一种肌球蛋白抑制剂及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种肌球蛋白抑制剂及其制备方法和用途 (Myosin inhibitor and preparation method and application thereof ) 是由 胡立宏 王均伟 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物化学领域,特别是涉及一种肌球蛋白抑制剂及其制备方法和用途。本发明提供一种化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物,所述化合物的化学结构式如式I所示。本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物相较于现有技术中其他同类药物具有更优的活性和更理想的药代动力学特性。(The invention relates to the field of medicinal chemistry, in particular to a myosin inhibitor, a preparation method and application thereof. The invention provides a compound or pharmaceutically acceptable salt, isomer, prodrug, polymorph or solvate thereof, wherein the chemical structural formula of the compound is shown as a formula I. Compared with other similar medicines in the prior art, the compound provided by the invention or pharmaceutically acceptable salts, isomers, prodrugs, polymorphs or solvates thereof has better activity and more ideal pharmacokinetic properties.)
技术领域
本发明涉及药物化学领域，特别是涉及一种肌球蛋白抑制剂及其制备方法和用途。
背景技术
肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种以心肌肥厚为特征的心肌疾病，主要表现为左心室壁增厚，左心室充盈及血液流出受阻，舒张期顺应性下降。根据左心室流出道有无梗阻，可分为梗阻性肥厚型心肌病和非梗阻性肥厚型心肌病。HCM在人群中的发病率约为1/500，其临床表现多样，包括劳力性呼吸困难、胸闷、心悸、晕厥等。也可无明显症状，但一旦出现症状则可以逐步恶化，是一种发病负荷显著累积的进行性疾病。其主要威胁在于可伴发心率失常、心脏性猝死、动脉栓塞、感染性心内膜炎、心力衰竭等严重并发症，危及生命。HCM的年病死率为1-2％，是青少年和运动员猝死的主要原因之一。此外，肥厚型心肌病也是猫中最常见的心脏病之一，可见于美国短毛猫(89.1％)、波斯猫(6.5％)、美国长毛猫(2.2％)、缅因库恩猫(2.2％)等多个品种，可导致猫的猝死。
HCM病因尚不清楚，有明显家族遗传性倾向，绝大部分HCM呈常染色体显性遗传，约60％的成年HCM患者可检测到明确的致病基因突变。目前研究显示，发生于11个编码肌节或者相邻Z盘之间区域粗、细肌丝收缩蛋白基因的约1400个突变与HCM发病相关。其中最常见的突变是编码β-肌球蛋白重链和肌球蛋白结合蛋白C的基因MYH7和MYBPC3，占比超过70％。其他基因包括TNNT2、TNNI3、TPM1、MYL2、MYL3和ACTC1等各占一小部分(1-5％)。(CarolynY.Ho et al.Cardiovasc Res.2015；105(4):397-408)
HCM相关基因突变可通过改变心肌收缩力、影响心肌细胞对钙离子的敏感性、影响心肌细胞能量代谢等方式来引起心肌重构，心肌纤维排列紊乱及形态异常，心肌细胞代偿性增生肥大。
肌球蛋白和肌动蛋白是心肌收缩的物质基础，肌球蛋白横桥周期性地与肌动蛋白结合、解离，驱动肌丝滑动，导致心肌收缩。肌球蛋白具有ATP酶活性，通过水解ATP为心肌收缩提供动力。肌球蛋白变异会导致肌球蛋白与肌动蛋白结合时间延长，左心室心肌过度收缩和舒张受损，导致左心室心肌肥大、纤维化，引发HCM。抑制肌球蛋白ATP酶可以产生负性肌力效应，缓解因左心室心肌过度收缩所致心肌肥大等病理改变。
目前，HCM的治疗方法主要有药物及非药物治疗，可通过降低心肌收缩力，减轻流出道狭窄，改善心脏舒张功能。非药物治疗主要包括室间隔消融治疗及室间隔肥厚切除手术等。药物治疗包括β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、丙吡胺等。上述药物以改善症状为主，无法针对病因，延缓心肌肥厚进展，也不改变预后，治疗效果有限。临床仍缺乏针对HCM的理想治疗方法。
MYK-461是一种开发中的嘧啶二酮类肌球蛋白变构抑制剂，可抑制HCM所致心肌过度收缩，缓解左室流出道梗阻。但体内消除缓慢，药物在体内停留时间过长(推测人体半衰期为9天)，不便于快速调节剂量(Mark P.Grillo et al.Xenobiotica,2019；49(6):718-733)。因此，开发具有更好活性、更理想药代动力学特性的肌球蛋白抑制剂具有重要临床价值和意义。
此外，左心室心肌肥大和/或舒张期功能障碍也可见于多种心血管疾病的病理过程，如射血分数保留的舒张性心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛和限制性心肌病，慢性二尖瓣返流、慢性主动脉瓣狭窄和慢性系统性高血压等，肌球蛋白ATP酶抑制剂通过抑制心肌收缩，也可以在缓解上述疾病病理过程中发挥潜在治疗效应。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肌球蛋白抑制剂及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，所述化合物的化学结构式如式I所示：
其中，X选自H、F、Cl、Br或I；
R1选自可选地至少单取代的C1-C8烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基-C1-C4烷基，可选地至少单取代的4至7元杂环烷基，可选地至少单取代的苯基，可选地至少单取代的苯基-C1-C4烷基，可选地至少单取代的5至6元杂芳基，可选地至少单取代的5至6元杂芳基-C1-C4烷基，所述R1中，C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基-C1-C4烷基、4至7元杂环烷基、苯基、苯基-C1-C4烷基、5至6元杂芳基、5至6元杂芳基-C1-C4烷基的取代基各自独立地选自卤素、CN、羟基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、苯基、苯基-C1-C4烷基、苯基-C1-C4烷氧基、苯氧基、-CORa1、-CO2Ra1、SO2Ra1、SO2NRa1和-CONRa1Ra2，其中Ra1和Ra2各自独立选自H、C1-C4烷基和苯基、或Ra1和Ra2与桥接的氮原子形成4至6元杂环烷基；
R2选自H，卤素，CN，羟基，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，C1-C4烷氧基，苯基，苯基-C1-C4烷基，苯基-C1-C4烷氧基、苯氧基，-CORa3，-CO2Ra3，SO2Ra3，SO2NRa3Ra4，-CONRa3Ra4，NRa3Ra4，5至6元杂芳基，5至6元杂环烷基，其中Ra3和Ra4各自独立选自H、C1-C4烷基、苯基、或Ra3和Ra4与桥接的氮原子形成杂环烷基。
在本发明一些实施方式中，X选自H和F。
在本发明一些实施方式中，R1选自可选地至少单取代的C1-C8烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基-C1-C4烷基，可选地至少单取代的4至7元杂环烷基，可选地至少单取代的苯基，可选地至少单取代的5至6元杂芳基，所述R1中，C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基-C1-C4烷基、4至7元杂环烷基、苯基、5至6元杂芳基的取代基各自独立地选自卤素。
