一种稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物及其制备和应用方法
阅读说明：本技术 一种稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物及其制备和应用方法 (Stable isotope labeled nitroimidazole compound and preparation and application methods thereof ) 是由 阮英恒 周静洋 杨晓云 杨晓军 于 2021-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物及其制备和应用方法,其中所述硝基咪唑类化合物的化学结构通式为：本发明的有益效果是：以氘代硝基咪唑类化合物作为造影剂,该造影剂可用于肿瘤乏氧组织的显像。(The invention provides a stable isotope labeled nitroimidazole compound and preparation and application methods thereof, wherein the chemical structure general formula of the nitroimidazole compound is as follows: the invention has the beneficial effects that: the deuterated nitroimidazole compound is used as a contrast agent, and the contrast agent can be used for imaging tumor hypoxic tissues.)
技术领域
本发明涉及硝基咪唑类化合物应用领域，特别涉及一种稳定同位素标记 的硝基咪唑类化合物及其制备和应用方法。
背景技术
氢气及其同位素在医药行业中的使用越来越多，例如，磁共振分子成像 的研究已经产生了两种有希望的葡萄糖代谢成像同位素方法：超极化(HP) 13C磁共振成像(MRI)和氘代谢成像(DMI)。虽然13C超极化有多种可能的途 径，但HP 13C MRI最常依赖于13C标记底物的动态核极化预极化，然后快速 溶解，在临床可行的MRI场强下产生比Boltzmann极化高四到五个数量级的 大量信号增强，从而能够通过光谱成像进行目标代谢研究。然而，13C的磁化 寿命短，需要紧凑的研究和快速、仔细校准的MRI扫描。相反，非超极化的 DMI利用了玻耳兹曼极化提供的相对较大的磁矩。
正电子发射断层成像(PET)作为目前最先进的医学影像技术，可以实现 对细胞代谢和功能进行高分辨的显像，从分子水平上对人体的生理、生化过 程进行无创、三维、动态研究，PET应用于肿瘤包括肿瘤的诊断，良恶性鉴 别、恶性肿瘤分期、分型、复发、转移的早期诊断和鉴别，治疗方案的选择 和化学治疗效果的监测以及肿瘤变化过程的观察以及愈后情况的检测。PET 检查有别于其它检查，它依赖于正电子药物(PET药物)，依靠正电子药物 特异性浓集于靶器官达到诊断和评价的目的。当前PET检查中应用的正电子 药物包括氟代多巴胺，这类正电子类放射性核素，对于病人的多次检测容易 造成二次伤害，同时，相比于其它成像的标记核素如氧-15(O-15)、氮13(N-13)、 碳11(C-11)，其半衰期虽然有了明显的提高(109.8min),但是仍然无法作 为整个代谢过程的跟踪。
肿瘤乏氧是实体肿瘤发生发展过程中普遍存在的现象，乏氧是由于体内 微环境发生异常而导致可利用的氧减少或氧分压下降到临界值以下的状态， 从而限制甚至终止器官、组织和细胞的一系列生理功能。肿瘤细胞为适应乏 氧环境会发生一系列相应的生物学变化。乏氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一种氧依赖的转录激活因子，由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位 组成，HIF-1α仅在正常氧合状态下很快就被降解，但在乏氧状态其蛋白稳定 性会增加，并与HIF-1β形成异二聚体，是对机体器官、组织中氧分压改变后 发生的一系列自适应反应中的重要调节因子，它通过与乏氧反应元件结合， 可以调控一系列下游基因的转录和翻译，目前已确认有60余种的下游靶基因 受HIF-1α的直接调控，其中包括血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生长因 子(EPO)、糖酵解酶、碳酸酐酶(CA)、表皮生长因子(EGF)、P-糖蛋白等，它 们参与肿瘤的酸碱度调控、能量代谢、
