针对细胞衰老的生物标志物
阅读说明：本技术 针对细胞衰老的生物标志物 (Biomarkers for cellular senescence ) 是由 马可·德马利亚 亚丽珍达·赫南德斯-瑟古拉 于 2018-03-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物标志物及其用途,具体涉及提供关于细胞是否衰老的重要指示的蛋白或mRNA的集合。提供了包含6种或更多种多肽或它们的编码mRNA的生物标志物组作为针对细胞衰老的生物标志物集合的用途,其中所述组至少包含生物标志物TSPAN13、GDNF、C2CD5、SUSD6、BCL2L2、PLK3,或它们的变体或片段。还提供了用于检测衰老细胞的衰老细胞检测试剂盒,以及用于杀死衰老细胞的药物缀合物。(The present invention relates to biomarkers and uses thereof, in particular to a collection of proteins or mrnas that provide an important indication as to whether a cell is senescent. There is provided the use of a biomarker panel comprising 6 or more polypeptides or their encoding mrnas as a set of biomarkers for cellular senescence, wherein the panel comprises at least the biomarkers TSPAN13, GDNF, C2CD5, SUSD6, BCL2L2, PLK3, or variants or fragments thereof. Also provided are senescent cell detection kits for detecting senescent cells, and drug conjugates for killing senescent cells.)
本发明涉及生物标志物及其用途。具体地，本发明涉及提供关于细胞是否衰老的重要指示的蛋白或mRNA的集合(生物标志物阵列)。它还涉及用于杀死衰老细胞的药物缀合物，以及包含所述药物缀合物的药物组合物。
细胞衰老是细胞状态的变化，由此细胞不能再复制。尽管细胞衰老与变老(ageing)相关，因为随着端粒变短更多的细胞无法复制，但细胞衰老绝非仅受变老调控。因此，不应将它与变老混淆。还可以经由致癌基因的激活、细胞-细胞融合、通过DNA损伤和/或对升高的活性氧(ROS)的应答来诱导细胞进入衰老状态，而与变老无关。
尽管衰老细胞不能复制，但它们仍具有代谢活性，并且通常采用有助于许多与年龄相关的疾病(包括2型糖尿病和动脉粥样硬化)的免疫原性表型。这些衰老相关的分泌表型(SASP)的破坏作用反过来刺激了许多围绕细胞衰老的活动，包括鉴定清除衰老细胞并改善老年人健康的新的化合物，以及发现用以鉴定细胞衰老的新的生物标志物。
当细胞进入衰老状态时，其特征在于具有许多非独特的特征，包括形态变化、酶的激活、染色质重构和转录改变。衰老的细胞影响胚胎形成、肿瘤抑制、伤口愈合，并对与年龄相关的疾病具有病理学控制。细胞衰老的通用生物标志物将提供强大的工具，以鉴定多种年龄相关疾病的可能发作，并可以为早期干预策略提供途径，以防止它们的发展。目前的研究已经表明，在药理学上去除变老小鼠中的衰老细胞显著延长健康和寿命。许多最近成立的公司目前正在开发可被用于治疗人的药物。强大的生物标志物将帮助医生确定患者是否有发展与细胞衰老增加相关的多种年龄相关疾病的风险。此外，期望鉴定出可以用作药理学干预例如延缓变老和年龄相关疾病的基础的新的靶标。
然而，任何目前可用的测量此类生物标志物的方法/测定都有明显的缺点，例如，它们是非特异性的，可以识别许多其他的细胞扰动，和/或是细胞类型强烈相关的并且是压力依赖性的。
因此，本发明的发明人着手提供新的生物标志物组，其可以识别任何类型的衰老细胞，而无需进一步的鉴定和验证。出人意料地是，通过对许多不同的整个转录组数据集的广泛比较，他们鉴定出了37种转录组标志物的列表(参见表1)，其提供了高度特异性针对衰老细胞状态的通用阵列。
在一个方面，本发明提供了选自以下的至少5种多肽或它们的编码mRNA的集合作为细胞衰老的生物标志物组(在本文中也被称为“核心特征”)的用途：TSPAN13、GDNF、C2CD5、CNTLN、FAM214B、PATZ1、PLXNA3、STAG1、SUSD6、TOLLIP、TRDMT1、ZBTB7A、ARID2、B4GALT7、BCL2L2、CHMP5、CREBBP、DDA1、DYNLT3、EFNB3、ICE1、MELS1、NOL3、PCIF1、PDLIM4、PDS5B、PLK3、RAI14、RHNO1、SCOC、SLC16A3、SMO、SPIN4、TAF13、TMEM87B、MTCYB、UFM1和ZNHIT1，或它们的变体或片段。
表1：高度特异性针对衰老细胞状态的转录组标志物。
更具体地，本发明提供了包含六种多肽或它们的编码mRNA的组作为针对细胞衰老的生物标志物集合(在本文中也被称为“最小核心特征”)的用途，其中所述组包含生物标志物TSPAN13、GDNF、C2CD5、SUSD6、BCL2L2、PLK3，或它们的变体或片段。
如果期望如此，如本文中所提供的该最小核心特征可被补充有一种或多种另外的细胞衰老标志物。例如，生物标志物集合包含至少7种，更优选地至少8种或甚至更多种多肽或mRNA，所述生物标志物集合包含最小核心特征的6种生物标志物，以及选自以下的一种或多种：CTLN、FAM2 14B、PATZ1、PLXNA3、STAG1、TOLLIP、TRDMT1、ZBTB7A、ARID2、B4GALT7、CHMP5、CREBBP、DDA1、DYNLT3、EFNB3、ICE1、MEIS1、NOL3、PCIF1、PDLIM4、PDS5B、RAI14、RHNO1、SCOC、SLC16A3、SMO、SPIN4、TAF13、TMEM87B、UFM1和ZNHIT1。
在一个实施方案中，所述集合包含生物标志物TSPAN13、GDNF、C2CD5、SUSD6、BCL2L2、PLK3，以及DYNLT3和PLXNA3中的一种或两种。
特别优选的是包含选自以下的至少5种多肽或它们的编码mRNA的集合作为针对细胞衰老的生物标志物组的用途：GDNF、C2CD5、CNTLN、FAM214B、PATZ1、PLXNA3、STAG1、SUSD6、TOLLIP、TRDMT1和ZBTB7A，或它们的变体或片段。优选地，至少包括标志物GDNF。更优选地，至少包括标志物TSPAN13。例如，所述集合包含以下标志物或由以下标志物组成：TSPAN 13、GDNF、PATZ1、PLXNA3、STAG1和SUSD6，或TOLLIP、TRDMT1、ZBTB7A、C2CD5和CNTLN，或FAM214B、GDNF、PATZ1、PLXNA3和STAG1。
在一个实施方案中，所述集合包含衰老细胞中被上调的至少一种或多种生物标志物。这些包括GDNF、FAM214B、PLXNA3、SUSD6、TOLLIP、ZBTB7A、B4GALT7、BCL2L2、CHMP5、DDA1、DYNLT3、NOL3、PDLIM4、PLK3、RAI14、SCOC、SLC16A3、TAF13、TMEM87B、TSPAN13、UFM1和ZNHIT1。优选的是TSPAN 13、GDNF、FAM214B、PLXNA3、SUSD6、TOLLIP和/或ZBTB7A，或它们的变体或片段。更优选的是TSPAN13、GDNF、BCL2L2、PLXNA3、SUSD6和DYNLT3。
在单独的实施方案中，本发明提供了TSPAN13多肽或其编码mRNA，或它们的变体或片段作为针对细胞衰老的生物标志物组(作为单一的生物标志物或为多生物标志物组的一部分)的用途。
根据本发明，高度特异性针对衰老细胞状态的分子生物标志物的集合可包括由这些基因表达的任何产物，包括它们的变体，例如表达的mRNA或蛋白、剪接变体、共翻译和翻译后修饰的蛋白、多态性变体等。
在一个实施方案中，生物标志物组包含多肽、多肽变体或多肽片段的集合。
术语“多肽片段”或“片段”，当关于多肽使用时，是指其中与全长多肽本身相比，氨基酸残基不存在，但其中剩余的氨基酸序列通常与参照多肽中相应的位置相同的多肽。此类缺失可发生在参照多肽的氨基末端或羧基末端，或者可替代地上述二者。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长，至少14个氨基酸长，至少20、30、40或50个氨基酸长，至少75个氨基酸长，或者至少100、150、200、300、500或更多个氨基酸长。
片段可保留参照多肽的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，片段可包含结构域或特征，以及任选地包含结构域或特征的一侧或两侧上的另外的氨基酸，所述另外的氨基酸数量可从5、10、15、20、30、40、50个或多达100个或更多个残基。此外，片段可包括特异性区域的子片段，所述子片段保留了其所来源的区域的功能。
在另一个实施方案中，生物标志物组包含mRNA的集合。
本发明还提供了检测测试样品中的衰老细胞的方法，所述方法包括(体外)检测所述样品中至少根据本发明的衰老细胞生物标志物的集合的表达，其中相对于参照样品中检测到的表达水平，TSPAN13、C2CD5、GDNF、PLXNA3、SUSD6、BCL2L2，或它们的变体或片段的增加的表达水平指示样品中存在衰老细胞。
在具体的实施方案中，所述方法包括(体外)检测样品中至少TSPAN13的表达，其中相对于参照样品中检测到的表达水平，TSPAN13或其变体或片段的增加的表达水平指示样品中存在衰老细胞。
优选地，相对于本领域已知的参照或“管家”基因(产物)(如微管蛋白或肌动蛋白)对一种或多种衰老生物标志物(多肽或mRNA)的表达水平进行标准化。
