阅读说明：本技术 一类基于香豆素骨架的近红外荧光染料及其合成方法 (Near-infrared fluorescent dye based on coumarin skeleton and synthetic method thereof ) 是由 李楠 赵娜 尹伟 李悦 于 2018-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类基于香豆素结构的近红外荧光染料及其合成方法,该荧光染料的结构通式为<Image he="308" wi="656" file="DDA0001914709740000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>式中R代表C<Sub>1</Sub>烷基、X<Sup>-</Sup>代表PF<Sub>6</Sub><Sup>-</Sup>,或者R代表C<Sub>2</Sub>～C<Sub>12</Sub>烷基中任意一种,X<Sup>-</Sup>代表Br<Sup>-</Sup>。本发明将4-(二乙氨基)香豆素通过Vilsmeier-Haack反应合成4-(二乙氨基)香豆素醛,再依次与氰基吡啶、不同碳链长度的卤代烷烃反应即得到系列荧光染料。本发明荧光染料通过对铵盐侧链的调控可以特异性的标记活细胞中的亚细胞器,而且R代表C<Sub>3</Sub>烷基的荧光染料可实现标记过程的快速染色以及免洗；荧光染料的最大发射波长处于红色发光区域,可显著消除细胞成像中自荧光现象的干扰；此外R代表C<Sub>9</Sub>、C<Sub>12</Sub>烷基的荧光染料具有产生单线态氧的性质,在细胞及细菌的光动力治疗中有一定的应用潜能。(The invention discloses a near-infrared fluorescent dye based on a coumarin structure and a synthesis method thereof, wherein the structural general formula of the fluorescent dye is shown in the specification Wherein R represents C 1 Alkyl radical, X ‑ Represents PF 6 ‑ Or R represents C 2 ～C 12 Any one of alkyl radicals, X ‑ Represents Br ‑ . The invention synthesizes 4- (bis-diethylamino) coumarin into 4- (bis-coumarin) through Vilsmeier-Haack reactionEthylamino) coumarin aldehyde, and then reacting with cyanopyridine and halogenated alkanes with different carbon chain lengths in sequence to obtain the series of fluorescent dyes. The fluorescent dye can specifically mark subcellular organelles in living cells by regulating and controlling ammonium salt side chains, and R represents C 3 The alkyl fluorescent dye can realize quick dyeing and no-washing in the marking process; the maximum emission wavelength of the fluorescent dye is in a red light emitting area, so that the interference of an autofluorescence phenomenon in cell imaging can be obviously eliminated; in addition R represents C 9 、C 12 The alkyl fluorescent dye has the property of generating singlet oxygen and has certain application potential in the photodynamic treatment of cells and bacteria.)

一类基于香豆素骨架的近红外荧光染料及其合成方法

技术领域

本发明属于生物医学用荧光染料技术领域，具体涉及一类具有近红外发光性质，以及该荧光染料的制备方法。

背景技术

细胞质膜是活细胞与其环境之间的二维边界。与细胞质膜相关的生命活动包括动态膜重塑、信号转导和营养转运，这些都是细胞生物学家的研究热点。为了研究这些细胞进程，开发亚细胞荧光成像探针是非常重要的，它可以识别细胞质膜并记录动态变化。到目前为止，只有少量的商业荧光染料可用来跟踪细胞膜，如DiO₃和DiI。然而目前大多数商业荧光染料发射波长处于可见光区域，会产生背景荧光，导致低信噪比(S/N)。而红色发光的荧光染料不但可以克服这一缺点，而且还可避免激光光源对细胞组织的损伤。因此，设计合成一种具有红色发光性质的荧光染料至关重要。

