阅读说明：本技术 dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用 (dsRNA (double-stranded ribonucleic acid) and application thereof in controlling aedes aegypti ) 是由 韩谦 陈静 廖承红 卢浩然 王金花 赵建国 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体涉及dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用。本发明采用伊蚊表皮结构基因或其基因片段的dsRNA片段浸泡埃及伊蚊幼虫,经统计埃及伊蚊幼虫死亡率高达98.3％,结果表明,伊蚊表皮结构基因的双链RNA干扰片段(dsRNA)可有效地阻断埃及伊蚊的mRNA表达,对埃及伊蚊具有较强的致死性,为防控蚊虫提供了新的靶点。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to dsRNA (double-stranded ribonucleic acid) and application thereof in controlling Aedes aegypti. The invention adopts the dsRNA segment of the aedes epidermis structural gene or the gene segment thereof to soak the larvae of aedes aegypti, and the statistical mortality rate of the larvae of aedes aegypti reaches 98.3 percent, and the result shows that the double-stranded RNA interference segment (dsRNA) of the aedes aegypti epidermis structural gene can effectively block the mRNA expression of aedes aegypti, has stronger lethality to aedes aegypti and provides a new target for preventing and controlling mosquitoes.)

dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用。

背景技术

昆虫是最成功的生物类别之一，占所有陆地物种的近60％，因为它们能够适应各种各样的栖息地(Cornman&Willis,2009)。它们成功栖息的关键是其表皮的存在，昆虫表皮是保护软组织的关节外骨骼，具有显着的生物力学特性，覆盖昆虫整个体表，具有防御病原体和不利的环境因素等功能(Gallot et al.,2010；Moussian,2010；Xiong et al.,2017)。昆虫表皮主要由几丁质和表皮蛋白(CPs)组成，CPs分为结构蛋白和非结构蛋白两种，这些蛋白质通常具有重要的生物学功能，如体形测定，表皮的完整性，机械性能的维持，运动能力和昆虫的适应性等(Jasrapuria et al.,2010；Vannini&Willis,2016)。

埃及伊蚊是一种入侵性蚊种，在世界范围内造成了大范围的人员伤亡，其最初是毁灭性黄热病流行的媒介，因此它的俗称是“黄热病蚊子”。如今，埃及伊蚊还是登革热、基孔肯亚和寨卡病毒的主要传播媒介。登革热是世界上最主要和最普遍的虫媒病毒之一，据估计每年在热带和亚热带地区发生3.9亿登革病毒感染病例，在128个国家，高达55％的世界人口面临感染的危险，其中8.24亿人生活在城市环境中。在没有有效的治疗药物和疫苗的情况下，目前控制埃及伊蚊病毒媒介的主要方式是预防和控制登革热病毒的传播，控制病媒的主要方式很大程度上依赖化学试剂，长期使用造成了大范围的抗药性，研究埃及伊蚊相关基因可以帮助研究从生物学(遗传)角度控制蚊虫。

RNAi是双链RNA(dsRNA)介导的真核表达沉默机制，dsRNA递送到细胞后，被切割成短(约21NT)干扰RNAs，然后将短干扰RNA结合到RNA诱导的沉默复合物中，该复合物促进互补mRNA序列的结合和切割，从而防止基因的翻译。RNAi具有易于应用，高度特异性定位和环境友好型等特点，这使得RNAi方法成为控制有害昆虫的一种较为理想的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用。本发明通过埃及伊蚊表皮结构基因或其基因片段的dsRNA触发的基因沉默来抑制表皮结构基因的表达，从而干扰埃及伊蚊的正常的生长发育，进而实现对埃及伊蚊的防治，为防控蚊虫提供了新的靶点。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

埃及伊蚊表皮结构基因或其基因片段的dsRNA在防治埃及伊蚊中的应用。

本发明中，所述埃及伊蚊表皮结构基因为AaCPR100A，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一些实施方案中，所述基因片段为AaCPR100A基因的片段，具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

埃及伊蚊表皮结构基因AaCPR100A，其cDNA编码区全长765bp，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其编码的蛋白如genbank号XP_001662974所示。本发明在