在本发明一些实施方式中，R1选自如下之一所示的基团：
在本发明一些实施方式中，R2选自H，卤素，C1-C4烷氧基。
在本发明一些实施方式中，所述异构体选自对映异构体、非对映异构体、顺反异构体或立体异构体。
在本发明一些实施方式中，所述化合物选自：
(S)-3-异丙基-6-((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(R)-3-异丙基-6-((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异戊基-6-((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-环丁基-6-((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
6-(((S)-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-(4,4,4-三氟-2-丁基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-(四氢-2H-4-吡喃基)-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-(4-(哌啶-1-甲酸叔丁酯基))-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-(4-哌啶基)-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-苯基-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-(2-吡啶基)-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-(3,5-二氟苯基)-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-5-氟-3-异丙基-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-5-氯-3-异丙基-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-5-溴-3-异丙基-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异丙基-6-((5-甲氧基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异丙基-6-((6-甲氧基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异丙基-6-((7-甲氧基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异丙基-6-((5-氨基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异丙基-6-((6-氨基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异丙基-6-((7-氨基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((5-氟-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((6-氟-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((7-氟-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((5-氯-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((6-氯-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((7-氯-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((5-溴-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((6-溴-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-6-((7-溴-(1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮；
(S)-3-异丙基-6-((4-甲基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
本发明另一方面提供所述的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备药物中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述药物选自肌球蛋白抑制剂；
在本发明一些实施方式中，所述药物选自用于治疗心脏疾病的药物，优选选自用于治疗心脏舒张和/或收缩功能缺陷的药物，更优选选自用于治疗与左心室肥大和/或舒张期功能障碍相关心脏疾病的药物，进一步优选选自用于治疗肥厚型心肌病、射血分数保留的舒张性心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛和限制性心肌病、慢性二尖瓣返流、慢性主动脉瓣狭窄、慢性系统性高血压的药物。
本发明另一方面提供一种药物组合物，包括所述的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的载体、添加剂、助剂或赋形剂。
附图说明
图1显示为本发明实施例7对大鼠离体心脏左室收缩压的作用示意图。
图2显示为本发明实施例7对大鼠离体心脏左室+dP/dt的作用示意图。
图3显示为本发明实施例7对大鼠离体心脏左室-dP/dt的作用示意图。
图4显示为本发明实施例7大鼠静脉和口服给予I-1的药时曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量实践研究，提供了一种新的可以作为肌球蛋白抑制剂的化合物，所述化合物相较于现有技术中常用的MYK-461具有更优的活性和更理想的药代动力学特性，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，所述化合物的化学结构式如式I所示：
其中，X选自H、F、Cl、Br或I；
R1选自可选地至少单取代的C1-C8烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基-C1-C4烷基，可选地至少单取代的4至7元杂环烷基，可选地至少单取代的苯基，可选地至少单取代的苯基-C1-C4烷基，可选地至少单取代的5至6元杂芳基，可选地至少单取代的5至6元杂芳基-C1-C4烷基，所述R1中，C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基-C1-C4烷基、4至7元杂环烷基、苯基、苯基-C1-C4烷基、5至6元杂芳基、5至6元杂芳基-C1-C4烷基的取代基各自独立地选自卤素、CN、羟基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、苯基、苯基-C1-C4烷基、苯基-C1-C4烷氧基、苯氧基、-CORa1、-CO2Ra1、SO2Ra1、SO2NRa1和-CONRa1Ra2，其中Ra1和Ra2各自独立选自H、C1-C4烷基和苯基、或Ra1和Ra2与桥接的氮原子形成4至6元杂环烷基；
R2选自H，卤素，CN，羟基，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，C1-C4烷氧基，苯基，苯基-C1-C4烷基，苯基-C1-C4烷氧基、苯氧基，-CORa3，-CO2Ra3，SO2Ra3，SO2NRa3Ra4，-CONRa3Ra4，NRa3Ra4，5至6元杂芳基，5至6元杂环烷基，其中Ra3和Ra4各自独立选自H、C1-C4烷基、苯基、或Ra3和Ra4与桥接的氮原子形成杂环烷基。