血管生成和重塑、细胞增殖和凋亡、侵袭和转移、恶性表型等肿瘤多种 病理生理生化的改变，从而在肿瘤的演变过程中有着至关重要的作用，并对 放化疗抵抗，导致局部复发、远处转移等多种不良预后。由于在恶性肿瘤细 胞中特异性表达的特性，对于HIF-1α基因的研究也就备受关注。
乏氧存在于多种疾病状态中，了解组织的乏氧程度对临床具有一定的价 值。准确测定肿瘤内的乏氧状况不仅为肿瘤乏氧细胞的基础研究创造了条件， 也为临床判断肿瘤治疗的预后及实施改变肿瘤内乏氧细胞生长环境来提高疗 效提供可靠依据。目前，临床用于检测乏氧的有创检查方法主要为氧电极法。 氧电极被认为是直接检测肿瘤氧分压的“金标准”，通过对插入肿瘤内部的 300μm的电极进行测量计算而得出肿瘤内的氧分压。这种方法可以预测出肿 瘤的治疗反应及潜在的转移性，被一些机构用作为原发灶的常规检查。应用 氧电极法对宫颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、软组织肉瘤及头颈部肿 瘤进行直接测量已被用于证实肿瘤乏氧悼。但是氧电极法具有一定的局限性， 如目前尚无一个公认的判定乏氧临界值的标准；肿瘤内氧分布，需要多道多 点进行测量；氧电极本身技术的局限性，测量过程中存在一定误差；氧电极 法是一种有创性的检测方法。这些都限制了氧电极法的应用。
影像学检测方法因其无创、准确、可重复性高等优点已被用于临床中， 包括彩色多普勒超声检查、磁共振波谱成像及核医学成像。利用放射性核素 标记的乏氧组织显像剂进行正电子发射断层显像(PET)可以对乏氧进行定位 和定量的多次重复检测。常用的乏氧显像剂包括硝基咪唑类乏氧显像剂和非 硝基咪唑类乏氧显像剂。其中FMISO是临床中最早且最广泛用于研究的硝基 咪唑类乏氧显像剂，因其具有较高的稳定性及特异性，是目前乏氧检测研究 最常用的技术，能同时用于肿瘤的诊断和判断肿瘤的分期，并可以判断放化疗的效果，及时调整优化放化疗方案。非硝基咪唑类的显像剂尽管对乏氧组 织具有一定的敏感性，但其在肠道和肝脏有较高的摄取率，并不适用于腹部 肿瘤的检查。
FMISO是硝基咪唑类化合物，经被动扩散通过细胞膜进入细胞内，其配 体的亲脂性决定了其进入细胞的能力。配体硝基经细胞内相关酶的作用，被 还原而产生自由阴离子，在正常细胞中，它们被过氧化而扩散到细胞外，而 在乏氧细胞中，该中间体被进一步还原，产物与细胞内组分结合，从而滞留 在细胞中。FMISO只积聚在富有有功能性的硝基还原酶的乏氧细胞内，因而 将FMISO标记上发射正电子的氘形成示踪剂可用于乏氧组织的显像。
乏氧在肿瘤的病理机制中有着至关重要的作用，它直接关系到患者的治 疗效果与预后。氘代FMISO用于无创性的评价乏氧的PET示踪剂，在肿瘤的 不同阶段为明确诊断、制定最佳治疗方案及预后评估提供了有效的依据，在 临床中有着极大的潜在优势，未来定会有更广泛的应用。因此，现有技术还 有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种稳定同位素标记 的硝基咪唑类化合物及其制备与应用方法，旨在解决现有技术采用正电子类 放射性核素作为造影剂，对于病人的多次检测容易造成二次伤害，且无法作 为整个代谢过程的跟踪的问题。
本发明的技术方案如下：
一种稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物，其中，所述硝基咪唑类化合 物的化学结构通式为：
其中
R1和/或R2相互独立地为氢或氘或卤素，其中没有或者有一个或多个氢原 子被氘取代；
R3、R4、R5、R6和/或R7相互独立地为氢或氘、支链或直链C1-C10烷氧基、 支链或直链C1-C10烷基、取代或未取代C6-C10单环或二环芳基、取代或未取代 烷基-C6-C10单环或二环芳基、取代或未取代C5-C10单环或二环杂芳基、取代或 未取代烷基-C6-C10单环或二环杂芳基或羟基，其中没有或者有一个或多个氢原 子被氘取代；
