Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在抗雀科鸟类危害上的应用

文档序号：884958 发布日期：2021-03-23 浏览：23次 >En<

阅读说明：本技术 Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在抗雀科鸟类危害上的应用 (Application of Tannin1 gene and secondary metabolite thereof participating in synthesis in resisting harm of sparrow birds ) 是由谢旗谢鹏吴耀荣史佳阳唐三元于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明首先公开了Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在抗雀科鸟类危害上的应用；所述Tannin1基因为序列表中序列1所示。本发明进一步公开了检测Tannin1基因是否发生突变的物质在鉴定或辅助鉴定作物是否能抗雀科鸟类危害上的应用。本发明为培育高粱抗鸟新品种提供了重要的基因资源,同时也为利用次级代谢产物(花青素、原花青素或脂肪酸来源的挥发物如己醛或1-辛烯-3-醇)设计开发新型药物来防治农业鸟害提供了全新的解决方案。本发明公开了Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在抗雀科鸟类危害上的应用。(The invention firstly discloses application of Tannin1 gene and secondary metabolite thereof participating in synthesis in resisting sparrow bird harm; the Tannin1 gene is shown as a sequence 1 in a sequence table. The invention further discloses application of a substance for detecting whether mutation occurs in the Tannin1 gene in identification or auxiliary identification of whether crops can resist harm of sparrow birds. The invention provides important gene resources for cultivating new sorghum bird-resistant varieties, and simultaneously provides a brand-new solution for designing and developing novel medicines by utilizing secondary metabolites (anthocyanidin, procyanidine or volatile matters from fatty acid such as hexanal or 1-octene-3-ol) to prevent and control agricultural bird damage. The invention discloses application of a Tannin1 gene and a secondary metabolite thereof participating in synthesis in resisting damage of sparrow birds.)

技术领域

本发明涉及Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在抗雀科鸟类危害上的应用。

背景技术

鸟害是几千年来农业生产中最常见同时也是威胁农作物产量最严重的一类危害。常见危害农作物的主要鸟类是指隶属于雀科的麻雀。在作物灌浆期到成熟期，大量麻雀迁飞到农田中啄食籽粒，使籽粒破损并发霉，同时传播各种病虫害，造成不同程度的减产，严重时甚至绝收。常见防治鸟害的主要方式包括套袋或搭建防鸟网，这样不仅伤害了麻雀，破坏生态环境，同时也增加了巨大的农业成本。尤其是在大规模制种田中，通过搭建防鸟网防治鸟害是一件实际性操作很难的事情。因此农作物鸟害防治问题一直以来是农业生产中亟待解决的问题。

高粱以其优良的耐旱涝、盐碱、贫瘠性状以及巨大的生物量而区别于其它农作物被广泛地应用到饲料、能源和燃料中。迄今为止由于高粱的抗逆特性，仍然是世界干旱和半干旱地区超过5亿人的主粮作物。

因此，探究出与雀科鸟类危害有关的基因及物质可以合理有效地防治农业生产中的鸟害问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题为作物如何抗雀科鸟类的危害。

为解决上述技术问题，本发明提供了Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在作物抗雀科鸟类危害上的应用。