除非另外指明，本发明的化合物的同位素标记的形式也包括在本发明的保护范围以内。例如，具有上述所给出的具有本发明结构的化合物中，至少一个氢原子被氘或氚替代，或至少一个碳被13C-或14C-富集的碳替代，或至少一个氮被15N-富集的氮替代。
本发明中，术语“盐”应当被理解为由本发明使用的任何形式的活性化合物，其中所述化合物可以为离子形式或带电荷或被偶联到反离子(阳离子或阴离子)或在溶液中。这个定义还可以包括活性分子与其它分子和离子的季铵盐和络合物，特别是通过离子相互作用的络合物。该定义尤其包括生理上可接受的盐，该术语可以被理解为与“药理学上可接受的盐”等同。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”通常指当以适当的方式用于治疗时(特别是在人类和/或哺乳动物中应用或使用时)在生理学上可耐受的任何盐(通常来说，这意味着它是无毒的，特别是作为抗衡离子的结果是无毒的)。这些生理上可接受的盐可以是与阳离子或碱形成的，并且在本发明的上下文中，尤其是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常为酸(去质子化的)，如阴离子和至少一种生理学上耐受的阳离子(优选无机阳离子)形成的盐。在本发明的上下文中，具体地可以包括与碱金属和碱土金属形成的盐、以及与铵阳离子(NH4 +)形成的盐，具体可以是包括但不限于与(单)或(二)钠、(单)或(二)钾、镁或钙形成的盐。这些生理上可接受的盐也可以是与阴离子或酸形成的，并且在本发明的上下文中，特别是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常质子化的(例如在氮上)，如阳离子和至少一种生理上可耐受的阴离子形成的盐。在本发明的上下文中，具体地可以包括由生理上可耐受的酸形成的盐，即特定的活性化合物与生理上可耐受的有机或无机酸形成的盐，具体可以是包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳酸或柠檬酸形成的盐。
由上述式I表示的本发明化合物可以包括取决于存在的手性中心的对映体或取决于存在的双键的异构体(例如Z,E)。单一异构体、对映异构体、非对映异构体或顺反异构体和它们的混合物均落入本发明的范围之内。
本发明中术语“前药”以其最广泛的意义使用，并且包括在体内可以转化为本发明的化合物的那些衍生物。制备指定的起作用化合物的前药的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以参阅如Krogsgaard-Larsen等人，“药物设计和发现教科书”(Textbook of Drug design and Discovery)泰勒弗朗西斯出版社Taylor&Francis(2002年4月)中所公开的相关内容。
本发明中，术语“溶剂化物”通常指任何形式的根据本发明的活性化合物通过非共价键与另一分子(通常为极性溶剂)相结合，所获得的物质，具体可以是包括但不限于水化物和醇化物，例如甲醇化物。
本发明中，所述“卤素”或“卤代”通常指氟、氯、溴或碘。
本发明中，所述“烷基”通常指饱和脂肪族基团，它们可以是直链或支链。例如，C1-8烷基通常指包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个碳原子的烷基基团，所述烷基基团具体可以是包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。
本发明中，“环烷基”通常指具有碳原子的饱和或不饱和(但不是芳族)环烃。例如，C3-8环烷基通常指具有3个、4个、5个、6个、7个、8个碳原子的饱和或不饱和(但不是芳族)环烃，所述环烷基具体可以是包括但不限于环丙基、2-甲基环丙基、环丙基甲基、环丁基、环戊基、环戊基甲基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基、降金刚烷基等。
本发明中，“卤代烷基”通常指卤代的饱和脂肪族基团，它们可以是直链或支链的、并且可选地被独立地选自氟、氯、溴或碘单取代或多取代。例如，C1-4卤代烷基通常指包括1个、2个、3个、4个碳原子的卤代烷基基团，所述卤代烷基基团具体可以是包括但不限于卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、卤代丁基等。
本发明中，“杂环烷基”通常指饱和或不饱和(但不是芳族)环烃，并且在其结构中具有至少一个选自N、O或S的杂原子。所述杂环烷基具体可以是包括但不限于吡咯啉、吡咯烷、吡唑啉、氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环氧乙烷、氧杂环丁烷、二氧杂环丁烷、四氢吡喃、四氢呋喃、二恶烷、二氧戊环、恶唑烷、哌啶、哌嗪、吗啉、氮杂环庚烷或二氮杂环庚烷等。本发明中的杂环烷基通常是4、5、6或7元环体系。
本发明中，“杂芳基”通常指具有至少一个芳族环并且可以任选地含有一个或多个选自N、O的杂原子的杂环体系。所述杂芳基具体可以是包括但不限于呋喃、苯并呋喃、吡咯、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、喹啉、异喹啉、酞嗪、***、吡唑、异恶唑、吲哚、苯并***、苯并二氧戊环、苯并二恶烷、苯并咪唑、咔唑和喹唑啉等。本发明中的杂芳基可以是5或6元环体系。
在本发明一些优选实施例中，X选自H和F。
在本发明一些优选实施例中，R1中，C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基-C1-C4烷基、4至7元杂环烷基、苯基、苯基-C1-C4烷基、5至6元杂芳基、5至6元杂芳基-C1-C4烷基各自独立地可以是可选地被单取代或多取代，即各自独立地可以是未取代、单取代或多取代，具体可选地可以被1、2、3个取代基取代。
在本发明一些优选实施例中，R1选自可选地至少单取代的C1-C8烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基，可选地至少单取代的C3-C8环烷基-C1-C4烷基，可选地至少单取代的4至7元杂环烷基，可选地至少单取代的苯基，可选地至少单取代的5至6元杂芳基，所述R1中，C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基-C1-C4烷基、4至7元杂环烷基、苯基、5至6元杂芳基的取代基各自独立地选自卤素。
在本发明一些更佳实施例中，R1选自可选地至少单取代的C1-C8烷基，C3-C8环烷基，4至7元杂环烷基，可选地至少单取代的苯基，5至6元杂芳基，所述R1中，C1-C8烷基、苯基的取代基各自独立地选自F。
在本发明一些进一步优选实施例中，R1选自如下之一所示的基团：
在本发明一些优选实施例中，R2选自H，卤素，C1-C4烷氧基。
在本发明一些进一步优选的实施例中，所述化合物可以是如表1中所示的化合物：
表1
本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的化合物的制备方法，包括：将式4化合物与式5化合物反应，制备获得式I化合物。
本发明所提供的制备方法中，所述反应可以在缚酸剂存在的条件下进行，本领域技术人员可选择合适种类和用量的缚酸剂用于上述的缩合反应。例如，所述缚酸剂可以是有机碱和/或无机碱，具体可以是包括但不限于N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、DBU、吡啶、碳酸钠、碳酸钾或碳酸铯等中的一种或多种的组合。在本发明一优选实施例中，所述缚酸剂可以是N,N-二异丙基乙胺和/或三乙胺。再例如，缚酸剂的使用当量可以为式4化合物的2～4倍量、2～2.5倍量、2.5～3倍量、3～3.5倍量、或3.5～4倍量。
本发明所提供的制备方法中，式5化合物的用量相对于式4化合物通常是基本等量或过量的，例如，式5化合物与式4化合物的摩尔比可以为1～4:1、1～1.2:1、1.2～1.4:1、1.4～1.6:1、1.6～1.8:1、1.8～2:1、2～2.5:1、2.5～3:1、3～3.5:1、或3.5～4:1。通常来说，当式5化合物过量较多时，反应可以不添加缚酸剂，例如，当式5化合物与式4化合物的摩尔比超过3:1，反应可以不添加缚酸剂。
