions two independent character related gene loci, and specifically comprises the following steps: two parents with different characters are utilized to construct a segregation population, and recombinant phenotype individuals with two characters and phenotypes of different parental types are selected from the population and are divided into two types: one is that the character A is a female parent type and the character B is a male parent type, the other is that the character A is a male parent type and the character B is a male parent type, the difference value of the SNP frequency of the determined parent type corresponding to the different SNPs of the parents in the individual groups is calculated by the mixed pool of the parents and the two types of individual groups or the resequencing or transcriptome sequencing of the individual groups, and the gene loci related to the two characters are positioned at the same time.)

一种同时定位两个性状相关基因的方法

技术领域：

本发明属于分子遗传学和分子育种技术领域，涉及一种同时定位两个性状相关基因位点的方法，基于基因组重测序或转录组测序技术，利用单次两个表型重组个体分组分析同时定位两个独立性状相关基因，提高了定位效率。

背景技术：

集团分离分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)又称分离个体分组混合分析法或混合分组分析法，首次由R.W.Michelmore等(PNAS.1991.88(21):9828)提出并成功地在莴苣中筛选出与抗病基因相连锁的标记。该方法首先从一对具有目标性状表型差异的亲本所产生的任何一种分离群体中，根据目标性状的表型分别选取一定数量的植株，构成两个极端性状的亚群或集团。将每群的个体DNA等量混合，形成两个相对性状的“基因池”(Gene Pool)，然后用亲本间存在多态的共显性分子标记对两个基因池进行分析，在两群间表现多态性的分子标记遗传上与目标性状基因座位相连锁。在获得了与目标基因相连锁的分子标记以后，可以利用某一作图群体进行分析以便进一步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位置，这样完成对目的基因的标记定位。与BSA相结合用于基因定位的分子标记有多种，常用的分子标记有限制性片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，随机扩增多态性标记(Random Amplified Polymorphism，RAPD)，扩增片段长度多态性标记(AmplifiedFragment Length Polymorphism，AFLP)，简单重复序列标记(Simple Sequence Repeats，SSR，又称微卫星标记)等。随着基因组测序和转录组测序技术的进步和成本的降低，利用测序技术结合参考基因组开发单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)更加增强了BSA技术的应用。具体是将两个亲本和由其杂交产生的分离群体中选出的两个相对性状的均匀混合的DNA混池分别进行基因组测序，亲本测序获得的短片段与参考基因组进行比较，获得亲本与参考基因组间的多态性SNP，之后通过分析两个极端性状池中由亲本发现的多态SNP的等位基因频率，差异程度(ΔSNP_index)锁定目标性状基因所在的位置，此种方法通常被称为极端性状混池重测序的基因定位法，简称BSA-seq或QTL-seq(Takagi,Abe et al.2013,Plant Jounal 74(1):174-183)。

BSA或BSA-seq法构建极端性状个体混池时选用来自双亲杂交构建的分离群体，在分组时仅对单一目标性状的两侧极端性状进行选择，这样可以保证其他性状的遗传背景理论上没有受到选择，两个基因池之间理论上主要在目标基因区段存在差异，因此两基因池又被称为近等基因池，这就排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠。BSA法克服了很多作物难以得到近等基因系的限制，并且比近等基因系法省时省力，是一种非常实用的定位目标性状相关基因的方法，应用非常广泛；此方法好处很多，但存在一个局限，即：单次的两个混池分析只针对一个目标性状进行相关位点的定位，而全群体遗传连锁定位，在遗传图谱构建的基础上可以同时对多个性状进行定位分析，但构建全群体遗传图谱需要分析大量分离群体的分子标记数据，工作量较大；现急需一种可以在较少的工作量的基础上，同时实现对两个性状的遗传定位的方法。

发明内容

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本发明的目的是为了解决现有技术存在的缺陷，提供一种基于分离群体极端性状个体分群分析的新的实验设计方法，实现基于基因组重测序或转录组重测序的单次两个重组表型个体池的分析同时定位两个独立性状的目标位点。

为了实现上述目的，本发明涉及一种同时定位两个目标性状相关基因的方法，基于常规基因组重测序或转录组测序技术，对来自双亲杂交后自交形成分离群体中重组表型个体分组测序分析，同时定位两个独立性状相关基因，具体步骤包括：

(1)亲本的选择与杂交：选择两个亲缘关系较远，遗传多态性较大的两个纯合品种或品系材料作为亲本，双亲间差异性状越多越好，构建杂交组合；

(2)分离群体的构建和选择：双亲杂交后，再自交、强制自交或回交后自交形成分离群体；

(3)重组表型个体的选择与分组：同时关注两个独立目标性状，分离群体中选取两个性状表型值以接近父母本的为极端表型个体，将分离群体中的极端表型个体根据两个性状的表型可以分为：两性状的表型均与某一亲本一致的亲本表型个体和两性状的表型为不同亲本型的重组表型个体；其中两个性状的表型为不同亲本型的重组表型个体又可以分为两类：一类为性状A为母本型&性状B为父本型，即AmBf组；另一类为性状A为父本型&性状B为母本型，即AfBm组；将AmBf组和AfBm组作为极端性状个体的两个重组表型个体组混池；