具体实施方式

中，扩增了序列如SEQ ID NO.2所示的AaCPR100A基因中489bp的片段，构建了包含该基因片段的表达载体，并将该载体转化宿主菌，诱导宿主菌表达dsRNA片段，利用该dsRNA片段浸泡埃及伊蚊幼虫。结果显示，埃及伊蚊幼虫死亡率高达98.3％。以上结果表明，埃及伊蚊表皮结构基因的dsRNA可有效防治埃及伊蚊，为防控蚊虫提供了新的靶点。

本发明还提供一种防治埃及伊蚊的dsRNA，由SEQ ID NO.2所示的AaCPR100A的基因片段转录而成，所述dsRNA具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种重组表达载体，包含转录SEQ ID NO.3所示的dsRNA的DNA，即包含SEQ ID NO.2所示的AaCPR100A的基因片段。

其中，所述重组表达载体的骨架为PL4440载体。

在一些具体实施例中，所述重组表达载体如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种转化有所述的重组表达载体的宿主菌。

所述重组表达载体以PL4440载体为骨架，含有SEQ ID NO.2所示的AaCPR100A的基因片段，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一些具体实施例中，所述宿主菌为HT115菌株。

本发明提供一种防治埃及伊蚊的方法，包括：以提取的埃及伊蚊幼虫、蛹和成蚊的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO:5所示的上游引物和具有SEQ ID NO:6所示的下游引物扩增，得到SEQ ID NO.2所示的DNA分子，构建含SEQ ID NO.2所示的DNA分子的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主菌，诱导宿主菌表达dsRNA片段，收集表达所述dsRNA片段的宿主菌，提取、纯化后获得dsRNA片段；取所述dsRNA片段加水稀释，用稀释液浸泡埃及伊蚊幼虫。

在一些实施方案中，所述埃及伊蚊表皮结构基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述诱导为：

37℃振荡培养4-6h；所述振荡培养的转速为180rpm。

在一些实施方案中，所述稀释液中dsRNA片段的浓度为0.02～0.1mg/mL。在一些实施方案中，所述稀释液中dsRNA片段的浓度优选为0.05～0.1mg/mL，进一步优选为0.08～0.1mg/mL，更优选为0.1mg/mL。

本发明提供埃及伊蚊表皮结构基因的dsRNA在防治埃及伊蚊中的应用，本发明采用伊蚊表皮结构基因的dsRNA片段浸泡埃及伊蚊幼虫，经统计埃及伊蚊幼虫死亡率高达98.3％，结果表明，伊蚊表皮结构基因的双链RNA干扰片段(dsRNA)可有效地阻断埃及伊蚊的mRNA表达，对埃及伊蚊具有较强的致死性，为防控蚊虫提供了新的靶点。

具体实施方式

本发明公开了一种dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 AaCPR100A-PL4440表达载体的构建

试验材料：Trizol Reagent(Sangon)，PrimeScript^TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara)，5High-Fidelity 2×master mix(BioLabs_Inc)，PMD18-T(Takara)，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(Sangon)，琼脂糖(Biowest)，SanPrep柱式质粒DNA胶回收试剂盒(Sangon)，DNA ligation(Takara)