本发明所提供的制备方法中，反应通常可以在室温至反应溶剂沸点的条件下进行，优选可以在加热条件下进行，例如，反应温度可以为80℃～100℃，优选可以为90℃～100℃。本领域技术人员可根据反应进程适当调整缩合反应的反应时间，监测反应进程的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如可以是色谱法、核磁共振法等分析方法，具体的反应时间可以是例如12～24小时、12～16小时、16～20小时、或20～24小时。
本发明所提供的制备方法中，反应通常在溶剂存在的条件下进行，所述溶剂通常可以是反应原料的良溶剂，从而可以充分分散反应原料以保证反应的顺利进行。合适的反应溶剂的种类和用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，反应溶剂可以是二氧六环、乙二醇二甲醚、甲苯、二甲苯、DMF或DMSO等中的一种或多种的组合。
本发明所提供的制备方法中，反应通常可以在气体保护的条件下反应，合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气和/或稀有气体，提供气体保护条件，具体可以是包括但不限于氮气、氦气、氖气、氩气、氪气等中的一种或多种的组合。
本发明所提供的制备方法中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应产物进行后处理，例如，可以包括：萃取，有机相脱溶、纯化。
本发明所提供的制备方法中，式4化合物的制备方法为本领域技术人员已知的，例如，可以参考CN105473576、或WO2019028360等进行制备。
本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备药物中的用途。如上所述，本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物可以作为肌球蛋白抑制剂，可抑制心肌收缩，从而可以作为用于治疗心脏舒张和/或收缩功能缺陷(过强或过弱)等疾病的药物，优选为改善在舒张期内的心室舒张，而进行治疗与左心室肥大和/或舒张期功能障碍相关心脏疾病的药物，更优选为治疗肥厚型心肌病。本发明的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物可特定地靶向病因或作用于其它下游途径。本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物也可对患有射血分数保留的舒张性心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛或限制性心肌病的患者给予益处。本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物也可促进由于容量或压力过度复合造成的左心室肥大的有益心室重构，例如，慢性二尖瓣返流、慢性主动脉瓣狭窄或慢性系统性高血压等。这些药物联合旨在纠正或减轻容量或压力过度负荷的主要原因的疗法(包括瓣修复/替换或有效的抗高血压疗法等)。通过降低左心室充盈压，化合物可降低肺水肿和呼吸衰竭的风险。降低或消除功能性二尖瓣返流和/或降低左心房压力可降低突发性或持久性心房纤颤的风险，且其降低了动脉血栓栓塞性并发症包括但不限于脑动脉栓塞性中风的伴随性风险。降低或消除动态和/或静态左心室流出道阻塞，可减少需要间隔消融治疗(手术或经皮)的可能性及其短期和长期并发症的伴随性风险。所述化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物可降低与HCM相关的慢性局部缺血状态的严重性，且由此降低具有可植入的复律器-除颤器的患者中的心脏性猝死或其等同疾病的风险和/或降低对于可能有毒的抗心律不齐药物的需求。化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物可有效降低或消除对于并行药物的需求，还可降低间质性心肌纤维化和/或减缓左心室肥大的进展、阻止或逆转左心室肥大。
本发明第四方面提供一种药物组合物，包括本发明第一方面所提供的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，所述药物组合物还可以包括至少一种药学上可接受的载体。
本发明中，所述组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体，其通常指用于治疗剂给药的载体，它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域技术人员所熟知的，例如，在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中公开了关于药学上可接受的载体的相关内容。具体来说，所述载体可以是包括但不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂等中的一种或多种的组合。
本发明所提供的药物组合物中，所述化合物可以是单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。所述其他活性组分可以是其他各种可以用于心脏疾病、肥厚型心肌病的药物。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述化合物和药物组合物的活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述化合物的施用量通常可以为0.1～1000mg/kg/day、20～200mg/kg/day、0.1～0.3mg/kg/day、0.3～0.5mg/kg/day、0.5～1mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～150mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、或500～1000mg/kg/day。
本发明所提供的化合物可以适应于任何形式的给药方式，可以是口服或胃肠外给药，例如，可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射，更具体可以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、***、口服或胃肠外给药。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、滴剂或糖浆等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂。
本发明第五方面提供一种治疗方法包括：向个体施用治疗有效量的本发明第一方面所提供的化合物、或本发明第四方面所提供的药物组合物。
本发明中，“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用所述制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。
本发明中，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物相较于现有技术中其他同类药物具有更优的活性和更理想的药代动力学特性，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
实施例1
(S)-3-异丙基-6-((1-(1,2,3,4-四氢-1-萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-1)的制备
异丙脲2a的合成：将异丙胺(5.13g,86.80mmol)溶于无水CH2Cl2(25mL)，降温至0℃，在氩气保护下，向反应溶液中逐滴加入三甲基硅基异氰酸酯(10.01g,86.80mmol)。滴加完毕后，移至室温下搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，逐滴加入8mL无水甲醇，并于室温下继续搅拌3h。减压浓缩，残留物加入***洗涤并过滤，滤饼于50℃下烘干得白色固体6.12g，收率69.1％。LC/MS(ESI+):m/z 103[M+H]+.