如本文中所用的，术语“衰老细胞”是指显示至少2倍增加的β-半乳糖苷酶活性，和例如如通过掺入5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)至从头合成DNA中所证实的减少的增殖的细胞。
测试对象可以是实验动物或人。测试样品为例如采自测试对象的身体样品。优选地，样品包括血液、血浆、血清、脊髓液、尿液、汗液、唾液、眼泪、***抽出物、***液、***、***分泌物、粪便、宫颈刮取物、细胞(cytes)、羊水、眼内液、黏液、呼吸中的水分、动物组织、细胞溶解产物、肿瘤组织、毛发、皮肤、口腔刮取物、指甲、骨髓、软骨、感染性蛋白质、骨粉、耳垢，或它们的组合。测试样品可为离体样品或体外样品。
可通过用于检测转录的核酸或蛋白表达的多种熟知的方法中的任一种评估本发明中所描述的生物标志物的表达。此类方法的非限制性实例包括用于检测分泌的蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或细胞核蛋白的免疫学方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性测定、核酸杂交方法、核酸逆转录方法，以及核酸扩增方法。
在一个实施方案中，使用特异性地与生物标志物蛋白或其片段(包括已经历了在肿瘤细胞中它通常经历的翻译后修饰(例如，糖基化、磷酸化、甲基化等)中的全部或一部分的生物标志物蛋白)结合的抗体(例如放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，与底物或与蛋白-配体对{例如，生物素-链霉亲和素}的蛋白或配体缀合的抗体)，或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)评估生物标志物集合的表达。
因此，众多方法和装置为本发明所公开主题的生物标志物多肽的检测和分析的技术人员所熟知。关于主题测试样品中的多肽或蛋白，可使用质谱和/或免疫测定装置和方法，尽管其他的方法为本领域技术人员所熟知(例如，标志物RNA水平的测量)。参见，例如第6,143,576号；第6,113,855号；第6,019,944号；第5,985,579号；第5,947,124号；第5,939,272号；第5,922,615号；第5,885,527号；第5,851,776号；第5,824,799号；第5,679,526号；第5,525,524号；和第5,480,792号美国专利。这些装置和方法可以利用各种夹心、竞争性或非竞争性测定形式中的标记分子，以产生与目标分析物的存在或量相关的信号。另外，某些方法和装置(如生物传感器和光学免疫测定)可以被用于确定分析物的存在或量，而无需标记分子。参见，例如，第5,631,171号和第5,955,377号美国专利。
在本发明所公开主题的某些优选实施方案中，使用免疫测定分析生物标志物肽。可以使用特异性针对衰老生物标志物组的每种多肽的抗体或其片段，并检测特异性结合来确定肽标记的存在或量。例如，在一些实施方案中，抗体特异性结合表1的肽，所述抗体包括也结合全长肽的抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
可以利用任何合适的免疫测定，例如，酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定等。可以直接或间接检测抗体与标志物的特异性免疫结合。直接标记包括与抗体连接的荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素等。间接标记包括本领域公知的各种酶，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。
本发明的主题还预期了特异性针对标志物的固定化抗体或其片段的用途。可以将抗体固定在各种固体基质上，如磁性或色谱基质颗粒、测定板的表面(如微量滴定孔)、固体基质材料片(如塑料、尼龙、纸)等。可以通过将抗体或多个抗体以阵列形式包被在固体支持物上来制备测定条。然后可以将该条浸入测试生物样品中，然后通过洗涤和检测步骤快速处理，以产生可测量的信号，诸如例如有色斑点。
在一些实施方案中，可以单独或与其他方法(例如，免疫测定)组合使用质谱(MS)分析来确定生物样品中一种或多种目标多肽生物标志物的存在和/或量。在一些实施方案中，MS分析包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)MS分析，诸如例如直接聚光(direct-spot)MALDI-TOF或液相色谱MALDI-TOF质谱分析。在一些实施方案中，MS分析包括电喷雾电离(ESI)MS，诸如例如液相色谱(LC)ESI-MS。可使用商购获得的光谱仪(诸如例如三重四极杆质谱仪)完成质量分析。利用MS分析(包括MALDI-TOF MS和ESI-MS)检测生物样品中的生物标志物肽的存在和量的方法是本领域已知的。参见例如第6,925,389号；第6,989,100号和第6,890,763号美国专利供进一步指导。在一些实施方案中，可利用MS分析来鉴定与对照相比的特异性多肽序列和相应的蛋白质及量。然而，也可以将MS分析与本发明所公开主题的方法一起利用，以确定肽生物标志物的可测量的特性，且特别是MS观察的质量。由此，通过MS分析“确定表1的一种或多种肽的量”包括确定从通过MS的肽片段分析推断的全长多肽的量、特异性确定的肽片段量以及MS观察的质量峰分析。
在另一个实施方案中，生物标志物组包含mRNA的集合，并通过从患者样品中的细胞中制备mRNA/cDNA(即转录的多核苷酸)，以及通过使mRNA/cDNA与作为与生物标志物核酸或其片段的互补物的参照多核苷酸杂交，来评估生物标志物的表达。可以任选地在与参照多核苷酸杂交之前，使用多种聚合酶链式反应方法中的任何一种来扩增cDNA。可以同样地使用定量PCR(qPCR)检测一种或多种生物标志物的表达，以评估生物标志物的表达水平。可替代地，可以使用检测本发明的生物标志物的突变或变体(例如，单核苷酸多态性、缺失等)的许多已知的方法中的任何一种来检测患者中生物标志物的出现。优选地，相对于本领域已知的参照或“管家”基因(如微管蛋白或肌动蛋白)，将一种或多种衰老生物标志物的表达水平标准化。
在相关的实施方案中，使从样品获得的转录的多核苷酸的混合物与基质接触，所述基质上固定有与细胞衰老生物标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500个，或更多个核苷酸残基)互补或同源的多核苷酸。如果互补或同源的多核苷酸在基质上是差异可检测的(例如，使用不同的发色团或荧光团可检测的，或被固定到不同的选定位置)，然后可以使用单一基质(例如，被固定在选定位置处的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估多种生物标志物的表达水平。当使用包括使一种核酸与另一种杂交的评估生物标志物表达的方法时，优选在严格的杂交条件下进行杂交。在具体的实施方案中，可以使用本领域已知的方法通过在生物样品中的原位和通过体外形式两者来确定生物标志物mRNA的水平。术语“生物样品”旨在包括从对象分离的组织、细胞、生物流体及它们的分离物，以及存在于对象中的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，可以利用不针对分离的mRNA进行选择的任何RNA分离技术来从肿瘤细胞中纯化RNA(参见，例如，Ausubel等人,编辑,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,纽约，1987-1999)。另外，可以使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量的组织样品，诸如，例如Chomczynski的单步骤RNA分离方法(1989，第4,843,155号美国专利)。
分离的mRNA可被用于杂交或扩增测定，包括Southern或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。一种优选的用于检测mRNA水平的诊断方法包括使分离的mRNA与可以与由被检测的基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其一部分，如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸，且足以在严格条件下与编码本发明的生物标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。本文描述了用于本发明的诊断测定的其他合适的探针。mRNA与探针的杂交表明正在表达所述生物标志物。
在一种形式中，mRNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上电泳并将mRNA从凝胶转移到膜(如硝酸纤维素)上。在可替代的形式中，将探针固定在固体表面上，并且使mRNA与例如Affymetrix基因芯片阵列中的探针接触。技术人员可以容易地采用已知的mRNA检测方法以用于检测由本发明的生物标志物编码的mRNA的水平。
用于确定样品中mRNA生物标志物水平的可替代方法包括核酸扩增过程，例如，通过RT-PCR、连接酶链式反应、自维持序列复制、转录扩增系统、Q-β复制酶、滚环复制(第5,854,033号美国专利)或任何其他的核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。如果此类分子以非常少的数量存在，则这些检测方案对于核酸分子的检测特别有用。如本文中所使用的，扩增引物被限定为可以退火到基因的5’或3’区(分别为正链和负链，或反之亦然)，并且其间包含短区域的一对核酸分子。通常，扩增引物的长度为约10至30个核苷酸，并且侧接长度为约50至200个核苷酸的区域。在合适的条件下和合适的试剂下，此类引物允许扩增包含侧接引物的核苷酸序列的核酸分子。