试验方法：

1.1总RNA的提取

用无酶管收取埃及伊蚊幼虫、蛹和成蚊

Trizol法提取已收集样品的总RNA的过程：

(1)用未灭菌的DEPC水浸泡小钢珠过夜，高温高压灭菌；

(2)向收集的样品的无酶管中加入200μl trizol和5-7颗小钢珠(小钢珠数量覆盖样品即可)；

(3)放入研磨器中打碎；

(4)将Trizol补足至1mL，室温裂解5min；

(5)加入200μL三氯甲烷，剧烈振荡15s，室温放置3min；

(6)4℃离心10min，小心吸取上清到新的无酶离心管中，加入等体积提前预冷的异丙醇，充分混匀，室温20min；

(7)4℃离心10min，弃上清；

(8)加1mL提前预冷的DEPC水配制的75％酒精，充分洗涤；

(9)4℃离心3min，弃上清，干燥酒精，加30-50μLDEPC水溶解，跑胶检测提取质量，负八十冰箱保存以备后用。

1.2 cDNA第一条链的合成

模板RNA变性反应

表1

65℃保温5min，冰上迅速冷却

表2

42℃60min，短片段：95℃5min后冰上冷却，负二十保存。

1.3 PCR扩增目的条带

分别扩增AaCPR100A(引物F：CCGCTCGAGTAGCGGCTAGTGCCCAGTATA，SEQ ID NO:5；引物R：ACGGGAGTGTTGCTGACTGAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA，SEQ ID NO:6)及Gus基因(作为阴性对照)，反应体系及反应温度相同，反应模板不同，AaCPR100A所用模板为反转录的埃及伊蚊的cDNA，产物大小：约500bp；Gus所用模板为:质粒pBI121，产物大小：401bp。反应体系如表3所示。

表3

PCR反应条件：98℃预变性2min，98℃10s，52℃30s，72℃45s，30个循环后，72℃延伸10min，跑胶检测。

1.4胶回收

(1)1％琼脂糖核酸电泳检测，割取目的片段(保证所用工具的清洁)，放入离心管中，称重；

(2)每100mg琼脂糖加入300μL Buffer B2；

(3)50℃水浴5-10min，期间不断混匀，直至胶块儿完全融化即可；

(4)当目的片段<500bp时，加入所使用的Buffer B2三分之一体积的异丙醇，颠倒混匀，当目的片段≥500bp时，可忽略此步骤；

(5)将融化后的溶液全部移入吸附柱，8000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；

(6)向收集管中加入300μL Buffer B2，9000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；

(7)向吸附柱中加入500μL wash Solution,9000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；

(8)重复步骤7(此步不可省略)；

(9)将空吸附柱和离心管放入离心机，9000×g离心1min；

(10)提前60℃预热ddH₂O，在吸附膜中央加入30μL ddH₂O，室温静置1-2min，9000×g离心1min，将所得DNA于负二十冰箱保存。

1.5加A反应

表4

将上述溶液混匀，72℃30min，跑胶检测并回收。

1.6 TA克隆

表5

将上述溶液混匀，16℃水浴连接1h。

1.7 DH5α的制备及转化

(1)配制LB固体培养基，将原始感受态DH5α划线于无抗生素的LB固体培养基，37℃培养16-24h。

(2)挑取单个菌落于5mL无抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16h。

(3)取2mL菌液加入100mL无抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌体OD₆₀₀为0.5.

(4)将菌液于冰上放置10min，使其冷却至0℃。

(5)4000rpm，4℃离心10min，倒掉上清。

(6)加入10mL预冷的0.1M氯化钙，重悬菌体，于冰上静置30min。

(7)4000rpm，4℃离心10min，倒掉上清。

(8)用2ml氯化钙重悬菌体，加入860uL预冷的50％甘油，混匀，分装到1.5mL离心管中，每管100μL，于负八十保存。

(9)取新制备的感受态DH5α，置于冰上，每50uL感受态中加入10uL连接体系，冰上静置30min。

(10)42℃金属浴45s，冰上静置3-5min。

(11)加入500μL无抗生素的LB液体培养基，摇床37℃振荡培养1h。

(12)涂板，涂到含有氨苄(AMP)抗生素的LB固体培养基中，于37℃倒置培养过夜。

1.8质粒提取

(1)挑单个菌落于5mL含有AMP的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16h；

(2)使用生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒DNA的提取，取1.5-5mL菌液，8000×g室温离心2min，收集菌体，倒尽培养基；

(3)在菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，吸打至彻底悬浮菌体；

(4)加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒混匀5-10次，室温静置2-4min。

(5)加入350μl Buffer P3，立即温和颠倒混匀5-10次；

(6)1200×g离心10min，将上清小心全部移入吸附柱中，9000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；

(7)(可选步骤)在吸附柱中加入500uL去蛋白液Buffer DW1，9000×g离心30，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；