线粒体是细胞的“能量工厂”，它利用氧气进行氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP)，为细胞及生命体提供能量。同时，伴随着呼吸链中电子的泄漏，多种活性氧物种(ROS)在线粒体内快速产生。线粒体ROS在维持氧化还原平衡、参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等行为方面发挥重要作用。当ROS水平超过机体抗氧化防御能力时，会导致疾病的发生。因此，发展准确检测线粒体ROS的方法，对深入探究ROS的细胞功能调控及相关疾病的发生发展意义重大。由于ROS存在浓度低、寿命短、反应活性高等特点，对其进行精准检测是化学、生物学及医学领域的一大挑战。荧光成像技术具有时空分辨率高、生物相容性好、灵敏度高等显著优势，成为实时检测细胞及活体内ROS的有力工具。

发明内容

本发明的目的是提供一类基于香豆素骨架的近红外荧光染料，以及该荧光染料的制备方法。

针对上述目的，本发明所采用的荧光染料的结构通式如下所示：

式中R代表C₁烷基、X^-代表PF₆ ^-，或者R代表C₂～C₁₂烷基中任意一种，X^-代表Br^-。

上述基于香豆素骨架的近红外荧光染料的制备方法如下：

1、将三氯氧磷与N,N-二甲基甲酰胺按摩尔比为1:1.1～1.3室温反应后，加入式I所示的4-(二乙氨基)香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在50～70℃下反应20～24小时，分离纯化产物，得到式II化合物。

2、以乙醇为溶剂，将式II化合物、4-乙腈吡啶盐酸盐、三乙胺在40～50℃下反应10～12小时，分离纯化产物，得到式III化合物。

3、以N,N-二甲酰亚胺为溶剂，将式III化合物、碘甲烷在70～90℃下反应8～10小时，分离纯化产物，将其溶于乙腈中，加入六氟磷酸钾，在室温下反应10～12小时，反应完成后过滤，得到R为C₁烷基、X^-为PF₆ ^-的荧光染料；

或者以N,N-二甲酰亚胺为溶剂，将式III化合物、卤代烷烃在70～90℃下反应8～10小时，分离纯化产物，得到R为C₂～C₁₂烷基中任意一种、X^-为Br^-的荧光染料；其中所述的卤代烷烃为C₂～C₁₂的溴代烷烃中任意一种。

上述步骤1中，优选所述式I化合物与三氯氧磷的摩尔比为1:8～9。

上述步骤2中，优选所述式II化合物、4-乙腈吡啶盐酸盐、三乙胺的摩尔比为1:2～3:3～5。

上述步骤3中，优选所述式III化合物与碘甲烷、六氟磷酸钾的摩尔比为1:8.5～12:8.5～12，所述式III化合物与卤代烷烃的摩尔比为1:8.5～12。

本发明的有益效果如下：

1、本发明利用香豆素简单骨架，首先以N,N-二乙基作为供电基团，以氰基吡啶作为吸电基团，形成分子内推拉电子效应的体系，再通过不同烷基侧链修饰得到目标化合物。这些化合物均具有红光发射性质，在荧光成像过程中可显著避免自荧光的干扰，同时通过侧链调节，可对不同的亚细胞结构进行定位标记。