可以用一个测试样品分开或同时进行选自表1的多种标志物(其为多肽或mRNA水平)的分析。可以将几种标志物组合至一个测试中，以高效处理多个样品。此外，本领域技术人员将认可从相同的对象测试多个样品(例如，在连续的时间点)的值。此类系列样品测试将允许识别生物标志物水平随时间的变化。标志物水平的增加或减少，以及标志物水平无变化，可以提供有关疾病状态的有用信息，其包括确定从疾病发作的大概时间、功能组织的存在和量、药物疗法的适当性、各种疗法的有效性、年龄相关疾病的各种类型和阶段的差异、疾病严重程度的鉴定，以及对象结果(预后)的鉴定(包括未来事件的风险)。
本发明的另一方面涉及用于检测样品中的衰老细胞的衰老细胞检测试剂盒，所述试剂盒包含用于检测来自测试对象的样品中至少根据本发明的生物标志物集合的存在的工具。
例如，试剂盒可包含标记的化合物或试剂(每个能够检测生物样品中的生物标志物蛋白或核酸)以及用于确定样品中的蛋白或mRNA的量的工具(例如，与蛋白或其片段结合的抗体，或者与编码蛋白的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针)。试剂盒还可包含用于解释使用试剂盒获得的结果的说明书。
提供了试剂盒，其包含用于检测选自以下的至少5种，优选至少6种，更优选至少7种多肽或niRNA的存在的工具：TSPAN13GDNF、C2CD5、CNTLN、FAM214B、PATZ1、PLXNA3、STAG1、SUSD6、TOLLIP、TRDMT1、ZBTB7A、ARID2、B4GALT7、BCL2L2、CHMP5、CREBBP、DDA1、DYNLT3、EFNB3、ICE1、MEIS1、NOL3、PCTF1、PDLIM4、PDS5B、PLK3、RAI14、RHNO1、SCOC、SLC16A3、SMO、SPIN4、TAF13、TMEM87B、UFM1和ZNHIT1，或者它们的变体或片段。
在具体的方面，试剂盒包含用于检测选自以下的至少5种多肽或mRNA的存在的工具：C2CD5、CNTLN、FAM214B、GDNF、PATZ1、PLXNA3、STAG1、SUSD6、TOLLIP、TRDMT1和ZBTB7A，或者它们的变体或片段。例如，试剂盒包含(单克隆)抗体的集合，其每个与集合的多肽特异性反应，所述集合包含选自以下的至少6种，优选至少7种，更优选至少8种多肽：C2CD5、CNTLN、FAM214B、GDNF、PATZ1、PLXNA3、STAG1、SUSD6、TOLLIP、TRDMT1和ZBTB7A，或者它们的变体或片段。
试剂盒可包含与以下多肽反应的抗体：C2CD5、CNTLN、FAM214B、GDNF、PATZ1、PLXNA3、STAG1、SUSD6、TOLLIP、TRDMT1和ZBTB7A，或者它们的变体或片段。
在一些实施方案中，提供了用于分析生物标志物组的试剂盒，其包含对与如本文中所公开的细胞衰老相关的一种或多种多肽生物标志物具有特异性的抗体。所述抗体可以与如本文中所公开的基质结合。此类试剂盒可以包含用于分析至少一个测试样品的装置和试剂。
在另一个实施方案中，试剂盒包含用于检测选自以下的至少5种mRNA的存在的工具：GDNF、C2CD5、CNTLN、FAM214B、PATZ1、PLXNA3、STAG1、SUSD6、TOLLIP、TRDMT1和ZBTB7A，或者它们的变体或片段。例如，试剂盒包含固体基质，所述固体基质上固定有多个寡核苷酸，每个与本发明的细胞衰老生物标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500个，或更多个核苷酸残基)互补或同源。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包含例如：(1)与生物标志物蛋白结合的第一抗体(例如，与固体支持物连接)，和任选地，(2)与蛋白或第一抗体结合且与可检测的标记缀合的第二不同的抗体。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可包含例如：(1)寡核苷酸，例如与编码生物标志物蛋白的核酸序列杂交的可检测标记的寡核苷酸，或者(2)用于扩增生物标志物核酸分子的一对引物。试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。试剂盒还可包含检测可检测的标记所必需的组分(例如，酶或底物)。试剂盒还可含有可以测定并与测试样品比较的对照样品或一系列对照样品。
例如，试剂盒可包含至少一个对照或参照样品，优选地试剂盒包含阴性对照和/或阳性对照。阴性对照可以是任何非衰老细胞，所述非衰老细胞不表达任何上调的根据本发明的衰老生物标志物，或其仅为非常低的或不可检测的浓度。阳性对照可包含任何衰老细胞，其表达增加水平的上调的衰老生物标志物中的一种或多种。试剂盒的每种组分可以被包封在单独的容器中，并且所有各种容器中可以位于单个包装中，连同进行分析和解释使用试剂盒进行的测定的结果的说明书一起。任选地，试剂盒可含有用于将标志物水平转化为对象的诊断或预后的一种或多种试剂或装置。
利用衰老细胞中上调的多肽的鉴定，本发明还提供了它们中的每种作为药物靶标的用途。因此，本发明提供了用于杀死衰老细胞的药物缀合物，所述缀合物包含，所述衰老细胞靶向部分被配置为在使用中特异性靶向并结合选自以下的衰老细胞生物标志物：TSPAN13、GDNF、FAM214B、PLXNA3、SUSD6、TOLLIP、ZBTB7A、B4GALT7、BCL2L2、CHMP5、DDA1、DYNLT3、NOL3、PDLIM4、PLK3、RAI14、SCOC、SLC16A3、TAF13、TMEM87B、UFM1和ZNHIT1。
在优选的方面，所述缀合物包含衰老细胞靶向部分以及杀死所结合的衰老细胞的细胞毒性剂，所述衰老细胞靶向部分被配置为在使用中特异性靶向并结合选自以下的衰老细胞生物标志物：PLXNA3、SUSD6、FAM214B、GDNF、TOLLIP和ZBTB7A。
例如，靶向部分为抗体或其抗原结合片段、适配体、塑料(plastic)抗体或小分子。
细胞毒性剂可以是放射性同位素、毒素或毒性肽或溶解性(senolytic)药物。在一个实施方案中，毒素选自：阿霉素、卡奇霉素、奥利斯他汀(auristatin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、倍癌霉素(duocarmycin)、喜树碱、蒽环类药物(anthracyclins)、生物碱类、抗凋亡抑制剂、溶酶体抑制剂、葡萄糖类似物、黄酮类，以及它们的毒性类似物。在另一个实施方案中，毒性肽是假单胞菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒素、肥皂草素或美洲商陆，或者抗病毒蛋白。在优选的实施方案中，细胞毒性剂是溶解性药剂(senolyticagent)，其对衰老细胞具有毒性，因而避免由于对非衰老细胞(例如血液细胞的毒性)而引起的脱靶效应。溶解性药剂是本领域已知的，参见例如WO2015/116740A1，通过引用并入本文中。在一个实施方案中，本发明的药物缀合物包含：(a)抑制至少Bcl-xL的Bcl-2抗凋亡蛋白家族成员的抑制剂；(b)MDM2抑制剂；或(c)Akt特异性抑制剂。
如下文的实施例3中所示，出人意料地发现，在不同类型的衰老细胞中TSPAN13的mRNA水平增加。基于TSPAN13的高或低细胞表面表达，使用流式细胞术分选衰老细胞群。有趣的是，发现TSPAN13阳性细胞显示出已知的衰老标志物p16和p21的增加的水平。在衰老细胞的浆膜上表达的TSPAN13可以被抗体-药物缀合物(ADC)靶向。
因此，在优选的方面，缀合物包含衰老细胞靶向部分，其在使用时特异性靶向并结合TSPAN13，并且与细胞毒性剂缀合。在一个实施方案中，本发明提供了重组单克隆抗体(优选地针对TSPAN13)，其经由合成的可切割的或不可切割的连接子与细胞毒性剂(也称为弹头)共价结合。在具体的实施方案中，药物缀合物是与一种或多种BCL-2抗凋亡蛋白家族成员的抑制剂缀合的针对TSPAN13的抗体，其中所述抑制剂抑制至少Bcl-xL并且选自ABT-263、ABT-737、WEHI-539和A-1 155463。例如，YSPAN13抗体与ABT-263(也被称为Navitoclax)或ABT-737缀合。
在另一个方面，缀合物包含特异性靶向并结合GDNF的衰老细胞靶向部分(如抗体)，所述靶向部分与细胞毒性剂缀合。
在优选的方面，缀合物包含特异性靶向并结合PLXNA3的衰老细胞靶向部分(如抗体)，所述靶向部分与细胞毒性剂缀合。
在另一个优选的方面，缀合物包含特异性靶向并结合SUSD6的衰老细胞靶向部分(如抗体)，所述靶向部分与细胞毒性剂缀合。
在另一个方面，缀合物包含特异性靶向并结合TOLLIP的衰老细胞靶向部分(如抗体)，所述靶向部分与细胞毒性剂缀合。
在另一个方面，缀合物包含特异性靶向并结合ZBTB7A的衰老细胞靶向部分(如抗体)，所述靶向部分与细胞毒性剂缀合。
在优选的方面，缀合物包含特异性靶向并结合TSPAN13的衰老细胞靶向部分(如抗体)，所述靶向部分与细胞毒性剂缀合。
术语“抗体”广义上涵盖天然存在的抗体形式和重组抗体形式(如单链抗体、嵌合和人源化抗体及多特异性抗体)，以及前述所有的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可包括与抗体缀合的蛋白或化学部分。
术语“抗体”以最广义含义使用，并且涵盖完全组装的抗体、可以结合抗原的抗体片段(例如Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双体)，以及包含前述的重组肽。