上述应用中，所述Tannin1基因为序列表中序列1所示；所述Tannin1基因参与合成的次级代谢产物选取花青素、原花青素和/或脂肪酸来源的挥发物。

上述应用中，所述脂肪酸来源的挥发物为己醛和/或1-辛烯-3-醇。

在本发明中发现花青素和/或原花青素的含量越高，则作物越能抗雀科鸟类的危害；己醛和/或1-辛烯-3-醇的含量越低，则作物越能抗雀科鸟类的危害。

上述应用中，所述应用包括制备拌种剂或种衣剂，所述拌种剂或种衣剂含有所述次级代谢产物。

本发明进一步公开了检测Tannin1基因是否发生突变的物质在鉴定或辅助鉴定作物是否能抗雀科鸟类危害上的应用。

所述Tannin1基因为序列表中序列1所示(编码氨基酸序列如序列4所示的蛋白质)；其突变包括如下两种形式：

第一种是序列2所示的tan1-a型，即序列表中序列1第580位丢失一个核苷酸G(导致蛋白翻译提前终止形成序列5所示的298个氨基酸)；

第二种是序列3所示的tan1-b型，即序列表中序列1的第922位和第923位间插入CGGGCAGCGG(导致蛋白翻译提前终止形成序列6所示的318个氨基酸)。

在本发明中，当所述Tannin1基因突变为tan1-a型或tan1-b型时，与未发生Tannin1基因突变的作物相比，抗雀科鸟类危害的能力减弱。

本发明进一步提供了检测Tannin1基因是否发生突变的物质在作物育种中的应用。

上述应用中，所述作物育种为培育抗雀科鸟类危害的作物品种。

上述应用中，检测Tannin1基因是否发生突变具体可为检测所述序列表中序列1所示Tannin1基因是否发生了如下两种形式的突变：

第一种是序列2所示的tan1-a型；

第二种是序列3所示的tan1-b型。

上述应用中，所述检测Tannin1基因是否发生突变的物质如下1)或2)或3)：

1)扩增包括上述Tannin1基因或其突变在内的基因组DNA片段的成套引物；

2)含有1)的PCR试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

上述应用中，所述扩增包括上述Tannin1基因或其突变在内的基因组DNA片段的成套引物由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定作物是否能抗雀科鸟类危害的方法。

本发明鉴定或辅助鉴定作物是否能抗雀科鸟类危害的方法，包括：检测待测作物基因组中所述Tannin1基因是否发生了突变：当所述Tannin1基因发生突变，所述待测作物抗雀科鸟类危害的能力较弱(与未发生Tannin1基因突变的作物相比)。

上述方法中，所述Tannin1基因具有如下两种形式的突变：

第一种是序列2所示的tan1-a型；

第二种是序列3所示的tan1-b型。

本发明进一步提供了一种抗雀科鸟类危害的作物的育种方法，包括：检测待测作物基因组中Tannin1基因是否发生了突变，选择待测作物基因组中Tannin1基因没发生突变的作物品种进行育种。

检测待测作物基因组中Tannin1基因是否发生了突变的方法为如下A)或B)：

A)通过全基因组测序的方法检测待测作物基因组中Tannin1基因是否发生了突变；

B)用上述检测Tannin1基因是否发生了突变的物质对待测作物基因组DNA进行PCR反应，获得PCR产物，对PCR产物进行测序确定所述Tannin1基因是否发生了突变。

上文中，所述作物为禾本科作物；具体的所述禾本科作物为高粱。

本发明既为培育高粱抗鸟新品种提供了重要的基因资源，同时也为利用次级代谢产物(花青素、原花青素、脂肪酸来源的挥发物如己醛和1-辛烯-3-醇)设计开发新型药物来防治农业鸟害提供了全新的解决方案。

附图说明

图1为田间自然条件下抗鸟和不抗鸟的高粱品种在成熟期之后的表型。

图2为两个自然群体中的抗鸟行为和原花青素含量的GWAS分析；其中，A、B表示籽粒高粱自然群体鸟食性行为相关性分析的QQ-Plot图和Manhattan图；C、D表示籽粒高粱自然群体鸟食性行为相关性分析的QQ-Plot图和Manhattan图；E、F图表示籽粒高粱自然群体缩合单宁含量相关性分析的QQ-Plot图和Manhattan图。