1-异丙基巴比妥酸3a的合成：将2a(6.12g,59.95mmol)溶于CH3OH(20mL)，加入丙二酸二甲酯(8.31g,62.95mmol)和现制甲醇钠(16.19g，299.76mmol)，在氩气保护下，于65℃搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，用浓盐酸调节pH至3。减压浓缩，残留物溶于无水EtOH(65mL)并于室温下搅拌2.5h。抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)得白色固体7g，收率68.6％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.20(s,1H),4.82(m,1H),3.57(s,2H),1.32(d,J＝6.9Hz,6H).LC/MS(ES+):m/z 171[M+H]+.
6-氯-3-异丙基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮4a的合成：将3a(7g,41.16mmol)和三乙基苄基氯化铵(18.75g,82.32mmol)溶于POCl3(45mL)，在氩气保护下，于50℃搅拌反应过夜。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温。减压浓缩，将残留物溶于CH2Cl2(70mL)，缓慢加入水(70mL)，萃取洗涤，分出有机层，再分别用H2O(250mL)和饱和氯化钠(250mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:4作为洗脱剂)得黄色固体1.15g，收率14.9％。1H NMR(500MHz,CDCl3-d6)δ(ppm):10.07(s,1H),5.84(s,1H),5.14(m,1H),1.48(d,J＝7Hz,6H).
I-1的合成：将4a(400mg,2.13mmol)和(S)-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5a(627mg,4.26mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)，加入DIPEA(824mg,6.38mmol)，在氮气保护下，于95℃搅拌20h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解，0.16mmol/ml稀盐酸(40mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(150mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝150:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体145mg，收率22.8％。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.67(s,1H),7.27-7.17(m,3H),7.14(d,J＝7.4Hz,1H),6.39(s,1H),4.99(m,1H),4.77(s,1H),4.64-4.57(m,1H),2.74(m,2H),1.95-1.85(m,1H),1.82-1.72(m,3H),1.33(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.87,151.96,150.95,137.67,136.54,129.43,129.06,127.82,126.55,73.61,49.51,42.81,29.02,28.92,19.91,19.52.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C17H22N3O2 300.1712；found300.1697
实施例2
(R)-3-异丙基-6-((1-(1,2,3,4-四氢-1-萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-2)的制备
I-2的合成：以化合物4a(500mg,2.65mmol)和(R)-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5b(781mg，5.30mmol)为原料，操作同I-1，得黄色固体96mg，收率12.1％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.67(s,1H),7.27-7.17(m,3H),7.14(d,J＝7.4Hz,1H),6.39(s,1H),4.99(m,1H),4.78(s,1H),4.65-4.57(m,1H),2.83-2.66(m,2H),1.89(m,1H),1.82-1.70(m,3H),1.33(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.86,151.95,150.94,137.67,136.53,129.44,129.08,127.83,126.56,73.59,49.48,42.78,29.00,28.92,19.91,19.51.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C17H22N3O2 300.1712；found 300.1694
实施例3
(S)-3-(3-戊基)-6-((1,2,3,4-四氢-1-萘基)氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-3)的制备
1-(3-戊基)脲2b的合成：将3-氨基戊烷(3g,34.42mmol)溶于无水CH2Cl2(20mL)，降温至0℃，在氩气保护下，向反应溶液中逐滴加入三甲基硅基异氰酸酯(3.97g,34.42mmol)。滴加完毕后，移至室温下搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，逐滴加入10mL无水甲醇，并于室温下继续搅拌2h。减压浓缩，残留物加入***洗涤并过滤，滤饼于50℃下烘干得白色固体3.69g，收率82.4％。LC/MS(ES+):m/z 131[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):4.31(s,2H),4.24(s,1H),3.54-3.43(m,1H),1.61-1.53(m,2H),1.45-1.35(m,2H),0.94(t,J＝7.4Hz,6H).
1-(3-戊基)巴比妥酸3b的合成：将2b(2.7g,20.74mmol)溶于CH3OH(12mL)，加入丙二酸二甲酯(2.88g,21.78mmol)和现制甲醇钠(5.6g,103.70mmol)，在氩气保护下，于65℃搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，用浓盐酸调节pH至3。减压浓缩，残留物溶于无水EtOH(50mL)并于室温下搅拌1.5h。抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)得白色固体1.4g，收率36.6％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):7.94(s,1H),4.60(s,1H),3.67(s,2H),2.07-1.96(m,2H),1.84-1.74(m,2H),0.88(t,J＝7.5Hz,6H).LC/MS(ES+):m/z 199[M+H]+.
6-氯-3-(3-戊基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮4b的合成：将3b(1.4g,6.48mmol)和三乙基苄基氯化铵(2.95g,12.96mmol)溶于POCl3(20mL)，在氩气保护下，于50℃搅拌反应过夜。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温。减压浓缩，将残留物溶于CH2Cl2(40mL)，缓慢加入水(50mL)，萃取洗涤，分出有机层，再分别用H2O(150mL)和饱和氯化钠(150mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝150:1作为洗脱剂)得白色固体671mg，收率43.8％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):10.71(s,1H),5.86(s,1H),4.77(s,1H),2.08(d,J＝14.8Hz,2H),1.83-1.74(m,2H),0.88(t,J＝7.5Hz,6H).