在一个实施方案中，靶向部分是单克隆抗体，其如本文中所使用的是指从基本上同源的抗体群获得的抗体，即，除了可能的可能以小量存在的天然存在的突变外，包含所述群的单独的抗体是相同的。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体会产生两个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点和残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶35的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍然能够使抗原交联。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，该区域由一条重链和一条轻链可变结构域以紧密、非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv种类中，一条重链和一条轻链可变结构域可以通过柔性肽连接子共价连接，使得轻链和重链可以缔合成类似于双链Fv种类中的“二聚体的”结构。以这种结构，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定位于VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予了抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含特异性针对抗原的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab’片段的区别在于，在重链CH1结构域的羧基末端处添加了少量残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初作为成对的Fab’片段产生，它们之间具有铰链半胱氨酸。
可以从商业供应者获得或者可以通过本领结构域已知的方法制造如本文中所提供的用于药物缀合物的针对(人)衰老细胞多肽靶标(例如TSPAN13)的抗体。
例如，可以通过用衰老生物标志物蛋白免疫原免疫合适的对象(例如鸡、兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)来制备多克隆抗体。可以通过标准技术(如用使用固定化的生物标志物蛋白的ELISA)随时间监测免疫对象中的抗体效价。在免疫后的适当时间，例如，当抗体效价最高时，可以从对象获得产生抗体的细胞，并用于通过标准技术制备单克隆抗体，如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，(1983)Immunol.Today 4:72)、EBV杂交瘤技术(Cole等人，(1985),Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,编辑Reisfeld和Sell(Alan R.Liss,Inc.,New York,N.Y.),pp.77-96)或三源杂交瘤(trioma)技术。产生杂交瘤的技术是本领结构域公知的。
替代制备分泌单克隆抗体的杂交瘤，可以通过用生物标志物蛋白筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)从而分离出结合生物标志物蛋白的免疫球蛋白文库成员，来鉴定和分离单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是商购可获得的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及StratageneSurfZAPθ噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
本发明还提供了药物组合物，其包含根据本发明的药物缀合物和药学上可接受的媒介物。组合物可靶向多于一种本发明的药物靶标。例如，它包含两种或更多种药物缀合物以及杀死结合的衰老细胞的细胞毒性剂，所述两种或更多种药物缀合物选自特异性靶向并结合选自TSPAN13、PLXNA3、SUSD6、FAM214B、GDNF、TOLLIP和ZBTB7A的衰老细胞生物标志物的缀合物组。优选地，药物组合物至少包含药物缀合物，其包含TSPAN13靶向部分(如抗体)，所述靶向部分与细胞毒性剂缀合。
还提供了根据本发明药物缀合物，其用作药物的。例如，药物缀合物被适当地用于治疗、延迟、预防或改善年龄相关的疾病。
年龄相关的病状可包括通过诱导或维持对象中的细胞或细胞群的非增殖或衰老状态而完全或部分介导的任何疾病或病况。实例包括年龄相关的组织或器官衰退，其可能缺少可见的病状指示，或明显的病状(如退行性疾病或功能下降性病症)。例如，阿尔茨海默病、帕金森氏病、白内障、黄斑变性、青光眼、动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、心肌梗死、中风、高血压、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨关节炎、2型糖尿病、肥胖症、脂肪功能障碍、冠状动脉疾病、脑血管疾病、牙周疾病，以及癌症治疗相关的残疾如各种组织中的萎缩和纤维化、脑和心脏损伤，以及治疗相关的骨髓增生异常综合征。另外，年龄相关的病状可包括加速变老的疾病，如Hutchinson-Gilford早年衰老综合症、Werner综合征、Cockayne综合征、着色性干皮病、共济失调性毛细血管扩张症、范可尼贫血、先天性角化不良、再生障碍性贫血、特发性肺纤维化等等。
优选的年龄相关的疾病包括动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、青光眼、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、阿尔茨海默病或其他类型的痴呆。
在其他的实施方案中，本发明提供了治疗衰老相关的病状的方法，其包括向有需要的对象施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量选择性杀死衰老细胞而不是非衰老细胞的根据本发明的药物缀合物。
通过选择性杀死一种或多种衰老细胞，意指本发明的组合物在相同的浓度下不明显地杀死非衰老细胞。因此，非衰老细胞中组合物的中值致死剂量或LD50可以比衰老细胞中组合物的LD50高约2至约50倍。如本文中所使用的，LD50是杀死细胞样品中一半细胞所需的组合物浓度。例如，非衰老细胞中组合物的LD50可以比衰老细胞中组合物的LD50高超过约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。可替代地，非衰老细胞中组合物的LD50可以比衰老细胞中组合物的LD50高超过约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍。另外，非衰老细胞中组合物的LD50可能比衰老细胞中组合物的LD50高超过50倍。在某些实施方案中，非衰老细胞中组合物的LD50比衰老细胞中组合物的LD50高约2倍至约10倍。在示例性的实施方案中，非衰老细胞中组合物的LD50比衰老细胞中组合物的LD50高约3倍至约6倍。
衰老相关的病状可以包括通过诱导或维持对象中的细胞或细胞群的非增殖或衰老状态而完全或部分介导的任何疾病或病况。非限制性实例包括心血管疾病，如心绞痛、主动脉瘤、心律不齐、脑动脉瘤、心脏舒张功能障碍、心肌纤维化、心脏抗应激性、心肌病、颈动脉疾病、冠状动脉血栓形成、心内膜炎、高胆固醇血症、高脂血症、二尖瓣脱垂和外周血管疾病；炎性或自身免疫性疾病，如椎间盘突出、炎性肠病、驼背、口腔粘膜炎、狼疮、间质性膀胱炎、硬皮病和脱发；神经退行性疾病，如痴呆、亨廷顿氏病、运动神经元功能障碍、年龄相关的记忆减退和抑郁/情绪病症；代谢性疾病，如糖尿病性溃疡和代谢综合征；肺部疾病，如年龄相关的肺功能丧失、哮喘、支气管扩张、囊性纤维化、肺气肿和年龄相关的睡眠呼吸暂停；胃肠道疾病，如巴雷特食管；年龄相关的病症，如肝纤维化、肌肉疲劳、口腔粘膜下层纤维化、胰腺纤维化、良性***增生(BPH)和年龄相关的睡眠病症；生殖性病症，如更年期(男性和女性)、卵子供应(女性)、***活力(男性)、生育力(男性和女性)、性冲动和***功能及性兴奋(男性和女性)；皮肤病学疾病，如特应性皮炎、皮肤狼疮、皮肤淋巴瘤、感觉迟钝、湿疹、湿疹样出疹、嗜酸性皮肤病(eosinophilic dermatosis)、皮肤的纤维组织细胞增生、色素沉着过度、免疫大疱皮肤病(immunobullous dermatosis)、痣、类天疱疮、天疱疮、瘙痒、银屑病、疹、反应性嗜中性皮肤病(reactive neutrophilic dermatosis)、皱纹和荨麻疹；以及其他的疾病，如糖尿病伤口愈合、移植后肾纤维化和颈动脉血栓形成。
对于治疗应用，向对象施用治疗有效量的本发明的药物缀合物。“治疗有效量”是足以产生可测量的应答(例如，衰老细胞的细胞死亡、抗变老应答、与退行性疾病相关的症状的改善，或与功能下降性病症相关的症状的改善)的治疗组合物的量。治疗组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便施用有效实现所期望的对特定对象的治疗应答的活性化合物的量。选定的剂量水平将取决于多种因素，包括治疗组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、正在治疗对象的年龄、年龄相关性疾病或病况、退行性疾病、功能下降性病症、症状，以及身体状况和先前病史。在一些实施方案中，在没有剂量限制毒性的情况下，给予最小剂量，并增加剂量。治疗有效剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估是医药领域普通技术人员已知的。