其中R1～R7中至少有一个氢原子被氘取代，以及其中包括可能的非对映异 构体和/或对映异构体的混合物以及对映体纯的化合物及其药物盐。
所述稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物的化学结构式为：
或 不同取代基团的不同氘代位置及氘代个数之间的数列组合中的一种。
一种稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物的制备方法，包括步骤：
惰性气体保护下，体系降温至-30℃～10℃，将硼氘化钠加入到2,3-环氧丙 酸乙酯的氘代甲醇溶液中，-30℃～10℃保温反应，用氘水淬灭反应，后处理 得到2,3-环氧-1,1-d2-丙醇；
将2,3-环氧-1,1-d2-丙醇、2-硝基-1H-咪唑和碱加入到溶剂中，这里所述的 碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、甲醇钠、 乙醇钠、乙酸钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、叔丁醇铝等，这里所述溶剂为甲醇、 乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧 六环等，搅拌反应，后处理得到3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙烷-3,3-d2-1,2-二醇；
体系降温至-15℃～15℃，将对甲苯磺酰氯加入到3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基) 丙烷-3,3-d2-1,2-二醇的溶液中，10℃～30℃保温反应，加入咪唑的溶液，再加 入叔丁基二甲基氯硅烷的溶液，10℃～30℃保温反应，后处理得到2-(叔丁基 二甲基硅氧基)-3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙基-3,3-d2-4-甲基苯磺酸盐；
将2-(叔丁基二甲基硅氧基)-3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙基-3,3-d2-4-甲基苯磺酸盐加入到溶剂中，加入四丁基氟化铵的溶液，50℃～90℃保温反应，除去 溶剂，加入盐酸水解，后处理得到1-氟-3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙烷-3,3-d2-2- 醇。
一种稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物的应用方法，其中，将所述硝 基咪唑类化合物用作磁共振成像的造影剂。
所述硝基咪唑类化合物的应用方法，其中，将所述硝基咪唑类化合物用 作肿瘤乏氧显像剂。
所述硝基咪唑类化合物的应用方法，其中，所述造影剂还包括至少一种 药学上可接受的赋形剂。
所述硝基咪唑类化合物的应用方法，其中，所述赋形剂为载体、填充剂 或溶剂中的一种。
本发明的有益效果：本发明通过以氘代硝基咪唑类化合物作为造影剂， 该造影剂可用于肿瘤乏氧组织的显像。本发明中所用的氘代硝基咪唑类化合 物作为造影剂可在体内稳定存在，多次检测不会对人体造成伤害；检测可以 使用标准的核磁共振仪，不需要专用设备，成本更低，通过使用标准的磁共 振波谱采集硬件和信号处理就可以直接监测氘标记的转换，方法简单实用， 精度高、结果可靠，可定量定位的分析代谢状况。
附图说明
图1为本发明实施例硝基咪唑类化合物的制备方法的化学反应示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出 创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物(FMISO)，所述硝基咪唑类 化合物(FMISO)的化学结构通式为：
其中：
R1和/或R2相互独立地为氢或氘或卤素，其中没有或者有一个或多个氢原 子被氘取代；
R3、R4、R5、R6和/或R7相互独立地为氢或氘、支链或直链C1-C10烷氧基、 支链或直链C1-C10烷基、取代或未取代C6-C10单环或二环芳基、取代或未取代 烷基-C6-C10单环或二环芳基、取代或未取代C5-C10单环或二环杂芳基、取代或 未取代烷基-C6-C10单环或二环杂芳基或羟基，其中没有或者有一个或多个氢原 子被氘取代；