I-3的合成：将4b(600mg,2.77mmol)和(S)-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5a(815mg,5.54mmol)溶于1,4-二氧六环(13mL)，加入DIPEA(1.789g,13.85mmol)，在氮气保护下，于90℃搅拌24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解，0.16mmol/ml稀盐酸(50mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(150mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝150:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体279mg，收率30.8％。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.62(s,1H),7.28-7.17(m,3H),7.14(d,J＝7.0Hz,1H),6.39(s,1H),4.82-4.72(s,1H),4.62(s,1H),4.51-4.33(m,1H),2.75(m,2H),12.04-1.93(m,2H),1.92-1.87(m,1H),1.83-1.72(m,3H),1.67-1.57(m,2H),0.76(t,J＝7.3Hz,6H).13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):164.83,152.09,137.69,136.53,129.44,129.11,127.84,126.54,114.76,72.96,53.88,49.52,28.98,28.92,24.72,19.49,11.57.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C19H26N3O2 328.2025；found 328.2005
实施例4
(S)-3-环丁基-6-((1,2,3,4-四氢-1-萘基)氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-4)的制备
1-环丁基脲2b的合成：将3-氨基戊烷(1.85g,26.04mmol)溶于无水CH2Cl2(15mL)，降温至0℃，在氩气保护下，向反应溶液中逐滴加入三甲基硅基异氰酸酯(3.0g,26.04mmol)。滴加完毕后，移至室温下搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，逐滴加入8mL无水甲醇，并于室温下继续搅拌1.5h。减压浓缩，残留物加入***洗涤并过滤，滤饼于50℃下烘干得白色固体2.77g，收率93.3％。LC/MS(ES+):m/z 115[M+H]+.1HNMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):4.78(s,1H),4.40(s,2H),4.11(d,J＝7.0Hz,1H),2.42-2.32(m,2H),1.86(m,2H),1.73(m,2H).
1-环丁基巴比妥酸3c的合成：将2c(1.5g,13.14mmol)溶于CH3OH(10mL)，加入丙二酸二甲酯(2.60g,19.71mmol)和现制甲醇钠(3.55g,65.71mmol)，在氩气保护下，于65℃搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，用浓盐酸调节pH至3。减压浓缩，残留物溶于无水EtOH(40mL)并于室温下搅拌1h。抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)得白色固体1.1g，收率44.6％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):8.12(s,1H),5.06(p,J＝9.0Hz,1H),3.64(s,2H),2.85-2.73(m,2H),2.29(dd,J＝17.2,8.7Hz,2H),1.92(dd,J＝20.8,10.1Hz,1H),1.76(dd,J＝19.0,8.9Hz,1H).LC/MS(ES+):m/z 199[M+H]+.
6-氯-3-环丁基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮4c的合成：将3c(1.07g,5.86mmol)和三乙基苄基氯化铵(1.87g,8.20mmol)溶于POCl3(20mL)，在氩气保护下，于50℃搅拌反应过夜。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温。减压浓缩，将残留物溶于CH2Cl2(40mL)，缓慢加入水(50mL)，萃取洗涤，分出有机层，再用分别用H2O(150mL)和饱和氯化钠(150mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝150:1作为洗脱剂)得白色固体450mg，收率38.3％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):9.34(s,1H),5.83(s,1H),5.27-5.18(m,1H),2.99-2.87(m,2H),2.25(dd,J＝17.3,8.6Hz,2H),1.92(dd,J＝20.2,10.1Hz,1H),1.82-1.71(m,1H).
I-4的合成：将4c(400mg,1.99mmol)和(S)-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5a(587mg,3.99mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)，加入DIPEA(773mg，5.98mmol)，在氮气保护下，于90℃搅拌24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解，0.16mmol/ml稀盐酸(40mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体150mg，收率24.2％。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.75(s,1H),7.25-7.16(m,3H),7.14(d,J＝7.6Hz,1H),6.42(s,1H),5.26-5.14(m,1H),4.78(s,1H),4.66-4.57(m,1H),2.95-2.85(m,2H),2.83-2.66(m,2H),2.05-1.98(m,2H),1.93-1.84(m,1H),1.81-1.74(m,3H),1.70-1.60(m,1H),1.27-1.22(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.98,152.05,151.37,137.66,136.54,129.43,128.97,127.81,126.55,73.48,49.53,45.10,29.08,28.91,27.23,19.56,14.74.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C18H22N3O2 312.1712；found 312.1694
实施例5
(S)-3-(4-四氢吡喃基)-6-((1,2,3,4-四氢-1-萘基)氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-6)的制备
1-(4-四氢吡喃基)脲2d的合成：将4-氨基四氢吡喃(878mg,8.68mmol)溶于无水CH2Cl2(10mL)，降温至0℃，在氩气保护下，向反应溶液中逐滴加入三甲基硅基异氰酸酯(1.0g,8.68mmol)。滴加完毕后，移至室温下搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，逐滴加入8mL无水甲醇，并于室温下继续搅拌1h。减压浓缩，残留物加入***洗涤并过滤，滤饼于50℃下烘干得白色固体427mg，收率34.1％。1H NMR(500MHz,CH3OD)δ(ppm):3.95-3.89(m,2H),3.71-3.63(m,1H),3.49(m,J＝11.6,2.1Hz,2H),1.86(m,J＝12.6,2.1Hz,2H),1.51-1.40(m,2H).LC/MS(ES+):m/z 145[M+H]+.
1-(4-四氢吡喃基)巴比妥酸3d的合成：将2d(452mg,3.14mmol)溶于CH3OH(10mL)，加入丙二酸二甲酯(435mg,3.29mmol)和现制甲醇钠(423mg,7.84mmol)，在氩气保护下，于65℃搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，用浓盐酸调节pH至5。减压浓缩，残留物溶于无水EtOH(40mL)并于室温下搅拌0.5h。抽滤，浓缩滤液，得白色固体550mg，收率89.0％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):8.29(s,1H),4.82-4.90(m,J＝12.3,4.0Hz,1H),4.10(dd,J＝11.5,4.5Hz,2H),3.66(d,J＝12.6Hz,2H),3.48-3.43(m,2H),2.62-2.70(m,2H),1.62-1.53(m,2H).LC/MS(ES+):m/z 213[M+H]+.