如关于有效治疗症状所需要的，给药频率可以是每天，或者每周或每月一次、两次、三次或更多次。相对于疾病本身的治疗施用时间安排和治疗持续时间将由病例的情况决定。可以如由急诊医疗人员所施用的立即开始治疗，如在受伤部位。可以在医院或诊所本身开始治疗，或者可以在出院后或在门诊就诊之后的稍后时间开始治疗。治疗的持续时间范围可以为从基于一次施用的单次剂量至治疗性治疗的终身过程。可以使用标准临床技术确定和优化典型剂量水平，并且将取决于施用方式。
对象可以是啮齿动物、人、牲畜动物、伴侣动物或动物学动物。在一个实施方案中，对象可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方案中，对象可以是牲畜动物。合适的牲畜动物的非限制性实例可以包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在另一个实施例中，对象可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可以包括宠物，如狗、猫、兔和鸟类。在另一个实施方案中，对象可以是动物学动物。如本文中所使用的，“动物学动物”是指可以在动物园中发现的动物。此类动物可以包括非人的灵长类、大型猫科动物、狼和熊。在优选的实施方式中，对象是人。
人类对象可以为任何年龄。然而，因为衰老细胞通常与变老有关，所以人类对象可以是年长的人类对象。在一些实施方案中，人类对象可以为约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95岁的年龄或更大年龄。在一些优选的实施方案中，人类对象为30岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为40岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为45岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为50岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为55岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为60岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为65岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为70岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为75岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为80岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为85岁的年龄或更大年龄。在其他优选的实施方案中，人类对象为90岁的年龄或更大年龄。
具体实施方式
图1.衰老成纤维细胞转录组学的荟萃分析。实验设计。七个RNA-seq数据集，包括三种类型的衰老和六种不同的成纤维细胞株系，被用于建立刺激特异性特征和与刺激无关的衰老成纤维细胞的通用特征。使用三种方法建立每种特征：负二项式广义线性模型(GLM)、Fisher和反正态p值组合。每个特征中仅包括通过这三种方法计算出的p值<＝0.01且表达不变或处于静止的相反方向的基因。仅用负二项式GLM建立电离辐射诱导的衰老(IRIS)的特征，因为只有一个数据集是可用的。展示了包含每个特征的基因数量：复制性衰老(RS)特征的1721个基因，致癌基因诱导的衰老(OIS)特征的1586个基因，电离辐射诱导的衰老(IRIS)特征的2688个基因以及与刺激无关的成纤维细胞的衰老特征的726个基因。
图2.核心衰老相关的特征的特性。A.实验设计。将从黑素细胞、角化细胞和星形胶质细胞的指示研究中获得的RNA-seq数据集与成纤维细胞的衰老特征进行了比较。花瓣图中显示了在所有数据集中差异表达(p值<＝0.01)的基因的交集。B.衰老核心特征的37个基因的热图。图显示了每种细胞类型相对于增殖的细胞的倍数变化的以2为底的对数。C.核心衰老特征中富集的基因本体(GO)条目。该图显示了特征的上调(红色)和下调(蓝色)基因中富集的GO条目。条表示p值的以10为底的对数。D.衰老核心特征中富集的通路。列出了核心衰老特征(B)内的基因中富集的通路及它们相应的p值和来源。
图3.衰老转录组的时间动态。A.实验设计。将成纤维细胞(HCA-2，黄色)、黑素细胞(红色)和角化细胞(洋红色)暴露至电离辐射(IR)，并在4、10或20天后收获RNA。
通过RNA-seq获得衰老诱导后不同细胞类型和间隔的转录组。生成了具有在所有三种细胞类型中差异表达(p值<＝0.01)的基因的时间点特征和具有由所有细胞类型和时间点共有的基因的共有的IR诱导的衰老(IRIS)特征(p值<＝0.01)。B.显示每种细胞类型的SASP动力学的热图。显示了在每种细胞类型中在至少一个时间点显著差异表达的已知SASP因子。热图显示了每次辐照后相对于增殖的细胞的倍数变化的以2为底的对数。仅在成纤维细胞上测量静止状态。紫色箭头突出显示MMP1，其为在所有细胞类型中通常在第10天和第20天受调控的唯一SASP因子。
图4.核心衰老特征中基因表达的动态变化。每张图显示了在辐照前和辐照后在指定点的衰老的核心特征中的37个基因之一。所有基因在测试的时间点(辐照后第0天(增殖)、第4天、第10天和第20天)均显示出动态的时间行为。显著地，在所测试的三种细胞类型中，所有基因均显示出相似的趋势：成纤维细胞(黄色)、黑素细胞(红色)和角化细胞(洋红色)。红色的基因对应于在所有测试时间点均达到显著性(p值<＝0.01)的那些基因。
图5.相对于微管蛋白标准化的衰老标志物的基因表达。通过所有样品中的SA-bgal(数据未显示)和至少一个已建立的衰老标志物(LMNB1的下调或p21的上调)证实了衰老。微管蛋白被用作参照基因以计算ΔCt值。A)增殖的(Ctrl)和辐照的(IR)BJ成纤维细胞中的LMNB1和p21的表达。B)增殖的(Ctrl)和阿霉素处理的(Doxo)角化细胞中的LMNB1和p21的表达。C)增殖的(Ctrl)和辐照后4天或10天(分别为d4和d10)HCA2成纤维细胞中的LMNB1和p21的表达。D)增殖的(Ctrl)、辐照(IR)和复制性衰老(RS)黑素细胞中的LMNB1和p21的表达。
图6.相对于BJ成纤维细胞中的微管蛋白标准化的衰老特征的预选基因的基因表达。通过实时PCR测量增殖的(Ctrl)和辐照的(IR，辐照后第10天)BJ成纤维细胞中本发明的衰老特征内不同生物标志物基因的基因表达。根据Livak等人(2001.Methods 25(4))开发的方法使用微管蛋白计算ΔCt值。每种条件包括三个生物学重复，每个重复以技术复制运行。误差棒显示了平均值的标准误差。值得注意的是，结果并不总是统计学上显著的(数据未显示)。
图7.相对于HCA2成纤维细胞中的微管蛋白标准化的衰老特征的预选生物标志物的基因表达。通过实时PCR测量增殖的(Ctrl)和辐照后4天或10天(分别为d4和d10)HCA2成纤维细胞中的衰老特征内不同生物标志物基因的基因表达。根据Livak等人(2001.Methods25(4))开发的方法使用微管蛋白计算ΔCt值。每种条件包括3个生物学重复，每个重复以技术复制运行。误差棒显示了平均值的标准误差。值得注意的是，结果并不总是统计学上显著的(数据未显示。
图8.相对于角化细胞中的微管蛋白标准化的衰老特征的预选生物标志物的基因表达。通过实时PCR测量增殖的(Ctrl)和阿霉素处理的(Doxo)角化细胞中衰老特征内不同生物标志物基因的基因表达。根据Livak等人(2001.Methods 25(4))开发的方法使用微管蛋白计算ΔCt值。每种条件包括两个生物学重复，每个重复以技术复制运行。误差棒显示了平均值的标准误差。值得注意的是，结果并不总是统计学上显著的(数据未显示)。
图9.相对于黑素细胞中的微管蛋白标准化的衰老特征的预选生物标志物的基因表达。通过实时PCR测量增殖的(Ctrl)、辐照的(IR)或复制性衰老的(RS)黑素细胞中的衰老特征内不同生物标志物基因的基因表达。根据Livak等人(2001.Methods 25(4))开发的方法使用微管蛋白计算ΔCt值。每种条件包括3个生物学重复，每个重复以技术复制运行。误差棒显示了平均值的标准误差。值得注意的是，结果并不总是统计学上显著的(数据未显示)。
图10.相对于肌动蛋白标准化的衰老标志物的基因表达。通过所有样品中的SA-bgal(数据未显示)和至少另一种衰老标志物(LMNB1的下调或p21的上调)证实了衰老。肌动蛋白被用作参照基因以计算ΔCt值。A)增殖的(Ctrl)和辐照的(IR)BJ成纤维细胞中的LMNB1和p21的表达。B)增殖的(Ctrl)和阿霉素处理的(Doxo)角化细胞中的LMNB1和p21的表达。C)增殖的(Ctrl)和辐照后4天或10天(分别为d4和d10)HCA2成纤维细胞中的LMNB1和p21的表达。
图11.相对于BJ成纤维细胞中的肌动蛋白标准化的衰老特征的预选基因的基因表达。通过实时PCR测量增殖的(Ctrl)和辐照的(IR，辐照后第10天)BJ成纤维细胞中的衰老特征内的不同基因的基因表达。
图12.相对于HCA2成纤维细胞中的肌动蛋白标准化的衰老特征的预选基因的基因表达。通过实时PCR测量了增殖的(Ctrl)和辐照后4天或10天(分别为d4和d10)HCA2成纤维细胞中的衰老特征内不同基因的基因表达。
图13.相对于角化细胞中的肌动蛋白标准化的衰老特征的预选基因的基因表达。通过实时PCR测量了增殖的(Ctrl)和阿霉素处理的(Doxo)角化细胞中的衰老特征内不同基因的基因表达。