2、本发明荧光染料的结构式中R代表C₉和C₁₂烷基时具有产生单线态氧特性，可有效产生单线态氧，从而应用于光动力治疗。利用这种特性，还可进行抑菌杀菌实验。

附图说明

图1是实施例1～5制备的荧光染料在二甲基亚砜中的紫外吸收光谱图。

图2是实施例1～5制备的荧光染料在二甲基亚砜中的荧光光谱图。

图3是实施例1制备的荧光染料的细胞成像图。

图4是实施例2制备的荧光染料的细胞成像图。

图5是实施例3制备的荧光染料的细胞成像图。

图6是实施例4制备的荧光染料的细胞成像图。

图7是实施例5制备的荧光染料的细胞成像图。

图8是实施例2制备的荧光染料的细胞免洗成像图。

图9是实施例2制备的荧光染料标记细胞膜随时间的细胞成像图。

图10是实施例1制备的荧光染料在去离子水中白光照射过程中的紫外可见吸收光谱图。

图11是实施例2制备的荧光染料在去离子水中白光照射过程中的紫外可见吸收光谱图。

图12是实施例3制备的荧光染料在去离子水中白光照射过程中的紫外可见吸收光谱图。

图13是实施例4制备的荧光染料在去离子水中白光照射过程中的紫外可见吸收光谱图。

图14是实施例5制备的荧光染料在去离子水中白光照射过程中的紫外可见吸收光谱图。

图15是实施例1～5制备的荧光染料和无荧光染料存在时在去离子水中白光照射过程中的378nm处吸收的相对强度图。

图16是实施例5制备的荧光染料在白光照射下对大肠杆菌的杀菌效果图。

图17是实施例5制备的荧光染料在白光照射下对金黄葡萄杆菌的杀菌效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、将1.2mL(15.6mmol)N,N-二甲基甲酰胺加入1.23mL(13.25mmol)三氯氧磷中，室温搅拌30min后加入5mL含339mg(1.56mmol)式I-1所示的4-(二乙氨基)香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在60℃下搅拌反应24小时，反应完后将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取反应液，合并有机相，干法柱层析(以石油醚与乙酸乙酯体积比为30:1的混合液为洗脱剂)，得到式II化合物。

2、将98mg(0.4mmol)式II化合物、155mg(1mmol)4-乙腈吡啶盐酸盐溶于2mL乙醇中，加入221μL(1.6mmol)三乙胺，在40℃下搅拌反应12小时，过滤得到式III化合物。

3、将104mg(0.3mmol)式III化合物溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入186μL(3mmol)碘甲烷，80℃搅拌反应12小时，反应完后用二氯甲烷和饱和食盐水萃取反应液，合并有机相，旋干后，溶于2mL乙腈中，加入552mg(3mmol)六氟磷酸钾，置换反应完成后旋干，干法柱层析(以二氯甲烷与甲醇体积比为40:1的混合液为洗脱剂)，得到式IV-1所示的荧光染料，其产率为65％。

所得产物的结构表征数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.92(d,J＝6.2Hz,2H),8.84(s,1H),8.39(s,1H),8.31(d,J＝6.1Hz,2H),7.66(d,J＝9.0Hz,1H),6.88(d,J＝8.6Hz,1H),6.69(s,1H),4.30(s,3H),3.56(d,J＝6.8Hz,4H),1.17(t,J＝6.7Hz,6H).

实施例2

本实施例的步骤1、步骤2与实施例1相同。本实施例的步骤3中，将104mg(0.3mmol)式III化合物溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入272μL(3mmol)溴丙烷，80℃搅拌反应12小时，反应完后用二氯甲烷和饱和食盐水萃取反应液，合并有机相，旋干后干法柱层析(以二氯甲烷与甲醇体积比为40:1的混合液为洗脱剂)，得到式IV-2所示的荧光染料，其产率为75％。

实施例3

本实施例中，用等摩尔量的溴己烷替换实施例2中的溴丙烷，其他步骤与实施例2相同，得到式IV-3所示的荧光染料，其产率为78％。

所得产物的结构表征数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.02(d,J＝6.9Hz,2H),8.83(s,1H),8.37(d,J＝16.6Hz,1H),8.31(d,J＝6.9Hz,2H),7.66(d,J＝9.1Hz,1H),6.88(dd,J＝9.1,2.2Hz,1H),6.68(d,J＝2.0Hz,1H),4.55(t,J＝7.4Hz,2H),3.55(q,J＝6.9Hz,4H),1.89(d,J＝2.5Hz,2H),1.28(s,5H),1.16(t,J＝7.0Hz,5H),0.85(t,J＝6.6Hz,3H).

实施例4

本实施例中，用等摩尔量的溴壬烷替换实施例2中的溴丙烷，其他步骤与实施例2相同，得到式IV-4所示的荧光染料，其产率为70％。

所得产物的结构表征数据为：¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.26(d,J＝6.6Hz,2H),8.99(s,1H),8.44(s,1H),8.13(d,J＝6.6Hz,2H),7.48(d,J＝9.1Hz,1H),6.72-6.69(m,1H),6.50(d,J＝1.9Hz,1H),4.94(s,2H),3.53(q,J＝7.1Hz,4H),2.05(s,2H),1.40(s,2H),1.35(s,2H),1.30(t,J＝7.2Hz,6H),1.25(s,8H),0.87(t,J＝7.0Hz,3H).