6-氯-3-(4-四氢吡喃基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮4d的合成：将3d(500mg,2.36mmol)和三乙基苄基氯化铵(751mg,3.30mmol)溶于POCl3(6mL)，在氩气保护下，于50℃搅拌反应过夜。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温。减压浓缩，将残留物溶于CH2Cl2(40mL)，缓慢加入水(50mL)，萃取洗涤，分出有机层，再用分别用H2O(100mL)和饱和氯化钠(100mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥。抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝150:1作为洗脱剂)得白色固体357mg，收率65.7％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):9.52(s,1H),5.86(s,1H),4.94-5.04(m,1H),4.09(dd,J＝11.4,4.3Hz,2H),3.50(t,J＝11.4Hz,2H),2.70-2.80(m,2H),1.55(d,J＝9.9Hz,2H).
I-6的合成：将4d(120mg,0.52mmol)和(S)-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5a(305mg,2.08mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)，在氮气保护下，于90℃搅拌24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解，H2O(60mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(60mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体64mg，收率36％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):9.69(s,1H),7.28-7.11(m,4H),5.03(s,1H),4.99(s,1H),4.97-4.92(m,1H),4.56-4.52(m,1H),3.99(dd,J＝11.3,4.1Hz,1H),3.91(dd,J＝12.0,3.8Hz,1H),3.42(td,J＝11.5,5.2Hz,2H),2.90-2.75(m,2H),2.69-2.52(m,2H),2.08-2.00(m,2H),1.82-1.98(m,3H),1.46-1.52(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.78,152.08,151.10,137.68,136.51,129.43,129.03,127.82,126.55,73.54,67.66,49.55,48.44,29.19,29.06,28.92,19.53.
实施例6
(S)-3-(4-(哌啶-1-甲酸叔丁酯基))-6-(((1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-7)的制备
1-(N-Boc-4-哌啶基)脲2e的合成：将N-Boc-4-氨基哌啶(2.61g,13.04mmol)溶于无水CH2Cl2(18mL)，降温至0℃，在氩气保护下，向反应溶液中逐滴加入三甲基硅基异氰酸酯(1.5g,13.04mmol)。滴加完毕后，移至室温下搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，逐滴加入10mL无水甲醇，并于室温下继续搅拌2h。减压浓缩，残留物加入***洗涤并过滤，滤饼于50℃下烘干得白色固体2.28g，收率71.9％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):4.48(d,J＝7.6Hz,1H),4.36(s,2H),4.05(s,2H),3.78-3.69(m,1H),2.87(s,2H),1.96(d,J＝11.0Hz,2H),1.47(s,9H),1.29(d,J＝11.3Hz,2H).LC/MS(ES+):m/z 244[M+H]+.
1-(N-Boc-哌啶基)巴比妥酸3e的合成：将2e(2.28g,9.38mmol)溶于CH3OH(12mL)，加入丙二酸二甲酯(1.30g,9.85mmol)和现制乙醇钠(1.56g,23.45mmol)，在氩气保护下，于65℃搅拌反应过夜。LC/MS检测反应完毕，将反应液冷却至0℃，用浓盐酸调节pH至4。减压浓缩，将残留物溶于CH2Cl2(60mL)，缓慢加入水(60mL)，萃取洗涤，分出有机层，再用分别H2O(150mL)和饱和氯化钠(150mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥。。抽滤，浓缩滤液，用正己烷：乙酸乙酯＝1:3打浆，得白色固体2.20g，收率75.4％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):11.26(s,1H),5.36(s,2H),4.63(s,1H),3.79(d,J＝12.4Hz,2H),2.82(s,3H),2.22(d,J＝9.7Hz,2H),1.53(d,J＝10.8Hz,2H),1.41(s,9H).LC/MS(ES+):m/z 312[M+H]+.
6-氯-3-(4-哌啶基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮盐酸盐4e的合成：将3e(1.0g,3.21mmol)溶于POCl3(12mL)，冰浴下缓慢滴加0.35mL纯水，在氩气保护下，于80℃搅拌反应4h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温。减压浓缩，用乙醇打浆，得白色固体737mg，收率86.3％。1H NMR(500MHz,DMSO)δ(ppm):12.38(s,1H),9.12(s,1H),8.43(s,1H),5.93(s,1H),4.93-4.80(m,1H),3.32(d,J＝12.0Hz,2H),2.98(dd,J＝23.1,11.4Hz,2H),2.73-2.62(m,2H),1.72(d,J＝12.6Hz,2H).
6-氯-3-(N-Boc-4-哌啶基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮6e的合成：将4e(737mg，2.77mmol)溶于四氢呋喃(10mL)，加入0.45mL三乙胺，并在室温下滴加(Boc)2O的四氢呋喃溶液(10mL)，于70℃回流反应13h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，得白色固体808mg，收率88.5％。1H NMR(500MHz,DMSO)δ(ppm):12.30(s,1H),5.87(s,1H),4.75(t,J＝12.0Hz,1H),4.02(s,2H),2.73(s,2H),2.38-2.30(m,2H),1.50(d,J＝9.9Hz,2H),1.41(s,9H).
I-4的合成：将5e(200mg,0.61mmol)和(S)-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5a(357mg,2.43mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)，在氮气保护下，于120℃搅拌24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解，1mol/L稀盐酸(20mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体86mg，收率32.2％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.75(s,1H),7.25-7.18(m,3H),7.14(d,J＝7.6Hz,1H),6.44(s,1H),4.81(s,1H),4.80-4.74(m,1H),4.65-4.60(m,1H),4.07-3.98(m,2H),2.82-2.66(m,4H),2.42-2.34(m,2H),1.94-1.85(m,1H),1.81-1.72(m,3H),1.46-1.42(m,2H),1.41(s,9H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):189.41,163.77,154.23,152.12,151.11,137.68,136.47,129.44,129.02,127.83,126.55,79.09,73.53,60.21,49.56,49.06,29.04,28.91,28.57,28.13,19.51,14.55.