(4)SNP和InDel突变位点的获取：对双亲及两个重组表型个体组混池分别进行基因组重测序或转录组测序，或个体分别进行基因组重测序或转录组测序，利用双亲和混池测序获得的clean reads与参考基因组分别进行比对，获取与参考基因组的单核苷酸多态性位点(简称SNP)和***缺失突变位点(简称InDel)变异；将分析到的所有双亲与参考基因组不同的SNP抽出，挑选在两个亲本中纯合，但在两个亲本间基因型不同的SNP用于后续的SNP_Index计算；

(5)重组表型组混池SNP_index及混池间ΔSNP_index的计算，进行性状相关位点的定位：通过与参考基因组的比对，选用在亲本中纯合，但双亲间基因型不同的SNP用于计算SNP标记的基因型频率即：SNP_index，此时的SNP有两种基因型：母本型SNP^M和父本型SNP^F；确定选用某一亲本的SNP基因型，计算两个混池中每一个SNP确定亲本型的SNP的基因型频率，具体为采用所含确定亲本型的SNP的reads数目占所有测到的reads中的比例，即SNP^M_index或SNP^F_index；然后计算两个混池间每个SNP对应的SNP^M/F_index的差值，即ΔSNP^M/F_index；为了消除假阳性的位点，利用标记在基因组上的位置，可对同一条染色体上标记的ΔSNP_index值进行滑动窗口的拟合，然后采用滑动窗口的均值进行绘图，通常采用200kb为区间取区间内ΔSNP^M/F_index的平均值进行曲线绘制，并进行1000次置换检验，选取95％置信水平作为筛选的阈值，ΔSNP^M/F_index的滑动窗口均值线超过正阈值或低于负阈值外的区域为潜在基因的候选区域；在一次分析中需要明确SNP的基因型并保持统一，但选择母本型或是父本型不做限定，也可以两种型分别计算后进行结果验证；在明确SNP的基因型的情况下，两个性状对应的位点会表现为正值峰和负值峰的区别，方向与性状的对应取决于个体组做差的方向与SNP基因型的确定。

本发明涉及的步骤(1)选择亲本时，在标记分析明确的情况下也能够选用杂合亲本，在这种情况下，分析亲本和后代的标记基因型不限于两种变异。

本发明涉及的步骤(2)中的分离群体选用分离世代中的任何一个世代，优选F₂群体、BCnF₂群体、重组自交系群体RIL和单倍体加倍系DH，其中BCnF₂群体由F1直接回交1-n次，或其他分离群体后代中挑选个体回交1-n次后自交形成。

本发明涉及的步骤(2)选用分离群体时，只要分离群体的遗传系谱或信息较为明确的后代分离群体均可以。

本发明涉及的步骤(5)中选用母本型SNP^M用于计算ΔSNP_index，进行性状相关位点的定位时，计算方法简述如下：

AmBf组SNP^M_index＝SNP^M reads的数目/(SNP^M reads的数目+SNP^F reads的数目)，

AfBm组SNP^M_index＝SNP^M reads的数目/(SNP^M reads的数目+SNP^F reads的数目)，

两个组的每个SNP的SNP^M_index做差即为：

△SNP^M_index＝AmBf组SNP^M_index–AfBm组SNP^M_index。

本发明涉及的步骤(5)中进行性状相关位点的定位，具体为：采用母本型SNP^M计算的ΔSNP^M_index，对于性状A而言，母本型性状池与性状相关的位点的母本型SNP^M较多，反之父本型性状池与性状相关的位点的母本型SNP^M较少，所以当进行做差的两个池为母本型性状减去父本型性状，与性状A相关的位点为正值峰；对于性状B，父本型性状池与性状相关的位点的母本型SNP^M较少，母本型性状池与性状相关的位点的母本型SNP^M较多，而做差的两个池为父本型性状减去母本型性状池，所以与性状B相关的位点为负值峰；同样道理，可以明确父本型SNP^F计算的ΔSNP^M_index位点方向与性状的关系遵循同样的原理。

本发明涉及的目标性状能够是质量性状也能够是存在主效位点的数量性状。

本发明涉及的分离群体重组表型分组分析同时定位两个目标性状相关基因的方法，最佳适用于利用纯系植物或动物亲本，能够构建双亲杂交后代分离群体的物种，优选纯合亲本，不排除在分子标记允许情况下的非纯合亲本的构建群体。

本发明涉及的SNP_index及混池间ΔSNP_index的计算中能够单独选用SNP标记，也能够同时使用SNP和InDel两种标记，InDel标记的标记频率的计算与步骤(5)相同。

与现有技术相比，本发明的有益效果：可以利用一次的两个混池的基因组重测序或转录组测序实现对两个不同性状的同时定位，与现有的常规BSA或BSR分析一次只能定位一个性状相关的基因位点相比，大大提高了定位效率，节约了研发投入成本。