实施例5

本实施例中，用等摩尔量的溴十二烷替换实施例2中的溴丙烷，其他步骤与实施例2相同，得到式IV-5所示的荧光染料，其产率为68％。

所得产物的结构表征数据为：¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.25(d,J＝6.6Hz,9H),9.00(s,4H),8.44(s,4H),8.12(d,J＝6.5Hz,9H),7.48(d,J＝9.1Hz,5H),6.70(d,J＝9.2Hz,5H),6.50(d,J＝2.2Hz,5H),4.94(t,J＝7.2Hz,11H),3.54(q,J＝7.2Hz,19H),2.04(d,J＝7.5Hz,10H),1.40(s,12H),1.34(s,12H),1.30(t,J＝7.1Hz,32H),1.24(s,68H),0.87(t,J＝7.0Hz,16H).

发明人对实施例1～5制备的荧光染料进行了性能测试，具体测试如下：

1、光物理性质测定

以二甲基亚砜为溶剂，将荧光染料配制成浓度为2×10^-5mol/L的荧光染料溶液，采用普析紫外可见分光光度计、日立F-7000荧光分光光度计测试所得溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，结果见图1～2。由图可见，本发明实施例1～5得到的荧光染料的最大发射波长均处于660nm左右，均具有近红外发射性质。

2、细胞成像实验

(1)共染

使用HeLa细胞进行测试，用胰酶消化对数期生长的HeLa细胞，经5分钟离心之后，移除上层清液，加入新鲜的DMEM不完全高糖培养液1.0mL，制成单细胞悬浮液，并计数以1×10⁴个细胞/mL DMEM不完全高糖培养液2.0mL接种于35mm培养皿上，培养48小时，并在一定时间段观察细胞形态。待细胞可用于细胞成像时，用PBS缓冲溶液洗去漂浮的细胞，并分别加入配制好的10μmol/L DiO的DMEM溶液(实施例4～5加入配制好的500nmol/mL的Mito-tracker Green的DMEM溶液)，在37℃的细胞培养箱中孵化培养10分钟，然后小心移走培养液，加入配制好的10mmol/L实施例1～5制备的荧光染料的DMEM溶液，在37℃细胞培养箱中孵化培养10分钟。待样品培养之后，小心移走培养液，并用PBS溶液洗一次，并加不含酚红的DMEM溶液，在奥林巴斯荧光共聚焦显微镜下进行细胞成像。结果见图3～7，图中A为商业染料DiO/Mito-tracker Green对细胞的荧光成像图，B为本发明荧光染料的细胞荧光成像图，D为细胞明场成像，C为图像A、图像B重合后的叠加图。

由图3～7中叠加的图片可以清楚的看出，实施例1、2制备的荧光染料与商业细胞膜染料的重合度很高，说明实施例1、2制备的荧光染料对细胞膜具有特异性标记功能，实施例4、5制备的荧光染料与商业线粒体染料的重合度很高，而实施例3制备的荧光染料则不具备特异性标记的性质。

(2)免洗

使用Hela细胞进行测试，用胰酶消化对数期生长的Hella细胞，经5分钟离心之后，移除上层清液，加入新鲜的DMEM不完全高糖培养液1.0mL，制成单细胞悬浮液，并计数以1×10⁴个细胞/mL DMEM不完全高糖培养液2.0mL接种于35mm培养皿上，培养48小时，并在一定时间段观察细胞形态。待细胞可用于细胞成像时，用PBS缓冲溶液洗去漂浮的细胞，并分别加入配制好的10μmol/L实施例2制备的荧光染料不含酚红的DMEM溶液，在37℃的细胞培养箱中孵化培养10分钟，不需要洗直接在奥林巴斯荧光共聚焦显微镜下进行细胞成像。成像结果见图8。由图可见，实施例2制备的荧光染料在不经洗涤的过程进行成像后，并无背景干扰，仍可很好地对细胞膜进行染色。