(8)向吸附柱中加入500uL Wash Solution，9000×g离心30，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；

(9)重复步骤8一次；

(10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min；

(11)在吸附膜中央加入60uL提前60℃预热的ddH₂O，室温静置1-2min，9000×g离心1min，将所得质粒于负二十冰箱保存。

1.9双酶切检测及测序检验

将TA克隆所得质粒及载体PL4440(空载体)进行双酶切，酶切体系如下：

表6

将上述溶液混匀，于37℃酶切1h，跑胶检测并回收。

表7

将上述溶液混匀，于37℃酶切1h，跑胶检测并回收。

1.10连接，感受态DH5α转化，双酶切检测

将上述双酶切的目的条带以及双酶切的PL4440载体(干扰所用载体，具有双向T7启动子)分别进行胶回收(步骤同上)，回收后进行连接，连接体系如下：

表8

将上述溶液混匀，于16℃水浴过夜，将连接体系于感受态DH5α中进行转化(步骤如上所述)，挑取单菌落，提质粒后进行双酶切检测。

实施例2感受态HT115的制备、重组载体的转化、酶切检测和测序

2.1与制备感受态DH5α的过程相似，区别是在用LB液体培养基培养菌体时需加入四环素，制备好的感受态HT115于负八十保存。

2.2用感受态HT115转化重组质粒，50uL HT115感受态中加入2uL重组质粒，冰上30min，42℃45s，冰上3-5min，加入500uL无抗LB液体培养基，37℃振荡培养1h，涂到含有AMP和四环素的LB固体平板上，37℃倒置培养12-16h。挑单克隆，于LB液体培养基37℃培养，于负八十保存菌种，提取质粒，双酶切检测后送去测序，确保目的基因序列的准确性和完整性。

实施例3埃及伊蚊表皮结构基因的dsRNA的提取

取实施例2转化后的保存的HT115菌种在冰上进行解冻，于150mL含有氨苄和四环素的LB液体培养基中37℃振荡培养其至OD₆₀₀的值为0.4-0.6，加入0.6mmoL IPTG继续在37℃振荡培养4-6h，进行dsRNA的诱导表达，4℃离心得菌体，Trizol法提取菌液的dsRNA(具体方法同上所述)，跑胶检测，将所提取的dsRNA负八十保存以备后续实验。

实施例4AaCPR100A的dsRNA对埃及伊蚊的防治

取实施例3提取的dsRNA片段，使用12孔细胞培养板培养埃及伊蚊幼虫，每孔8-10只，分别采用0.02，0.05，0.08和0.1mg/mL浓度的dsRNA对埃及伊蚊幼虫进行浸泡，每天浸泡1个小时，然后饲喂正常饲料，观察实验结果。

经统计，采用0.1mg/mL浓度的dsRNA浸泡的幼虫，死亡率高达98.3％，采用0.02mg/mL浓度的dsRNA浸泡的幼虫，死亡率达41.6％，0.05mg/mL浓度的dsRNA浸泡的幼虫，死亡率达53.3％，采用0.08mg/mL浓度的dsRNA浸泡的幼虫，死亡率达70％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南大学

<120> dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用

<130> MP1904965

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttcagat ttattgtggt atcaacgttg ttggtagcgg ctagtgccca gtataatgga 60

tataaccgtg atcccaagac agttgcgatc gtaagcgagc agcggtacct tgccggagat 120

ggacagttcg gtgctgctta cgatcaggaa gatggaacca acttcaagga ggaaacggat 180

gctgatggca accgccgagg atcctacagc taccttgatc catctggaca aagaagaacc 240

atctcctacg ttgctggcaa aaatggattc caagcttcgg gagatcatct gcctgtagcc 300

cctgctgctc caccagcacc agctcatgct gcccctcagc cacaatacag acaacaggct 360

cagccacaat accaacaaca ggctcagcca cagtatcaac agcaggctca accccaatat 420

aactttgatc accagggccg cagctatgac aaccaaggct atgaagatgg acagtacgat 480

cctcgttgga acgatccctc tttcagtcag caacactccc gtcctactgc agctcccgtt 540

gtaactccag ctccagttca aaactaccat catcagccag ctccaatcga aaactatcac 600

cgccagcagc cagctcaagc cccagttccc cagaactatc accatgcgtc tccccagcca 660

cagcaggaat ggactaccca ggccccacat cgattccagc caccaggaaa actccagctg 720

aacagaactc ccgacggttt cagctacacc ttcaacaagg tttaa 765

<210> 2

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtagcggcta gtgcccagta taatggatat aaccgtgatc ccaagacagt tgcgatcgta 60

