具体实施方式

本发明提供了一种硫醇-丙烯酸酯生物材料制备方法，包括以下步骤；

将环糊精和己内酯混合进行开环聚合反应，得到21星臂聚合物；

将所述21星臂聚合物进行丙烯酰化改性，得到末端带有双键的丙烯酸酯；

将所述末端带有双键的丙烯酸酯、硫醇、光引发剂和有机溶剂混合，进行点击化学反应，得到所述硫醇-丙烯酸酯生物材料。

本发明将环糊精和己内酯(CL)混合进行开环聚合反应，得到21星臂聚合物(c-PCL₂₁-OH聚合物)。

在本发明中，所述环糊精与己内酯的摩尔比优选为1：20～100，更优选为1：40～100，最优选为1：60～80。在本发明中，所述环糊精优选为β-环糊精。在本发明中，所述环糊精使用前优选进行真空干燥充分除去水分，所述真空干燥的温度优选为60℃，时间优选为24h。

在本发明中，所述开环聚合反应的温度优选为120～140℃，更优选为125～135℃，时间优选为20～24h，更优选为21～23h。在所述开环聚合反应的过程中，所述己内酯开环并与环糊精聚合，得到21星臂聚合物c-PCL₂₁-OH聚合物；

在本发明中，所述聚合反应优选在有机锡催化剂、无水和保护气氛的条件下进行。本发明对所述有机锡催化剂的具体种类和用量没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的种类即可。

在本发明中，所述c-PCL₂₁-OH聚合物的数均分子量优选为5000～80000，更优选地为30000～60000。

得到21星臂聚合物后，本发明将所述21星臂聚合物进行丙烯酰化改性，得到末端带有双键的丙烯酸酯(c-PCL₂₁-C＝C聚合物)。

在本发明中，所述丙烯酰化改性优选为将所述21星臂聚合物、缚酸剂和改性剂混合进行扩链反应。

在本发明中，所述21星臂聚合物优选以溶液的形式加入，即本发明优选将所述c-PCL₂₁-OH聚合物溶解后，将所得c-PCL₂₁-OH聚合物溶液与缚酸剂和改性剂混合，在0～5℃和保护气氛的条件下进行丙烯酰化改性反应，得到所述c-PCL₂₁-C＝C聚合物。

在本发明中，所述溶解c-PCL₂₁-OH聚合物的溶剂优选包括二氯甲烷、氯仿、THF、甲苯、乙腈、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯乙烷、五氯乙烷和六氯乙烷中的一种或多种。

在本发明中，所述c-PCL₂₁-OH聚合物溶液的质量浓度优选为10～30％，更优选为20％。

在本发明中，所述改性剂优选为丙烯酰类有机物，更优选包括甲基丙烯酰氯、丙烯酰氯、甲基丙烯酰溴和甲基丙烯酸酐中的一种或多种；所述缚酸剂优选包括三乙胺、吡啶、N,N-二异丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种。

在本发明中，所述c-PCL₂₁-OH聚合物中的羟基、缚酸剂和改性剂的摩尔比优选为1：2～6：2～6，更优选为1：3～5：3～5。

在本发明中，所述保护气氛优选为氮气。

在本发明中，所述c-PCL₂₁-OH聚合物溶液、缚酸剂和改性剂混合的方法优选为：在保护气氛下，向所述c-PCL₂₁-OH聚合物溶液中加入缚酸剂，然后在0～5℃冰浴条件下搅拌20～40min，得到混合液；向所述混合液中逐滴加入改性剂进行丙烯酰化改性反应。

在本发明中，所述丙烯酰化改性的温度优选为0～5℃，时间优选为18～24h，所述丙烯酰化改性反应的时间以改性剂加入完毕后开始计算；所述丙烯酰化改性反应的过程中，改性剂与c-PCL₂₁-OH聚合物反应生成改性c-PCL₂₁-C＝C聚合物和盐酸，盐酸与缚酸剂反应成盐，促进反应进行。

所述丙烯酰化改性反应完成后，本发明还优选对所得丙烯酰化改性反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