图14.预选基因的ΔCt值的主成分分析(PCA)能够区分衰老的与增殖的细胞。这些基因包括：BCL2L2、C2CD5(引物对扩增变体1、2和6)、DYNLT3、GDNF(引物对扩增变体1)、MTCYB、PLK3、PLXNA3、SUSD6和TSPAN13。A)使用选择的基因的增殖的(Ctrl)和辐照的(IR)BJ成纤维细胞的PCA图。B)使用选定的基因的增殖的(Ctrl)和阿霉素处理的(Doxo)角化细胞的PCA图。C)使用选定的基因的增殖的(Ctrl)和辐照后第4天和第10天(分别为d4和d10)HCA2成纤维细胞的PCA图。D)使用选定的基因的增殖的(Ctrl)、辐照的(IR)和复制性衰老的(RS)黑素细胞的PCA图。
图15.仅6种生物标志物的组(“最小核心特征”)是必须的且足以区分不同细胞类型中的衰老的细胞和增殖的细胞。A)针对每种样品集合计算了图11上的主成分1(X轴)上每种生物标志物基因对样品分离的贡献。对于每种细胞类型(BJ＝BJ成纤维细胞，HCA2＝HCA2成纤维细胞，Ker＝角化细胞，Mel＝黑素细胞)，具有较高贡献的生物标志物评分为“1”，且具有最低贡献的那些评分为“9”。计算了每种生物标志物的总评分，为“1”时生物标志物在所有样品中具有较高的贡献，并且为“9”时生物标志物在所有样品中具有最低的贡献。图B)-E)显示了对于每个样品使用6个最终基因建立的新的PCA图：GDNF(引物对扩增变体1)、TSPAN13、BCL2L2、PLK3、SUSD6和C2CD5(引物对扩增变体1、2和6)。B)增殖的(Ctrl)相对于辐照的(IR)BJ成纤维细胞的衰老的核心转录标志物的PCA图。C)增殖的(Ctrl)相对于阿霉素处理的(Doxo)角化细胞的衰老的核心转录标志物的PCA图。D)增殖的(Ctrl)相对于辐照后第4天或第10天(分别为d4和d10)HCA2成纤维细胞的衰老的核心转录标志物的PCA图。E)增殖的(Ctrl)、辐照的(IR)和复制性衰老的(RS)黑素细胞的衰老的核心转录标志物的PCA图。
图16.衰老的成纤维细胞中的TSPAN13 mRNA表达上调。通过阿霉素(Doxo)、电离辐射(IRIS)、过氧化氢(OSIS)或复制性耗尽(RS)诱导人皮肤成纤维细胞BJ衰老。增殖的(Prolif)或静止的(Quiesc)细胞被用作对照。图A：具有衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-bgal)激活的细胞的百分比。图B：具有活跃的DNA合成(EdU，增殖的报告分子)的细胞的百分比。图C：在微管蛋白mRNA水平标准化后通过qPCR测量的TSPAN13mRNA的水平。N＝3次独立实验。*p<＝0.05，**p<＝0.01。
图17.衰老的成纤维细胞中的TSPAN13蛋白表达上调。通过电离辐射(IR)诱导人皮肤成纤维细胞BJ衰老。9天后，用针对TSPAN13的抗体(绿色)对对照(CTRL)或IR细胞染色，并用DAPI复染对照(CTRL)或IR细胞以显示核(蓝色)。图18.衰老的成纤维细胞中的TSPAN13蛋白表达上调。通过电离辐射(IR)诱导人皮肤成纤维细胞BJ经历衰老。9天后，用针对TSPAN13的抗体对对照(CTRL)或IR细胞染色，并经由流式细胞仪测量信号强度。图A：2个群体的荧光强度的点图。图B：图A中的数据的定量。
图19.衰老的成纤维细胞中的TSPAN13蛋白表达上调。通过阿霉素或帕博西尼诱导人皮肤成纤维细胞WI38衰老，并报告了通过具有衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-bgal，图A)激活的细胞的百分比证实的衰老(与对照细胞相比)诱导，以及显示通过具有活跃的DNA合成(EclU，图B)的细胞百分比证实的衰老(与对照细胞相比)诱导。用针对TSPAN13的抗体对细胞染色，并经由流式细胞仪器测量信号强度。图C：3个群体的荧光强度的点图。图D：定量。
图20.TSPAN13阳性细胞显示其他衰老标志物的增加的表达水平。通过电离辐射(IR)诱导人皮肤成纤维细胞BJ衰老，用针对TSPAN13的抗体染色，并经由流式细胞仪测量信号强度。图(A)中的图显示了与对照细胞(绿色钟)相比，IR细胞(红色钟)中的TSPAN13表达的变化。图(B)显示了具有TSPAN13的高表达(IR+TSPAN13)或低表达(IR-TSPAN13)的IR细胞，其在2个独立的管中进行分选，并分离RNA。当与TSPAN13低表达细胞相比时，TSPAN13高表达细胞显示通过qPCR测量并相对于微管蛋白标准化的高水平的其他衰老标志物p16和p21。
实验部分
材料和方法
细胞株和培养
人***成纤维细胞HCA2获自O.Pereira-Smith(德克萨斯大学健康科学中心，圣安东尼奥市(University of Texas Health Science Center,San Antonio))的实验室；人***成纤维细胞BJ购自ATCC(Cat:CRL-2522)；如先前所述从13.5天的胚胎产生MEF(Demaria2010)；小鼠原代皮肤微血管内皮细胞购自Cellbiologics(Cat:C57-6064)。
在使用前所有细胞均在5％氧气中培养至少4次倍增。在富含10％胎牛血清(FBS,GE Healthcare Life Sciences)和1％青霉素/链霉素(Lonza)的DMEM(Thermo FisherScientific)中培养成纤维细胞。在内皮细胞生长培养基(ATCC)中培养内皮细胞。
通过在补充有0.2％FBS的DMEM中将细胞培养48小时来诱导静止。对于复制性衰老，将细胞传代(以30％-40％的密度重新培养，直到它们达到70％-80％的融合)，直到增殖停止(对于BJ细胞为-65次群体倍增)。对于氧化应激诱导的衰老，将细胞用200uM过氧化氢(Sigma Aldrich)处理2h，然后去除药物，并在补充有10％FBS的新鲜DMEM中培养。在第0、3和6天重复处理，每2天更新培养基，并在第一次处理后第10天收获细胞。以250nM使用阿霉素(Tebu-bio)24h。用补充有10％FBS的DMEM替换培养基，并每2天更新。在处理后第7天收获细胞。对于辐照诱导的衰老，将细胞暴露于使用137铯源10Gyγ-辐照，并每2天更新培养基。
在辐射后第10天收获细胞，以用于大多数实验和验证。对于时间序列，在辐照后第4、10和20天收获细胞。
SA-β半乳糖苷酶测定
将细胞接种在24孔板中，并在戊二醛/甲醛(2％/2％)中固定10-15min，并使用商业试剂盒(Biovision)用X-Gal溶液染色过夜。用1μg/ml 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Sigma-Aldrich,D9542)对细胞复染20min。以100×的放大倍数获取图像，并通过软件ImageJ(www.rsbweb.nih.gov/ij/)对细胞数量计数。对阳性细胞进行手动评分。样品以一式三份进行，每个重复至少计数100个细胞。
EdU染色
在EdU存在下，将细胞培养24h，然后使用商用试剂盒(Click-iT EdU Alexa Fluor488成像试剂盒；Thermo Fisher Scientific)固定并染色。以400×放大倍数获取图像，并使用ImageJ(www.rsbweb.nih.gov/ij/)定量。样品以一式三份进行，每个重复至少计数100个细胞。
实时PCR
使用分离II Rna微型试剂盒(the Isolate II Rna Mini kit,Bioline)制备总RNA。使用试剂盒(Applied Biosystems)将255–500ng的RNA反转录。如[43]所述使用通用探针库系统(Universal Probe Library system,Roche)和SENSIFast探针试剂盒(Bioline)进行qRT-PCR反应。将微管蛋白用于CT值的标准化。所有样品均用使用2-3个生物学重复的技术重复运行。使用未配对的双尾学生t检验来基于ΔCT值确定统计显著性。.05或更小的P值被认为是显著的。
RNAseq
制备了细胞，以用于使用RNAeasy微型试剂盒(Invitrogen)的RNA提取。用Qiasol裂解缓冲液处理样品，并按照制造商的说明书(Invitrogen)使用Qiacube自动机分离总RNA。使用NanoDrop定量RNA，并使用BioAnalyzer芯片(Agilent)测量RNA质量。将纯化的RNA样品送至明尼苏达大学生物医学基因组学中心(the University of MinnesotaBioMedical Genomics Center)，以用于按照制造商的方案(Illumina)进行文库制备(多聚腺苷酸(polyA)富集)和Illumina HiSeq RNA测序。对于-200bp的***片段大小，进行50bp配对末端测序的大小选择，并在HiSeq2500流通池的每泳道≥220M读取下进行测序。在所有样品中，完成的运行的平均质量评分均为>30，每个合并的样品的平均读取数量为>1000万个读取。原始数据已存储在ArrayExpress数据库中(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/；登录号:E-MTAB-5403)。
公共数据集
表Si和S4中是使用的公共数据集和样品的总结。来自公共数据集的原始数据获自“GEO知识库(GEO repository)”。包括了衰老成纤维细胞的转录组的6个公共数据集：1)Alspach等人，2014[16](“GSE56293”)，使用BJ细胞的RS来研究SASP诱导；2)Dikovskaya等人，2015[17](“GSE70668”)，使用IMR90细胞来研究OIS(通过Ras诱导的)中的多核化，并使用有丝***中同步化的细胞；3)Herranz等人，2015[18](“GSE61130”)，研究IMR90细胞中的OIS(通过Ras诱导)中的SASP；4)Marthandan等人，2015[20](“GSE63577”)，使用MRC-5和HFF细胞来研究不同群体倍增水平下鱼藤酮的作用，并且我们仅使用第一个时间点(增殖)和最后时间点的HFF细胞；5)Marthandan等人，2016[19](“GSE64553”)，使用5种成纤维细胞株(BJ、WI-38、IMR90、HFF和MRC-5)来研究RS；6)Rai等人，2014[21](“GSE53356”)，使用IMR90细胞来研究RS的染色质景观。研究了星形胶质细胞中的OSIS的由Crowe等人，2016[30]产生的一个公共数据集(“GSE58910”)被用于不同细胞类型共有的衰老的核心特征。