图3为五种农艺性状与抗鸟行为之间的线性回归分析。

图4为在6个抗鸟品种与12个不抗鸟品种中原花青素的含量。

图5为11种花青素和原花青素合成机制中的中间代谢物在抗鸟和不抗鸟的高粱品种的灌浆期籽粒中的检测结果。

图6为与花青素、原花青素、槲皮素、山萘酚、儿茶素合成相关的关键合成酶基因的表达量结果。

图7为槲皮素、山萘酚和儿茶素处理的麻雀标准行为学实验；对照为水处理。

图8为锦葵色素处理的麻雀标准行为学实验；对照为水处理。

图9为原花青素处理的麻雀标准行为学实验；对照为水处理。

图10为23种丰度表达的挥发物组分在抗鸟和不抗鸟的高粱品种的灌浆期籽粒中的检测结果。

图11为与脂肪酸来源的挥发物代谢途径相关基因和转录因子的表达量结果。

图12为己醛处理的麻雀标准行为学吸引实验；对照为乙醇处理。

图13为1-辛烯-3-醇处理的麻雀标准行为学吸引实验；对照为乙醇处理。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与高粱自然群体材料的鸟害相关基因的发现及与抗鸟害的关系

自美国USDA-ARS(United States Department of Agriculture-AgriculturalResearch Service)作物种质资源库搜集来的571份高粱自然材料，包括一个352份籽粒高粱自然群体和一个219份甜高粱自然群体。在北京(39.5°N，116.4°E)、宁夏银川(38.5°N，106.3°E)和海南三亚(18.3°N，108.8°E)三个地点，每个地点种植两次重复并统计2016年和2017年的表型数据。种植方式为行长4米，行宽1米。每隔20行以及在走道位置会种植满一个参考基因组测序的高粱品种Btx623(受鸟害严重的一个品种)，以此最大限度地使鸟害能覆盖到整个自然群体。

在农田露天且不加任何防护措施的条件下，进行成熟期之后鸟害性状表型调查，并进行记录抗鸟和不抗鸟(图1)。每个品种的每个性状表型至少要能重复8次以上才能被接受，否则记录为缺失。统计结果数据见表1(表1中只显示了352份籽粒高粱自然群体的数据)。

表1 352份籽粒高粱自然群体的鸟害、Tannin1基因及五个农艺性状的表型统计

注：“-”表示数据缺失。

通过对352份籽粒高粱和219份甜高粱的鸟害性状的GWAS分析，在两个不同自然高粱群体的四号染色体末端同时检测到一个单主效位点与鸟害呈极显著相关，其中在籽粒高粱群体中最显著的SNP：S4_61667908直接定位到了Tannin1基因的内部。对352份籽粒高粱自然群体进行GWAS分析发现，在四号染色体末端检测到Tannin1位点，并且高粱抗鸟害的位点与Tannin1位点三者共线，表明Tannin1是高粱抵御鸟害的单主效基因(图2)。

同时，调查了高粱自然群体材料的鸟害与五个农艺性状的的关系：对571份高粱自然群体中测定了如下农艺性状：穗型表型、包壳表型、芒长表型、种皮颜色表型、缩合单宁的含量测定方法参照国标法(ISO 9648：1988、MOD)，单位是mg/g。通过SPSS软件(SPSS、Inc.、Chicago、IL、USA)进行线性回归分析，结果显示只有原花青素含量与鸟害性状呈极显著相关，而其余农艺性状与鸟害并不相关(见图3)。

对籽粒高粱群体中352份籽粒高粱自然群体的Tannin1基因的编码区测序，测序引物见表2。采用Primer Premier 5(Lalitha，2000)软件设计用于扩增Tannin1基因全长的引物，引物由华大科技生物科技有限公司合成，基因型分析中用于PCR扩增的高保真Taq酶FastPfu Fly DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司(货号：AP231-01)。PCR反应体系如表3所示，PCR反应(程序为94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，扩增40个循环；72℃保温10min；4℃保存)在赛默飞世尔科技(中国)有限公司96孔快速热循环仪进行。PCR产物测序由华大科技生物科技有限公司完成。