将所述丙烯酰化改性反应液依次进行过滤和洗涤后，在冰乙醚沉淀；将所得沉淀物进行真空干燥，得到所述c-PCL₂₁-C＝C聚合物，所述c-PCL₂₁-C＝C聚合物的结构如图1所示。

在本发明中，所述洗涤优选为去离子水搅拌清洗2～3遍，以去除反应中生成的盐。

得到末端带有双键的丙烯酸酯后，本发明将所述末端带有双键的丙烯酸酯、硫醇、光引发剂和有机溶剂混合，进行点击化学反应，得到所述硫醇-丙烯酸酯生物材料(PETMP/c-PCL₂₁-DA硫醇/丙烯酸酯生物材料)。本发明得到的PETMP/c-PCL₂₁-DA硫醇/丙烯酸酯生物材料的结构式如图2所示。

在本发明中，所述硫醇与末端带有双键的丙烯酸酯中双键的摩尔比为1:1～5，更优选为1:2～3。

在本发明中，所述有机溶剂优选包括二氯甲烷、三氯甲烷、DMF、DMSO、四氢呋喃、丙酮、1.4-二氧六烷、甲苯、三氯乙烷和二氯乙烷中的一种或多种。

本发明优选将所述末端带有双键的丙烯酸酯和有机溶剂混合后，再加入所述硫醇和光引发剂。

在本发明中，所述末端带有双键的丙烯酸酯和有机溶剂混合所得聚合物溶液的质量百分数优选为40～70％。

在发明中，所述硫醇优选包括3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇、季戊四醇四-3-巯基丙酸酯和三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯中的一种或多种，更优选为季戊四醇四-3-巯基丙酸酯。

在本发明中，所述光引发剂优选包括苯偶酰双甲醚(DMPA、651)、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(HMPP、1173)、4-异丁基苯基-4'-甲基苯基碘六氟磷酸盐(250)、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(2959)和双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)苯基氧化膦(819)中的一种或多种；所述光引发剂的质量优选为末端带有双键的丙烯酸酯质量的0.5～5％，更优选为1.5～3％。

本发明对所述混合的方法没有特别的要求，保证混合均匀即可。

在本发明中，所述点击化学反应的时间优选为10～20s，温度优选为室温，即不需要额外的加热或降温。

在本发明中，所述c-PCL₂₁-C＝C聚合物与硫醇发生点击化学反应中发生光固化，所述光固化的不受氧的抑制，降低固化后产物的交联度，长期存贮依然保持较高的韧性和拉伸强度。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的硫醇-丙烯酸酯生物材料。

本发明还提供了上述技术方案所述的硫醇-丙烯酸酯生物材料在制备血管组织工程生物材料中的应用。

在本发明中，所述应用优选用所述硫醇-丙烯酸酯生物材料制作3D打印墨水，使用3D直写式打印设备打印可用于血管组织工程的血管支架以及补片材料，本发明对所述直写式3D打印设备没有特别的要求，采用本领域技术人员熟知的相应设备即可。

在本发明中，所述打印血管支架时优选在接收转轴上打印，所述打印优选采用25号针头或27号针头；所述打印的层数优选为2～4层，单层层高优选为0.1～0.35mm；所述打印的速度优选为2～5mm/s。

在本发明中，所述接收转轴的材质优选为铜、银、合金、陶瓷、硅胶或聚四氟乙烯；所述接收转轴的直径优选≤6mm，更优选为3～6mm，所述接收转轴的内径通过选择相对应的接收轴来控制。

打印完成后，本发明优选将所得血管支架胚体在紫外光照射下进行光固化，得到所述用于血管组织工程的血管支架。在本发明中，所述紫外光的波长优选为254nm或365nm，强度优选为8～20mW/cm²，更优选为10～15mW/cm²。

在本发明中，所述打印生物补片材料优选在普通平台上进行，所述打印优选采用27号针头或30号针头；环绕方式为周围环绕，所述打印的层数优选为2～4层，单层层高优选为0.1～0.25mm；所述打印的速度优选为1～2mm/s。