agcgagcagc ggtaccttgc cggagatgga cagttcggtg ctgcttacga tcaggaagat 120

ggaaccaact tcaaggagga aacggatgct gatggcaacc gccgaggatc ctacagctac 180

cttgatccat ctggacaaag aagaaccatc tcctacgttg ctggcaaaaa tggattccaa 240

gcttcgggag atcatctgcc tgtagcccct gctgctccac cagcaccagc tcatgctgcc 300

cctcagccac aatacagaca acaggctcag ccacaatacc aacaacaggc tcagccacag 360

tatcaacagc aggctcaacc ccaatataac tttgatcacc agggccgcag ctatgacaac 420

caaggctatg aagatggaca gtacgatcct cgttggaacg atccctcttt cagtcagcaa 480

cactcccgt 489

<210> 3

<211> 489

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

guagcggcua gugcccagua uaauggauau aaccgugauc ccaagacagu ugcgaucgua 60

agcgagcagc gguaccuugc cggagaugga caguucggug cugcuuacga ucaggaagau 120

ggaaccaacu ucaaggagga aacggaugcu gauggcaacc gccgaggauc cuacagcuac 180

cuugauccau cuggacaaag aagaaccauc uccuacguug cuggcaaaaa uggauuccaa 240

gcuucgggag aucaucugcc uguagccccu gcugcuccac cagcaccagc ucaugcugcc 300

ccucagccac aauacagaca acaggcucag ccacaauacc aacaacaggc ucagccacag 360

uaucaacagc aggcucaacc ccaauauaac uuugaucacc agggccgcag cuaugacaac 420

caaggcuaug aagauggaca guacgauccu cguuggaacg aucccucuuu cagucagcaa 480

cacucccgu 489

<210> 4

<211> 3179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacctggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag accggcagat ctgatatcat 60

cgatgaattc gagctccacc gcggtggcgg ccgcgtagcg gctagtgccc agtataatgg 120

atataaccgt gatcccaaga cagttgcgat cgtaagcgag cagcggtacc ttgccggaga 180

tggacagttc ggtgctgctt acgatcagga agatggaacc aacttcaagg aggaaacgga 240

tgctgatggc aaccgccgag gatcctacag ctaccttgat ccatctggac aaagaagaac 300

catctcctac gttgctggca aaaatggatt ccaagcttcg ggagatcatc tgcctgtagc 360

ccctgctgct ccaccagcac cagctcatgc tgcccctcag ccacaataca gacaacaggc 420

tcagccacaa taccaacaac aggctcagcc acagtatcaa cagcaggctc aaccccaata 480

taactttgat caccagggcc gcagctatga caaccaaggc tatgaagatg gacagtacga 540

tcctcgttgg aacgatccct ctttcagtca gcaacactcc cgttcgaggg ggggcccggt 600

acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg 660

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 720

cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 780

cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 840

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 900

cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 960

tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 1020

tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 1080

cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 1140

ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 1200

gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc 1260

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 1320

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 1380

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 1440

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 1500

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 1560

cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 1620

tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 1680

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 1740

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 1800

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 1860

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 1920

atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 1980

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 2040

cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 2100

tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 2160

tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 2220

gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 2280

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 2340

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 2400

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 2460

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 2520

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 2580

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 2640

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 2700

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 2760

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 2820

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 2880

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 2940

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 3000

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 3060

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 3120

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagc 3179

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagt agcggctagt gcccagtata 30

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgggagtgt tgctgactga agcggccgca aaaggaaaa 39