表2 Tannin1基因扩增引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		Primer-F	TTCTCCACCCCATGGACCTAC(序列7)
Primer-R	CTAGCACAGGATCAATCCCCTC(序列8)

表3 PCR扩增反应体系

试剂	25μL体系
		ddH<sub>2</sub>O	15μL
10×Taq Buffer	2.5μL
		dNTP Mix(2mM)	2.5μL
Primer-F	1μL
		Primer-R	1μL
MgCl<sub>2</sub>(25mM)	1.5μL
		Taq DNA Polymerase(5U/μL)	0.3μL
DNA模板	1μL

最终检测到序列1所示的Tannin1基因(翻译序列4所示的353个氨基酸)发生如下两种形式的自然突变序列：第一种是序列2所示的tan1-a型，即序列1所示的Tannin1基因第580位丢失一个核苷酸G导致蛋白翻译提前终止形成序列5所示的298个氨基酸；第二种是序列3所示的tan1-b型，即序列1所示的Tannin1基因第922位和第923位间插入十个核苷酸CGGGCAGCGG导致蛋白翻译提前终止形成序列6所示的318个氨基酸。

352份籽粒高粱自然群体的Tannin1基因(以“Tan1”表示)的编码区测序结果如表1所示。根据表1对籽粒高粱自然群体对鸟害的抗性与Tannin1基因及突变型进行统计分析，除26份表型缺失外，结果如表4所示，表明当Tannin1基因(翻译353个氨基酸)发生上述形式的突变时，即115(tan1-a型90个品种，tan1-b型25品种)个高粱品种中有101个(tan1-a型79个品种，tan1-b型22品种)表现出不抗鸟害；而Tannin1基因未发生突变时，即211个高粱品种中有125个表现出抗鸟害，因此，进一步说明了Tannin1基因与鸟害相关，当序列1所示的Tannin1基因(翻译353个氨基酸)的第580位丢失一个核苷酸G或第922位和第923位间插入十个核苷酸(CGGGCAGCGG)时，高粱抵御鸟害的能力减弱。

表4 Tannin1基因及突变型与籽粒高粱群体对鸟害的抗性的关系

实施例2花青素与原花青素及二者合成过程中的中间代谢产物在影响雀科鸟害的应用

一、在6个抗鸟的高粱品种和12个不抗鸟的高粱品种(表5)中对次级代谢产物(包括锦葵色素、原花青素)及中间代谢产物(槲皮素、山萘酚、儿茶素)进行LC-MS(LiquidChromatograph Mass Spectrometer)测定(具体方法参见文献“Jaegle，B.，Uroic，M.K.，Holtkotte，X.，Lucas，C.，Termath，A.O.，Schmalz，H.G.，Bucher，M.，Hoecker，U.，Hulskamp，M.，and Schrader，A.(2016).Afast and simple LC-MS-basedcharacterization of the flavonoid biosynthesis pathway for few seed(ling)s.Bmc Plant Biol 16.”)。使用的色谱柱为XTerra MS C18色谱柱(2.0×250mm，粒径4.6μm)，液质数据中关于所检测到的化合物的分析参考进行(Ma，Y.Y.，Kosinska-Cagnazzo，A.，Kerr，W.L.，Amarowicz，R.，Swanson，R.B.，and Pegg，R.B.(2014).Separation andcharacterization of phenolic compounds from dry-blanched peanut skins byliquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry.J ChromatogrA 1356，64-81.；Qu，C.M.，Fu，F.Y.，Lu，K.，Zhang，K.，Wang，R.，Xu，X.F.，Wang，M.，Lu，J.X.，Wan，H.F.，Tang，Z.L.，et aL(2013).Differential accumulation of phenoliccompounds and expression of related genes in black-and yellow-seeded Brassicanapus.J Exp Bot 64，2885-2898.)。