打印完成后，本发明优选将所得血管补片胚体在紫外光照射下进行光固化，得到所述用于血管组织工程的生物补片材料。在本发明中，所述紫外光的波长优选为254nm或365nm，强度优选为8～20mW/cm²，更优选为10～15mW/cm²。

在本发明中，所述生物补片具有多孔结构，有利于细胞组织填充生长。

在本发明中，所述应用时，所述硫醇-丙烯酸酯生物材料优选与药物混合作为载药体系；所述载药体系中药物的含量优选为100～120μg/cm²。本发明对所述药物的种类没有特别的要求，采用本领域技术人员熟知的临床上常用的药均可，如紫杉醇、雷帕霉素、西罗莫司、依维莫司、白芦藜醇、肝素等。在本发明中，所述硫醇-丙烯酸酯的形状记忆聚合物中具有由环糊精结构所带来的疏水性内腔，内腔的大小与多数临床使用药物的分子尺寸相适宜，可提供理想的作用位点将药物包合而形成稳定的主-客体包合物，从而满足载药、控释性能，实现材料的载药功能。

在本发明中，所述硫醇-丙烯酸酯生物材料具有良好的力学性能、载药性能，并且具有良好的生物相容性；具有低阻氧甚至无阻氧作用，在紫外光中能够快速固化，能形成具有优异物理力学性能的网络和生物相容性；可用3D打印方式进行智能制造，打印出用于血管组织工程的支架和生物补片等结构，硫醇末端硫基因其硫基反应性强，具有广泛的生物相容性，在生物医学领域具有广泛的应用前景。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的硫醇-丙烯酸酯生物材料及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

紫外光快速光固化硫醇/丙烯酸酯材料，制备过程如下：

(1)将β-环糊精(β-CD)在真空中60℃干燥24h，充分除去水分；

(2)称取1.134g干燥的β-环糊精(β-CD)与167.84g的ε-己内酯(ε-CL)加入三口烧瓶中，混合后超声均质2h；

(3)三口烧瓶上装入机械搅拌，在上述预聚混合物中加入辛酸亚锡4滴于130℃、N₂保护下搅拌聚合反应24h，得到透明粘稠的聚合物溶液；

(4)将步骤(3)得到的聚合物溶液溶解于二氯甲烷中，在冰乙醚中沉淀，反复两次洗涤除去未反应的单体，35℃真空干燥24h后得到c-PCL₂₁-OH聚合物粉末；测定得到数均分子量为56263.62。

(5)在三口烧瓶中加入11.25gc-PCL₂₁-OH聚合物粉末及二氯甲烷(固含量10％)溶解，在N₂保护下加入1.70g三乙胺、4℃冰浴下磁力搅拌30min；在混合液中逐滴缓慢加入1.76g甲基丙烯酰氯，继续N₂保护下改性反应24h，得到浑浊的改性聚合物溶液；

(6)将浑浊的改性聚合物溶液过滤、洗涤除去杂质，在冰乙醚中沉淀，35℃真空干燥24h后得到白色c-PCL₂₁-C＝C聚合物粉末；

(7)将所得c-PCL₂₁-C＝C聚合物粉末用去离子水反复两次洗涤除去反应生成的盐，在45℃真空干燥24h后得到丙烯酸酯聚合物；

(8)取2g丙烯酸酯聚合物粉末溶解于三氯甲烷，固含量为50％，加入四季戊四醇四-3-巯基丙酸酯80.72ug，加入20mg光引发剂PPO(按丙烯酸酯聚合物粉末质量百分比1％)混合均匀，在365mm波长10mW/cm²光强的紫外光下固化10s，在40℃烘箱内干燥2小时，即可得到硫醇-丙烯酸酯生物材料，对进行拉伸试验，结果如下：拉伸性能数据为：弹性模量(MPa)：96.01±22.41；断裂点(％)：665.98±79.31；拉伸强度(MPa)：13.04±2.38；说明该硫醇-丙烯酸酯形状记忆生物材料具有良好的抗拉伸性能。