附图说明：

图1为本发明涉及的花生匍匐/直立和交替开花/连续开花两个独立性状利用重组型个体组的ΔSNP^M_index数据进行性状相关基因的定位图；其中正值峰为匍匐/直立相关基因位点，负值峰为交替开花/连续开花性状相关基因位点。

具体实施方式

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下面通过实施例对本发明技术做进一步说明。

实施例1:花生匍匐/直立和交替开花/连续开花两个性状的同时定位

本实施例涉及利用重组表型分组分析法同时定位花生的两个重要的株型相关性状：匍匐/直立的生长习性性状(性状A)和交替开花/连续开花的亚种分类性状(性状B)，具体操作步骤如下：

(1)亲本的选择：选用的两个植物材料：母本为植株直立且连续开花的栽培花生品种平度9616(PD)和父本为植株匍匐且交替开花的栽培花生品种Florunner(Flo)；

(2)分离群体的构建：利用上述两个亲本进行有性杂交获得F1代，F1代自交获得F2代，F₂代进行单株种植并收获，将F2收获的种子分株系种植，株系内随机选单株收获并种植下一代株系，株系内再随机收获单株，之后经过连续5代，最终获得了一个由445个家系构成的重组自交系群体PF-F₆(PD9616×Florunner-F₆)；

(3)重组表型个体的选择与分组：在PF-F₆群体内挑选30个匍匐且连续开花的个体(性状A父本型&性状B母本型：AfBm组)和30个直立且交替开花的个体(性状A母本型&性状B父本型：AmBf组)；分别将它们作为极端性状个体的两个重组表型个体组(混池)；

(4)SNP和InDel等突变位点的获取：分别对双亲及分离群体中选定的60个个体进行转录组测序，获得了包含双亲和分离个体总计62个转录组数据；对每个个体的转录组测序获得的原始数据进行质量控制，具体包括：去除其中的接头序列及低质量的读带(Reads)，最终获得高质量的读带(Clean Reads)，其对应的数据为Clean Data；经过一系列的质量控制之后共得到高质量的Clean Data 247.43Gb，将测序获得的150bp长度的CleanReads与指定的参考基因组(栽培花生两个供体野生种基因组https://www.peanutbase.org/peanut_genome)进行序列比对，定位Clean Reads片段在参考基因组上的位置；只有比对到参考基因组的序列才能用于后续分析，将比对到参考基因的序列称为Mapped Reads；其中亲本平度9616上获得约6.50Gb的Clean Data，其中两端匹配的reads数目约2171万个，占所有Clean Data的50.21％，Clean Data中CG碱基占总碱基的45.90％；亲本Florunner上获得约6.61Gb的Clean Data，其中两端匹配的reads数目约2209万个，占所有Clean Data的50.14％，Clean Data中CG碱基占总碱基的45.44％；60个子代中CleanData均大于3.28Gb，各样品Q30碱基百分比均不小于91.16％；经过质量控制得到每个样品的的Clean Data与花生供体野生种参考基因组进行比对(比对软件STAR 2.3.0e，https://github.com/alexdo bin/STAR/releases)，并通过软件GATK3.1-1(https://www.broadinstitute.org/gatk/index.php)针对RNA-seq的SNP calling流程，查找单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)；然后挑选其中在两个亲本中纯合，而亲本间不一致的高质量的SNP进行后续分析；本实施例中，采用的个体转录组测序，所以此时进行一次对子代的SNP信息进行合并，将同一个分组的子代的同一个SNP所测得reads数目按照基因型进行并集；

(5)重组表型组SNP_index及组间ΔSNP_index的计算，进行性状相关位点的定位：

本实施例中，母本为植株直立且连续开花的栽培花生品种平度9616(PD)和父本为植株匍匐且交替开花的栽培花生品种Florunner(Flo)，针对匍匐/直立性状和交替开花/连续开花性状这两个性状而言，其构建的重组自交系中重组表型个体为：直立连续型和匍匐交替型。对两个重组表型组的混池的SNP_index进行计算时，我们对来自平度9616基因型的SNP的频率进行计算，ΔSNP_index的计算为：直立交替池减去匍匐连续池；进行做差后以200kb作为滑动窗口拟合出ΔSNP_index的曲线，选择置信度0.99的阈值以上的区域作为与性状相关的区域；由于我们计算的SNP_index是来自平度9616的基因型的频率，对于匍匐/直立性状而言混池做差是直立池减去匍匐池，所以正值峰为匍匐/直立性状相关的基因位点，同样道理对于交替开花/连续开花性状而言混池做差是交替开花减去连续开花，所以负值峰为交替开花/连续开花性状相关的位点；通过两个混池ΔSNP_index的分析，将匍匐/直立性状相关位点初定位在花生染色体B05末端，将交替开花/连续开花性状相关位点初定位在第B02号染色体末端(见图1)。

本实施例利用利用一次的两个混池的基因组重测序或转录组测序实现对花生的两个重要的株型相关性状的同时定位，与现有的常规BSA或BSR分析一次只能定位一个性状相关的基因位点相比，大大提高了定位效率，节约了研发投入成本。