表5用于测定的抗鸟和不抗鸟的高粱品种

结果显示，对于抗鸟品种而言，在不抗鸟品种中包括槲皮素、山萘酚、儿茶素、锦葵色素、原花青素都在不抗鸟品种中出现极显著地降低(见图4和图5)。从6个抗鸟的高粱品种和12个不抗鸟的高粱品种分别选择3个抗鸟的高粱品种和6个不抗鸟的高粱品种进行荧光定量PCR检测槲皮素、山萘酚、儿茶素、锦葵色素、原花青素的关键合成酶(即SbCHS/SbF3H：合成槲皮素、山奈酚的基因或上游基因；SbDFR/SbANS：合成锦葵色素的上游基因；SbLAR：合成儿茶素的基因或原花青素的上游基因)基因的表达量，结果显示槲皮素、山萘酚、儿茶素、锦葵色素、原花青素的关键合成酶基因的表达量在tan1-a或tan1-b突变品种中出现显著地降低(见图6)，表明Tannin1基因突变导致槲皮素、山萘酚、儿茶素、锦葵色素、原花青素的含量出现了下调。

其中，荧光定量PCR的反应体系见如下表6：

表6荧光定量PCR反应体系

荧光定量PCR的引物见如下表7：

表7荧光定量PCR引物序列

PCR反应程序为：95℃3min；变性95℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃30秒，扩增40个循环。

二、为检测代谢产物对鸟类食性的影响，设计了鸟类(麻雀)标准行为学实验。首先采取受鸟害最严重的高粱品种Btx623(tan1-b型)的种子各30g，分别进行水对照、10％浓度和20％浓度的槲皮素、山萘酚、儿茶素、锦葵色素或原花青素处理，每个笼子养五只麻雀，每次实验进行三次生物学重复，分别统计处理1天、3天和5天各处理剩余的高粱种子的重量。处理浓度见表8。

结果显示，相对于对照处理而言，槲皮素、山奈酚和儿茶素处理剩余的高粱种子重量并无明显差异(图7)；但随着梯度浓度的锦葵色素(花青素的一种)或原花青素处理，剩余的高粱种子的重量也梯度地增加，表明花青素和原花青素是影响雀科鸟类食性的根本原因(图8和图9)。次级代谢产物的处理浓度见表7。

表8代谢产物的处理浓度

实施例3、脂肪酸来源的挥发物在影响雀科鸟害的应用

将上述6个抗鸟品种和12个不抗鸟品种材料的灌浆期籽粒进行了GC-MS测定，测定方法参考如下：

准确称取200.00mg高粱灌浆期鲜样放入液氮磨成粉末，于顶空萃取瓶，以锡纸为隔垫并加塞封口，混匀后放入温度为75℃的恒温水浴锅中加热平衡1h，平衡完成后即刻向瓶中插入萃取头1h，结束后立刻将萃取头放入GC-MS进样口，以250℃不分流模式解析5min。色谱条件：以HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；氦气为载气，流速1mL/min，无分流模式，进样口温度250℃。初始柱温50℃，保持5min，以12℃/min上升至125℃并保持3min，再以1℃/min上升至165℃并保持3min，然后以14℃/min上升至230℃并保持2min，程序结束后冷却2min使温度降至50℃。质谱条件：离子源为EI，离子源温度为230℃，接口温度为280℃，电子能量为70eV，采用全扫描采集模式，其扫描范围(m/z)为35-400amu。数据分析采用未知挥发性物质的定性经计算机检索和NIST08标准质谱匹配得到，选取匹配度高于85的挥发性成分分析。其定量是经过相对百分含量按峰面积归一化计算，样品进行三次生物学重复。