转录组数据集的质量控制和比对
使用SRA Toolkit 2.6.2将原始数据下载为fastq文件。使用FastQC软件vO.11.5对所有样品(包括我们自己的样品)进行质量控制，并丢弃低质量读取(平均质量：<20)。必要时使用Trimmommatic 0.36进行末端修剪。使用STAR-2.5.1b比对仪将样品与GRCh38基因组比对，并直接从STAR输出获得原始读取计数表。分析中仅包括注释为蛋白质编码基因。
成纤维细胞的荟萃分析
用蛋白质编码基因的对数转换的标准化的计数的PCA图评估数据的异质性。对于特异性刺激和成纤维细胞衰老特征的荟萃分析，我们使用了三种方法：负二项式广义线性模型(GLM)、Fisher p值组合和反正态p值组合。第一种方法使用R包DESeq2进行差异表达分析，其使用衰老相对于增殖作为主变量。在使用多于一种细胞类型的情况下，将细胞类型纳入作为协变量。
其他两种方法使用了R包荟萃RNAseq。首先，对每个数据集使用DESeq2包进行差异表达分析，并通过两种方法将p值组合：Fisher和反正态。将具有在负二项式GLM中的经多重测试调整(使用Benjamini-Hochberg程序)的p值<＝0.01以及在其他两种方法中的组合的p值<＝0.01的基因包括在相应的特征中。在荟萃分析完成后，去除在静止样品中也被差异调控(调整的p值<＝0.01以及与衰老相同的方向上的倍数变化的迹象)的作为衰老标志物的基因。使用Consensus Path DB-human(http://cpdb.molgen.mpg.de/)的在线工具“过度代表分析(Over-representation analysis)”来评估成纤维细胞衰老特征中差异表达基因中的富集的通路和基因本体条目。
不同细胞类型共有的核心衰老特征
还用DESeq2对每个数据集单独进行了差异表达分析，并将差异表达基因的列表与成纤维细胞的衰老特征进行比较，而没有合并p值。仅将在每个数据集和成纤维细胞特征中的具有多重测试调整的p值<＝0.01(负二项式GLM方法)的基因包括在核心衰老特征中。
图
所有图均使用以下R包制作：“pheatmap”、“ggplot2”、“ggfortify”、“RColorBrewer”和“维恩图(VennDiagram)”。
实施例2：识别衰老细胞的最小核心特征。
本实施例描述了衰老特征内不同生物标志物基因的基因表达的分析，以获得“最小核心衰老特征”，其包含区分衰老细胞与非衰老细胞所必需且足够的生物标志物的组。
为此目的，通过实时PCR测量了经历衰老的4种不同细胞类型中的在实施例1中鉴定的预选生物标志物的集合：
·HCA2成纤维细胞：对照相对于辐照后第4天和第10天
·BJ成纤维细胞：对照相对于辐照的
·黑素细胞：对照相对于辐照的和复制性衰老的(以一式三份)
·角化细胞：对照相对于阿霉素处理的(以一式两份)
材料和方法
细胞株和培养。人***成纤维细胞BJ、人新生黑素细胞和人新生角化细胞购自ATCC(分别为Cat:CRL-2522、PCS-200-012和PCS-200-010)。在富含10％胎牛血清(FBS,GEHealthcare Life Sciences)和1％青霉素/链霉素(Lonza)的DMEM培养基(Thermo FisherScientific)中培养BJ成纤维细胞。在不添加抗生素的CnT-Prime上皮培养基(CellnTec,CnT-PR)中培养角化细胞。在富含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素，并补充有200nM12-O-十四烷酰佛波醇13-乙酸酯(TPA,Sigma-Aldrich)、200nM霍乱毒素(Sigma-Aldrich)、10nM内皮素1(Sigma-Aldrich)和10ng/ml人干细胞因子(Peprotech)的RPMI培养基中培养黑素细胞。在5％氧气、5％CO2和37℃下培养所有细胞，并定期测试支原体感染。
样品制备。对于电离辐射诱导的衰老(IRIS)，使用137铯源对细胞进行10Gy剂量的γ-辐射，并且每2天更新培养基。在辐照后第4天和/或第10天收获细胞。对于复制性衰老(RS)，使细胞在培养物中繁殖～4个月(在每次它们达到70-80％融合时以30-40％密度重新培养)，直到它们停止生长(～PD 65)。以250nM的浓度使用阿霉素(Tebu-bio)24小时。用它们相应的培养基洗涤细胞一次，然后添加新培养基并每两天更新一次。在处理后第7天收获细胞。刺激细胞产生每种条件的增殖对照，其具有所处理样品相同的PD或在阿霉素的情况下用媒介物(PBS)处理。
通过SA-βgal测定证实衰老。将细胞接种在24孔板中，在戊二醛和甲醛(2％/2％)的混合物中固定3-5分钟，并使用商业试剂盒(Biovision)用X-Gal溶液染色过夜。用1pg/ml4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Sigma-Aldrich,D9542)溶液将细胞复染20min。以100×放大倍数获取图像，并通过软件ImageJ(www.rsbweb.nih.gov/ij/)对细胞数量计数。手动计数阳性细胞的数量。未显示SA-bgal染色的数据。
实时PCR。使用分离II Rna微型试剂盒(Bioline)制备总RNA。使用试剂盒(AppliedBiosystems)将100-500ng的RNA反转录为cDNA。根据制造商的说明书如使用通用探针文库系统(Roche)和SENSIFast探针试剂盒(Bioline)进行qRT-PCR反应。将微管蛋白或肌动蛋白的表达用于标准化CT值的表达。用技术重复并以2-3个生物学重复运行样品。将未配对的双尾学生t检验用于基于ΔCT值确定统计显著性。
主成分分析(PCA)：基于qPCR结果中增殖的细胞和衰老的细胞间表达中变化的再现性预选用于主成分分析的基因。将在大多数样品中遵循与通过原始分析所预测的(基于RNAseq结果)相同趋势的基因用于建立PCA图。这些基因包括：BCL2L2、C2CD5(引物对扩增变体1、2和6)、DYNLT3、GDNF(引物对扩增变体1)、MTCYB、PLK3、PLXNA3、SUSD6和TSPAN13。针对每个样品集合，计算主成分1(X轴)上每个基因对样品分离的贡献。具有较高贡献的基因评分为“1”，且具有最低贡献的基因评分为“9”。建立了用于分析的所有样品的列表，并且计算了基于所有样品的每个基因的总评分，为“1”时基因在所有样品中具有较高的贡献，且为“9”时基因在所有样品中具有最低的贡献。最后，将评分排最后(7、8和9)的3个基因丢弃。使用6个最终的基因建立新的PCA图：GDNF(引物对扩增变体1)、TSPAN13、BCL2L2、PLK3、SUSD6和C2CD5(引物对扩增变体1、2和6)。
使用的引物列表：
材料：
结果
图6通过分析相对于微管蛋白标准化的至少建立的衰老标志物(LMNB1的下调或p21的上调)证实了研究条件下每个细胞样品的衰老。
图7-9显示了如通过实时PCR测量的相对于BJ成纤维细胞(图7)、HCA2成纤维细胞(图8)和角化细胞(图9)中的微管蛋白标准化的衰老特征的预选生物标志物基因的基因表达。根据Livak等人(2001.Methods 25(4))开发的方法使用微管蛋白计算ΔCt值。每种条件包括3个生物学重复，每个重复以技术复制运行。误差棒显示了平均值的标准误差。值得注意的是，结果并不总是统计学上显著的(数据未显示)。
图10通过分析相对于肌动蛋白标准化的至少建立的衰老标志物(LMNB1的下调或p21的上调)证实了研究条件下每个细胞样品的衰老。
图11-13显示了如通过实时PCR测量的相对于BJ成纤维细胞(图11)、HCA2成纤维细胞(图12)和角化细胞(图13)中的肌动蛋白标准化的衰老特征的预选生物标志物基因的基因表达。根据Livak等人(2001.Methods25(4))开发的方法使用微管蛋白计算ΔCt值。每种条件包括3个生物学重复，每个重复以技术复制运行。误差棒显示了平均值的标准误差。值得注意的是，结果并不总是统计学上显著的(数据未显示)。
其后，基于qPCR结果中增殖的细胞和衰老的细胞间表达中变化的再现性预选用于主成分分析的生物标志物基因。将在大多数样品中遵循与通过原始分析预测的(基于RNAseq结果)相同趋势(上调或下调，而与统计显著性无关)的基因用于建立相对于微管蛋白标准化的ΔCt值的PCA图。这些生物标志物包括BCL2L2、C2CD5(引物对扩增变体1、2和6)、DYNLT3、GDNF(引物对扩增变体1)、MTCYB、PLK3、PLXNA3、SUSD6和TSPAN13。参见图14，其显示了BJ成纤维细胞、角化细胞、HCA成纤维细胞和黑素细胞的PCA图。
最后，通过计算样品的每个集合分析图14上主成分1(X轴)上的每个基因对样品分离的贡献，鉴定了仅6个生物标志物基因(最小核心特征)的集合。对于每种细胞类型(BJ＝BJ成纤维细胞，HCA2＝HCA2成纤维细胞，Ker＝角化细胞，Mel＝黑素细胞)，具有最高贡献的生物标志物基因评分为“1”，且具有最低贡献的基因评分为“9”。计算了每个基因的总评分，为“1”时基因在所有样品中具有较高的贡献，且为“9”时基因在所有样品中具有最低的贡献。丢弃评分排最后(红色)的3个基因。这产生了包含生物标志物TSPAN13、GDNF、C2CD5、SUSD6、BCL2L2和PLK3的集合(参见图15)。
实施例3：衰老细胞上TSPAN13表达增加。
TSPAN13是一种功能未充分表征的细胞表面蛋白。
本实施例证明了TSPAN13与细胞衰老关联。