实施例2

丙烯酸酯聚合物同于实施例1；

取2g丙烯酸酯聚合物溶解于三氯甲烷，固含量为60％，加入四季戊四醇四-3-巯基丙酸酯80.72ug，加入20mg光引发剂PPO(按丙烯酸酯聚合物质量百分比1％)混合均匀，将得到的打印墨水装入料筒中，利用3D打印技术在接收转轴上打印支架：采用27号针头，打印速度3mm/s，打印2层，单层层高0.35mm，接收转轴由陶瓷制成，接收转轴直径5mm；随后在365mm波长10mW/cm²光强的紫外光下固化10s，得到3D打印硫醇/丙烯酸酯生物血管支架，内径5mm，长度20mm，质量60mg。

对打印的血管支架生物相容性进行测试，测试方法根据ISO10993-12标准：将HUVECs以1×10⁴个细胞well-1的密度接种到96孔板的支架上，使用CCK-8定量细胞活力和增殖。在特定时间(第1、3、5天)，将接种细胞的圆盘在10％CCK-8中在37℃下在含有5％CO₂的气氛中培养2.5小时。直至细胞增殖率达到80～90％。然后，去除培养基，并加入测试提取物(100μL)。将所得混合物在5％CO₂潮湿气氛中在37℃下孵育12小时。然后，除去测试提取物，并加入四唑鎓盐(MTT)溶液(20μL)。将所得混合物在5％CO₂潮湿气氛中在37℃下孵育4小时。然后除去MTT溶液，加入二甲亚砜(150μL)。将所得混合物在37℃下摇匀10分钟。使用酶标仪(MultiskanFC，Thermo ElectronCorporation，MA，USA)在450nm处测量每个孔的吸光度。所有测量运行8次。

通过测定的光密度数值可以通过下列公式确定细胞毒性程度：

其中RGR是细胞的相对生长率。D_t、D_pc和D_nc分别为测试样品、阳性对照和阴性对照的OD值。阳性对照为含人内皮细胞培养基，阴性对照为空白培养基。结果如图3所示。如图3可知，本实例得到的硫醇-丙烯酸酯血管支架具有优异的内皮细胞生物相容性，培养的人脐静脉内皮细胞第1、3和5天的细胞活力值均在95％以上。

实施例3

丙烯酸酯聚合物同于实施例1；

取2g丙烯酸酯聚合物溶解于三氯甲烷，固含量为60％，加入四季戊四醇四-3-巯基丙酸酯80.72ug，加入20mg光引发剂PPO(按丙烯酸酯聚合物质量百分比1％)混合均匀，将得到的打印墨水装入料筒中，利用3D打印技术在普通平台上打印血管补片材料。

实施例4

与实施例3基本相同，不同之处仅在于，在混合墨水中加入依维莫司药物，含量为100～120μg/cm²。对打印的补片生物材料进行溶血测试，测试标准根据ASTMF756-17，结构如图4所示，实施例3(a)和实施例4(b)的材料与阳性对照(c)和阴性对照(d)相比，红细胞数量和形态均正常，说明该补片生物材料具有良好的血液相容性，并且测试溶血的吸光度值，结果如表1所示，计算出实施例3的溶血率为0.9％，实施例4的溶血率为1.25％，证明该材料是一种非溶血材料。

表1实施例3和4的吸光度数据(n＝3)

实施例5

与实施例3基本相同，不同之处仅在于，在3D打印平台上打印大小为1cm×2cm，间距为0.1mm的方形片状材料，该材料可加入依维莫司50μg/cm²。

对该材料行血小板黏附实验，不同部位的黏附结果如图5所示，可知该材料表面无明显血小板黏附，证明该材料不会引起血栓形成，行皮下埋植以及不同放大倍数的病理切片实验，结果如图6和图7，图6说明大量细胞组织生长在材料表面，图7说明HE切片上长满正常血管组织，证明该材料具有良好的生物相容性以及作为血管组织工程的潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。