(3)快速染色

使用Hela细胞进行测试，用胰酶消化对数期生长的Hella细胞，经5分钟离心之后，移除上层清液，加入新鲜的DMEM不完全高糖培养液1.0mL，制成单细胞悬浮液，并计数以1×10⁴个细胞/mL DMEM不完全高糖培养液2.0mL接种于35mm培养皿上，培养48小时，并在一定时间段观察细胞形态。待细胞可用于细胞成像时，用PBS缓冲溶液洗去漂浮的细胞，并分别加入配制好的10μmol/L实施例2制备的荧光材料的不含酚红的DMEM溶液，在奥林巴斯荧光共聚焦显微镜下随时间在原位进行细胞成像。成像结果见图9。由图可见，加入实施例2制备的荧光材料后，在10秒时即可很好的对细胞膜进行荧光成像。

3、单线态氧产生性能测试

取15μL 2×10^-5mol/L荧光染料的二甲基亚砜溶液、15μL 2×10^-2mol/L 9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)的二甲基亚砜溶液加入2970μL去离子水中，在光照0min、1min、5min、10min、20min时进行紫外吸收光谱扫描。空白组取15μL二甲基亚砜溶液、15μL 2×10^-2mol/L ABDA的二甲基亚砜溶液加入2970μL去离子水中，在光照0min、1min、5min、10min、20min时进行紫外吸收光谱扫描。结果见图10～15。由图可见，本发明实施例4和5制备的荧光染料与空白组对比，在光照一定时间时ABDA在378nm处的紫外吸收峰明显降低，说明实施例4和5制备的荧光染料在光照条件下均可产生单线态氧，从而使得ABDA的紫外吸收峰降低。

4、抑菌杀菌性能测试

将实施例5的荧光染料溶于二甲基亚砜中，配制成1×10^-2mol/L的荧光染料溶液。

空白组：取1μL二甲基亚砜溶液于1mL含1×10⁴个细菌的大肠杆菌或金黄葡萄球菌的0.9％NaCl水溶液中，震荡摇匀后孵化30分钟，无白光照射。

空白光照组：取1μL二甲基亚砜溶液于1mL含1×10⁴个细菌的大肠杆菌或金黄葡萄球菌的0.9％NaCl水溶液中，震荡摇匀后孵化30分钟，25mW/cm²白光照射30分钟。

实验组：取1μL荧光染料溶液于1mL含1×10⁴个细菌的大肠杆菌或金黄葡萄球菌的0.9％NaCl水溶液中，震荡摇匀后孵化30分钟，无白光照射。

光照实验组：取1μL荧光染料溶液于1mL含1×10⁴个细菌的大肠杆菌或金黄葡萄球菌的0.9％NaCl水溶液中，震荡摇匀后孵化30分钟，25mW/cm²白光照射30分钟。

随后从四组细菌溶液中各取50μL分别加入2mL固体培养基上，用涂布器均匀涂抹。将培养皿放置于37℃恒温培养箱中，14小时后取出培养皿，结果见图16～17。图16是该荧光染料对大肠杆菌的杀菌效果图，图17是该荧光染料对金黄葡萄球菌的杀菌效果图，其中A～D图分别为空白组、空白光照组、实验组、光照组对应的实验结果。由图可见，无论是大肠杆菌还是金黄葡萄球菌，经实施例5荧光染料孵育且光照后，培养皿中均无菌落产生；经实施例5荧光染料孵育而无光照，培养皿中仍存在大量菌落；而无实施例5荧光染料孵育无论是光照或是不光照，培养皿中仍存在过量的菌落。由此说明实施例5的荧光染料可作为很好的光敏材料在光照条件下应用于杀菌抑菌方面。