图16显示了在不同类型的衰老细胞中TSPAN13的mRNA水平增加。在图17中，我们通过使用免疫荧光表明TSPAN13蛋白被更多地表达。使用流式细胞术和另外的细胞/刺激分析，图18和19指示了相似的TSPAN13的上调。在图20中，基于TSPAN13的高表达或低表达使用流式细胞术来分选衰老细胞群。有趣地是，发现增加的TSPAN13水平与增加的其他衰老标志物p16和p21的水平相关。
基于它的细胞表面定位，TSPAN13是用于药物靶向的理想选择。例如，可以配置用于杀死衰老细胞的药物缀合物，其包含：(i)TSPAN13靶向剂，其在使用时特异性靶向并结合TSPAN13，以及(ii)细胞毒性剂，其杀死所结合的衰老细胞。
实验条件
基因表达TSPAN13(图16)
人***成纤维细胞BJ购自ATCC(Cat:CRL-2522)。在5％氧气、5％CO2和37C下，并使用富含10％胎牛血清(FBS,GE Healthcare Life Sciences)和1％青霉素/链霉素(Lonza)的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)培养细胞。定期测试细胞的支原体感染。
样品制备。通过在补充0.2％FBS的DMEM中培养细胞48小时来诱导静止。对于电离辐射诱导的衰老(IRIS)，使用137铯源对细胞进行10Gy剂量的γ辐射，并每2天更新培养基。在辐照后第10天收获细胞。对于复制性衰老(RS)，使细胞在培养物中繁殖～4个月(在每次它们达到70-80％融合时以30-40％的密度重新培养)，直到它们停止生长(～PD 65)。对于氧化应激诱导的衰老(OSIS)，用200μM过氧化氢(Sigma Aldrich)处理细胞2小时，然后去除药物并在补充10％FBS的新鲜DMEM中培养。在第0天、第3天和第6天重复处理，中间每2天更新培养基，并在第一次处理后的第10天收获细胞。
以250nM的浓度使用阿霉素(Tebu-bio)24小时。然后将培养基更换为补充10％FBS的正常DMEM，并每2天更新。在处理后的第7天收获细胞。
刺激细胞产生每种条件的增殖对照，用相应的媒介物和/或考虑所处理的样品的相同PD。当对于多种条件仅显示一个对照时，它代表了每种条件的对照的平均值。
SA-6gal测定。将细胞接种在24孔板中，在戊二醛和甲醛(2％/2％)的混合物中固定10-15分钟，并使用商业试剂盒(Biovision)用X-Gal溶液染色过夜。用1pg/ml 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Sigma-Aldrich,D9542)溶液将细胞复染20min。以100×放大倍数获取图像，并通过软件ImageJ(www.rsbweb.nih.gov/ij/)对细胞数量计数。手动计数阳性细胞的数量。
EdU染色。在EdU存在下，将细胞培养24小时，并使用商业试剂盒(Click-iT EdUAlexa Fluor 488成像试剂盒；Thermo Fisher Scientific)固定并染色。以400×放大倍数获取图像，使用ImageJ(www.rsbweb.nih.gov/ij/)定量。在所有情况下，对于SA-6gal测定和EdU染色，样品以一式三份进行，并且在每个重复中计数至少100个细胞，并生成了相应的条形图，其中误差棒代表平均值的标准误差(SEM)。
使用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems,cat#4368813)进行实时PCR 反转录酶PCR。使用LC480(Roche)和SensiFAST探针Lo-ROX试剂盒(Bioline,cat#84020)进行TSPAN13的qPCR。将微管蛋白用作参照基因。引物：TSPAN13，F–CCCTCAACCTGCTTTACACC，R–AATCAGCCCGAAGCCAAT，UPL探针#84；微管蛋白，F–CTTCGTCTCCGCCATCAG，R–CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC，UPL探针#40。将未配对的双尾学生t检验用于基于ΔCT值确定统计显著性。.05或更小的P值被认为是统计学上显著的。
TSPAN13表达的免疫荧光(IF)分析(图17)
以每片盖玻片(Sarstedt,cat#83.1840.002)15.000个细胞的密度接种9d IR和对照BJ细胞，并在细胞培养恒温箱(5％氧气)中孵育过夜。第二天，用PBS洗涤细胞并在4％PFA/PBS中固定。将细胞储存在4℃直到IF。
将含5wt％BSA(Sigma)的PBS用作封闭缓冲剂和抗体稀释剂。1hr封闭之后，在4℃下使用兔抗人TSPAN13抗体(Genetex,cat#52155)作为一抗(在抗体稀释剂中1:50稀释)孵育过夜。使用的二抗为山羊抗兔AlexaFluor488(Thermo Fisher Scientific,cat#R37116)。在黑暗中轻微搅拌孵育90分钟。在用PBS洗涤3次并用MilliQ水洗涤1次后，使用具有DAPI的ProLong Gold Antifade封固剂(Thermo Fisher Scientific,cat#P36941)将盖玻片装在载玻片上。使用Leica DMI6000制作图像。
TSPAN13表达的FACS分析(图18)
将对照BJ细胞和8d IR BJ细胞固定在70％乙醇中，并储存在4℃直到FACS分析。所有其他的孵育均在4℃下进行。使用的FACS缓冲液为含1％BSA的PBS。所有洗涤步骤均在400μl FACS缓冲液中，在800×g、4摄氏度下5分钟。将100万个对照BJ细胞和600.000个8d IRBJ细胞用于FACS分析。使用的一抗为兔抗人TSPAN13抗体(Genetex,cat#52155，在FACS缓冲液中1:20稀释)。用一抗孵育1h。在一抗和二抗孵育之间进行3次洗涤步骤。使用的二抗是山羊抗兔AlexaFluor488(Thermo Fisher Scientific,cat#R37116)。在黑暗中孵育30分钟。在将细胞通过细胞过滤器盖转移至FACS管(Corning,cat#352235)之前，进行3次洗涤步骤。使用BD FACS CANTO II测量荧光信号。使用Kaluza软件(Beckman Coulter)进行FACS数据分析。
TSPAN13–细胞膜表达(图19)
将对照WI-38细胞、7d帕博西尼(Palbocichb)(在用1uM每天处理后)和7d阿霉素处理的WI-38细胞用于经由FACS分析细胞膜上的TSPAN13表达。收获后，用PBS洗涤细胞，并随后在FACS缓冲液(含1％BSA和0.1％NaN3的PBS)中洗涤。所有洗涤步骤均在400μl FACS缓冲液中，在800×g、4℃下3分钟。在4℃下进行所有其他的孵育，除非另有陈述。使用的一抗是兔抗人TSPAN13抗体(Genetex,cat#52155，在FACS缓冲液中1:50稀释)：孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，并在室温下在含4％多聚甲醛(Thermo Fisher Scientific,cat#28908)的PBS中固定15分钟。用FACS缓冲液洗涤3次后，将细胞于4℃下储存在PBS中。使用山羊抗兔AF633(Thermo Fisher Scientific,cat#A21070)进行二抗孵育30分钟。在将细胞通过细胞过滤器盖转移至FACS管(Corning,cat#352235)之前进行3次洗涤步骤。使用BD FACS CANTOII测量荧光信号。使用Kaluza软件(Beckman Coulter)进行FACS数据分析。
分选表达TSPAN13的细胞(图20)
将对照BJ细胞和9d IR BJ细胞用于分选相对于TSPAN13阴性群体，代表阳性群体(TSPAN13的细胞膜染色)的具有TSPAN13表达的细胞。细胞未被固定，并在收获细胞的同一天分选TSPAN13表达。FACS缓冲液为含1％BSA的PBS，且洗涤步骤在FACS缓冲液中：在800×g、4℃下3分钟。所有孵育均在4℃下进行。使用的一抗是兔抗人TSPAN13抗体(Genetex,cat#52155，在FACS缓冲液中1:50稀释)：孵育1hr。在使用山羊抗兔AlexaFluor488(ThermoFisher Scientific,cat#R37116)的二抗孵育之前用FACS缓冲液洗涤3次。在黑暗下孵育30分钟。在将细胞通过细胞过滤器盖转移至FACS管(Corning,cat#352235)之前进行3次洗涤步骤。测量荧光信号，并使用BD FACS JAZZ将细胞分选至来自分离II RNA微型试剂盒(Bioline,cat#52073)的RNA裂解缓冲液中。使用Kaluza软件(Beckman Coulter)进行FACS数据分析。根据手册进行RNA分离。使用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems,cat#4368813)进行反转录酶PCR。使用LC480(Roche)和SensiFAST探针Lo-ROX试剂盒(Bioline,cat#84020)进行2个细胞周期阻滞基因(p16和p21)和TSPAN13的qPCR。将微管蛋白用作参照基因。引物：p16，F–GAGCAGCATGGAGCCTTC，R–CGTAACTATTCGGTGCGTTG，UPL探针#67；p21，F–TCACTGTCTTGTACCCTTGTGC，R–GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA，UPL探针#32；TSPAN13，F–CCCTCAACCTGCTTTACACC，R–AATCAGCCCGAAGCCAAT，UPL探针#84；微管蛋白，F–CTTCGTCTCCGCCATCAG，R–CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC，UPL探针#40。