在检测到的23种有丰度表达的挥发物组分中有12种挥发物相对于抗鸟品种而言，在不抗鸟品种出现了显著的积累(图10)。这些挥发物组分大多数都属于短链(C6-C10)脂肪酸来源的挥发物，具有天然的芳香味道。从6个抗鸟的高粱品种和12个不抗鸟的高粱品种分别选择3个抗鸟的高粱品种和6个不抗鸟的高粱品种利用实施例2所示的荧光定量PCR检测烯酰基ACP还原酶、胞苷二磷酸二酰甘油合成酶2、脂肪酸脱氢酶、脂氧合酶等在脂肪酸来源的挥发物代谢途径相关基因和转录因子等(即SbMOD1.1/SbCDS2.1/SbLOX3/SbGL2)的表达量，结果显示脂肪酸来源的挥发物代谢途径相关基因的表达量在tan1-a或tan1-b突变品种中出现显著地升高，而负调控其合成的转录因子表达量显著下调(图11)，表明Tannin1基因突变导致脂肪酸来源的挥发物代谢相关基因表达的变化。

二、为了分析代谢产物对鸟类食性的影响，设计了鸟类(麻雀)标准行为学实验。选取其中浓度较高且差异倍数较大的挥发物己醛和1-辛烯-3醇进行鸟类(雀科)标准行为学实验：选取参考基因组品种Btx623灌浆期的穗子，在笼子的左边放两个大小相当的穗，进行己醛处理；在笼子的右边放两个大小相当的穗，进行对照乙醇处理；每只笼子放养5只麻雀，进行三次生物学重复；统计平均每分钟每只麻雀在处理或对照那边的滞留时间。处理浓度见表8。

结果显示，平均每只麻雀平均每分钟在挥发物己醛或1-辛烯-醇处理的高粱灌浆期穗子一侧滞留的时间均超过50秒以上(图12和图13)，表明己醛或1-辛烯-3醇确实能作为一种有香味的引诱剂来吸引麻雀取食。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在抗雀科鸟类危害上的应用

<130> GNCFY192096

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench）

<400> 1

atggacctac ccaagccgcc gtcgacggcc gcctcgtcgt cgggggcgga gacgccgaac 60

ccgcacgcct tcacctgcga gctcccgcac tcgatctacg cgctcgcctt ctcccccggc 120

gcgcccgtcc tcgcctccgg cagcttcctc gaggacctcc acaaccgcgt ctccctgctc 180

tccttcgacc ccgtccgccc ctccgccgcc tccttccgcg ccctcccggc gctctccttc 240

gaccacccct acccacccac caagctccag ttcaacccgc gcgccgccgc gccgtccctc 300

ctcgcctcct ccgccgacac gctccgcatc tggcacgccc cgctcgacga cctctccgcc 360

accgcctccg cgcccgagct ccgctccgtt ctcgacaacc gcaaggccgc ctccgagttc 420

tgcgcgcccc tcacctcctt cgattggaac gaggtcgagc cccgccgtat cgggaccgcc 480

tccatcgaca ccacctgcac cgtctgggac atcgatctcg gcgtcgtgga gacgcagctc 540

atcgcgcacg acaaggccgt ccacgacatc gcctgggggg aggccggggt cttcgcctcc 600

gtgtcggccg acggctccgt ccgcgtcttc gacctccggg acaaggaaca ctccaccatc 660

gtctacgaga gcccccgccc cgacacgccg ctcctcaggc tggcgtggaa ccgctctgac 720

ctccgctata tggccgcgct gctcatggac agcagcgccg tcgtcgtgct cgacatacgt 780

gcgcccgggg tgccggtggc cgagctgcac cggcaccggg cgtgcgccaa cgcagtcgcg 840

tgggcgccgc aggccactag gcacctctgc tcggctgggg acgacgggca ggcactgatc 900

tgggaactgc ccgagacggc ggcggctgtg cccgccgagg ggattgatcc tgtgctagtg 960

tacgacgcag gtgccgaaat aaaccaactt cagtgggcgg ccgcccaccc ggactggatg 1020

gccatcgcct ttgagaacaa ggtccagctt cttagggtct ga 1062

<210> 2

<211> 897

<212> DNA

<213> 高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench）

<400> 2