其中R1、R7中至少有一个氢原子被氘取代，以及其中包括可能的非对映 异构体和/或对映异构体的混合物以及对映体纯的化合物及其药物盐。
稳定同位素标记的硝基咪唑类化合物的化学结构式为：
或 不同取代基团的不同氘代位置及氘代个数之间的数列组合中的一种。
在一些实施方式中，还提供一种氘代硝基咪唑类(FMISO)化合物的制 备方法，其反应过程如图1所示，具体包括步骤：
步骤1、化合物B：-10℃氮气保护下，将硼氘化钠(3.97g,94.82mmol)加入 到搅拌着的化合物A(10.0g,86.20mmol)的甲醇-d4(100mL)溶液中，保温反应1h， 加入氘水(3mL)淬灭反应，40℃下减压蒸出甲醇-d4，加入甲基叔丁基醚萃取3 次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到5.05g油状化合物B，收率 77.0％；
步骤2、化合物D：将化合物B(4.74g,62.28mmol)、化合物C(3.52g,31.14mmol) 和碳酸钾(0.36g)加入到乙醇(200mL)中，当放热反应开始后，关闭加热，继续 搅拌40min，减压浓缩，残余物硅胶柱层析纯化得到2.61g化合物D，收率44.3％；
步骤3、化合物E：0℃下，将对甲苯磺酰氯(2.45g,12.86mmol)滴加到化合 物D(2.43g,12.86mmol)的无水吡啶(40ml)溶液中，混合物在室温下搅拌6h，加 入咪唑(3.50g,51.44mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液，加入叔丁基二甲基氯硅烷 (5.81g,38.58mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液，混合物在室温下搅拌2h，乙酸乙酯 萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物硅胶柱层析纯化得到白色固体3.96g 化合物E，收率67.3％；
步骤4、化合物F：将化合物E(3.87g,8.46mmol)加入到乙腈(80mL)中，加 入TBAF的四氢呋喃溶液(42mL,42mmmol)，升温回流反应6h，减压除去溶剂， 向得到的氟代中间体中加入1M盐酸，升温回流水解，反应结束后，降至室温， 加入2N氢氧化钠溶液中和，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残 余物硅胶柱层析纯化得到173mg化合物F，收率10.7％。
化合物F是氘代硝基咪唑类(FMISO)化合物的其中一种。
在一些实施方式中，还提供一种氘代硝基咪唑类(FMISO)化合物的应 用方法，其中，将本发明氘代硝基咪唑类(FMISO)化合物用作磁共振成像 的造影剂。进一步地，将氘代硝基咪唑类(FMISO)化合物用作肿瘤乏氧显 像剂。
FMISO是硝基咪唑类化合物，经被动扩散通过细胞膜进入细胞内，其配 体的亲脂性决定了其进入细胞的能力。配体硝基经细胞内相关酶的作用，被 还原而产生自由阴离子，在正常细胞中，它们被过氧化而扩散到细胞外，而 在乏氧细胞中，该中间体被进一步还原，产物与细胞内组分结合，从而滞留 在细胞中。FMISO只积聚在富有功能性的硝基还原酶的乏氧细胞内，因而将 FMISO标记上发射正电子的氘形成示踪剂可用于乏氧组织的显像。
本实施例以氘代硝基咪唑类(FMISO)化合物作为肿瘤乏氧显像剂，并 通过磁共振成像检测肿瘤代谢过程，从而做出诊断。本实施例采用氘代FMISO 作为造影剂具有以下优势：高含量的氘原子；在合理的时间内在脑组织中蓄 积达到足以用于诊断的浓度；毒性低，且完整的试剂几乎完全从体内排出。 这允许使用对人体无害的剂量进行有效的诊断。
在一些实施方式中，提供一种以氘代硝基咪唑类(FMISO)化合物作为 肿瘤乏氧显像剂的方法，其包括以下步骤：
将所述造影剂施用于受试者；
施用造影剂后，经过足够长的蓄积时间后，以氘核的频率进行磁共振成 像，得到2H-MR图像；
分析获得的2H-MR图像发现异常高强度的信号区域，基于观察到的氘核 的异常信号强度来诊断肿瘤代谢过程。
在本实施例中，可将基于本实施例造影剂测得的信号强度与在健康受试 者中相应组织中观察到的典型信号强度进行比较，从而比较判断差异，进而 对受试者的情况做出判断。
本实施例提供的检测方法与电离辐射(典型地，例如，对于CT、PET、 SPECT方法)的任何有害影响无关，这反过来又增加了研究的安全性，并使得 可以更频繁地重复进行研究。本发明旨在获得与正电子发射断层扫描(PET)类 似的诊断信息，但是与后者不同，它可以消除与放射性药物的电离辐射相关 的风险。
在一些实施方式中，所述造影剂还包括至少一种药学上可接受的赋形剂， 作为举例，所述赋形剂为载体、填充剂或溶剂中的一种。
在一些实施方式中，所述造影剂口服或肠胃外给予受试者。
在一些具体的实施方式中，将所述造影剂以每1kg体重0.60-0.75克的造 影剂给予受试者。
在一些实施方式中，所述氘代FMISO作为造影剂还可用于追踪相关代谢 物，其具体包括以下步骤：
通过核磁共振波谱仪扫描受试者待检测部位并形成使用氘代FMISO之前 的1H的使用前图谱；可以使用标准的核磁共振仪，如3T MRI扫描仪或7T MRI 扫描仪，不会有暴露于电离辐射的风险，不需要专用设备，使用方便，其序 列和成像参数则可以如下选择：使用PRESS序列(TR/TE＝2500/16ms，频谱 宽度＝4kHz，90脉冲带宽＝5400Hz，180脉冲带宽＝2400Hz，点数＝4006，VAPOR 水抑制，平均＝128)。
在获得使用前图谱后，给受试者使用氘代FMISO，所述氘代FMISO可以 是单一剂量单位形式的组合物，即该组合物可以是单剂量的或者是在一个容 器内容纳一个或多个单位剂量，每一剂量含有的成分均相同，即每剂中包含 相同重量的2H标记物质，每剂可直接或稀释后给受试者使用，也可将该组合 物制成不同的规格，比如包含氘代FMISO的不同规格，就可依据受试者的状 况来给予不同规格组合物去使用，该组合物可制成液体或固体不同的形态， 依据受试者的不同，可以给予不同剂量的氘代FMISO，比如按照0.60-0.75克/千克体重，最大为60克的用量将其溶解在200至300毫升的水中来使用，根 据氘代FMISO的不同规格，可以是注射的方式来使用，同时氘代FMISO还 可以是一种以散剂、片剂、丸剂、胶囊或液体中的任意一种形式存在的组合 物。用2H标记就意味着用2H取代一个或多个1H原子，由此就会导致相应代 谢物的1H MRS信号总体的降低，这样通过量化由2H取代1H产生的质子磁共 振波谱中信号的减少就能获得氘代FMISO转化的状况，从而得知细胞代谢状 况。在给定时间内通过核磁共振波谱仪在相同参数下再次扫描受试者待检测 部位并形成使用氘代FMISO之后的1H的使用后图谱；该给定时间优选在20 至90分钟，这样氘代FMISO在体内就能经过充分的转化，有助于获得更准 确的检测结果，体现代谢状况，在给定时间内可以间隔一定时间进行多次测 量，比如每隔五分钟或十分钟获取该时间点的图谱数据。由于2H具有较低的 核磁共振频率，在核磁共振波谱上就会具有较宽的固有宽峰，使得氘成像受磁场不均匀性的影响最小，却使得2H的核磁共振波谱仅含有少量代谢物峰， 1H MRS的灵敏度更高，就能单独检测出2H MRS无法获得的某些代谢物的图 谱，从而得到更精确的检测结果，在提供几种代谢物的稳态代谢信息的同时， 还可以在同一采集过程对关键代谢物的代谢动力过程予以检测。
本发明通过分析氘代FMISO使用前图谱和使用后图谱数据，获得使用氘 代FMISO之前和之后指定代谢物的浓度，根据前后的浓度变化得出组织的代 谢情况。利用1H质子磁共振波谱检测的普遍性及易于实施的优势，以及其出 色的光谱分辨率，就可以追踪氘代FMISO转移到的代谢物，检测分辨率和灵 敏度更高，可以检测到单个代谢物的动态交换，通过测量1H质子磁共振波谱 的变化，在高光谱分辨率下就能够检测到2H质子磁共振波谱无法检测到的代 谢物，从而得出体内代谢循环的速率，一次采集就可提供几种代谢物的稳态信息和代谢率，同时该发明中所用的氘代FMISO是可服用的，多次检测不会 对人体造成伤害；对于1H质子磁共振波谱的检测也可以使用标准的核磁共振 仪，不需要专用设备，成本更低，通过使用标准的1H质子磁共振波谱采集硬 件和信号处理就可以直接监测氘标记的转换，方法简单实用，精度高、结果 可靠，可定量定位的分析代谢状况。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。
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