实施例7
(S)-5-氯-3-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢-1-萘基)氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-13)的制备
I-13的合成：将I-1(80mg,0.27mmol)溶于乙酸(1.5mL)中，加入N-氯代丁二酰亚胺NCS(36mg,0.27mmol)，于室温搅拌反应1h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)检测原料反应完毕，停止反应，减压浓缩，残留物中加入水(30mL)和乙酸乙酯(30mL)搅拌溶解，分出有机层，再用水(30mL×2)洗涤，饱和氯化钠(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:4)打浆得白色固体43mg，收率48.2％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.99(s,1H),7.22-7.15(m,3H),7.13-7.09(m,1H),6.84(d,J＝9.8Hz,1H),5.18-5.08(m,1H),5.07-4.98(m,1H),2.83-2.67(m,2H),1.95-1.81(m,1H),1.95-1.82(m,2H),1.78-1.67(m,1H),1.38(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):159.15,150.17,149.35,137.79,137.54,129.22,127.73,127.37,126.41,81.52,50.55,44.62,30.54,29.07,20.79,19.80.
实施例8
(S)-5-溴-3-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢-1-萘基)氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-14)的制备
I-14的合成：将I-1(146mg,0.49mmol)溶于乙酸(4mL)中，加入N-溴代丁二酰亚胺NBS(87mg，0.49mmol)，于室温搅拌反应1h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，减压浓缩，残留物中加入水(50mL)和乙酸乙酯(50mL)搅拌溶解，分出有机层，再用水(50mL×2)洗涤，饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体69mg，收率37.4％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):(s,1H),7.18(m,3H),7.12(d,J＝3.6Hz,1H),6.54(d,J＝9.7Hz,1H),5.12(m,1H),5.03(m,1H),2.74(m,2H),2.02-1.95(m,1H),1.92-1.83(m,2H),1.77-1.68(m,1H),1.37(d,J＝6.8Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):159.24,150.48,150.04,137.79,137.45,129.28,127.71,127.44,126.48,71.33,50.79,44.90,30.44,29.03,20.77,19.82.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd forC18H22N3O2378.0817；found 378.0801
实施例9
(S)-3-异丙基-6-((5-甲氧基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-15)的制备
I-15的合成：将4a(150mg,0.80mmol)和(S)-5-甲氧基-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5c(536mg，3.03mmol)溶于1,4-二氧六环(8mL)中，120℃回流反应24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解，H2O(50mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(70mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体120mg，收率45.5％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm):9.95(s,1H),7.17(t,J＝7.9Hz,1H),6.90(d,J＝7.7Hz,1H),6.77(d,J＝8.0Hz,1H),5.09-5.00(m,1H),4.96(d,J＝2.2Hz,1H),4.92(d,J＝7.8Hz,1H),4.55-4.48(m,1H),3.84(s,3H),2.71-2.80(m,1H),2.66-2.55(m,1H),2.02-1.88(m,2H),1.79-1.88(m,2H),1.31(d,J＝6.9Hz,6H).13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.89,158.87,151.82,150.96,139.07,130.42,128.52,113.63,113.11,73.56,55.52,49.04,42.82,29.26,29.08,19.91,19.35.
实施例10
(S)-3-异丙基-6-((6-甲氧基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-16)的制备
I-16的合成：将4a(92mg,0.49mmol)和(S)-6-甲氧基-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5d(345mg，1.95mmol)溶于1,4-二氧六环(6mL)中，120℃回流反应24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解，H2O(50mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(60mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体63mg，收率39.0％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.60(s,1H),7.15(d,J＝8.5Hz,1H),6.78(dd,J＝8.5,2.4Hz,1H),6.69(s,1H),6.28(s,1H),4.94-5.03(m,1H),4.75(s,1H),4.58-4.49(m,1H),3.73(s,3H),2.76-2.66(m,2H),1.91-1.82(m,1H),1.68-1.80(m,3H),1.32(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3-d6)δ(ppm):164.92,159.06,152.32,151.16,138.93,
实施例11
(S)-3-异丙基-6-((7-甲氧基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-17)的制备
I-17的合成：将4a(105mg,0.56mmol)和(S)-7-甲氧基-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5e(296mg，1.67mmol)溶于1,4-二氧六环(6mL)中，120℃回流反应24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(50mL)溶解,有机层再用饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体90mg，收率48.9％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.66(s,1H),7.06(d,J＝8.4Hz,1H),6.82(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.79(s,1H),6.38(s,1H),4.91-5.03(m,1H),4.76(s,1H),4.60-4.50(m,1H),3.71(s,3H),2.76-2.58(m,2H),1.94-1.81(m,1H),1.80-1.67(m,3H),1.33(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.89,157.96,150.96,137.41,130.45,129.61,114.29,113.60,73.67,55.58,49.77,49.06,42.85,28.88,28.11,19.90,19.68.
实施例12
(S)-3-异丙基-6-((7-氨基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-20)的制备
I-20的合成：将4a(120mg,0.64mmol)和(S)-7-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5f(367mg,1.91mmol)溶于1,4-二氧六环(12mL)中，120℃回流反应24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(70mL)溶解，有机层再用饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得黄色固体60mg，收率27.3％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.64(s,1H),6.79(d,J＝8.3Hz,1H),6.48(d,J＝7.0Hz,1H),6.46(s,1H),6.33(s,1H),5.11(s,2H),5.01-4.95(m,1H),4.74(s,1H),4.48-4.41(m,1H),2.64-2.54(m,2H),1.87-1.81(m,1H),1.73-1.66(m,3H),1.33(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):
实施例13
(S)-3-异丙基-6-((7-氟-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-23)的制备
I-23的合成：将4a(142mg,0.75mmol)和(S)-7-氟-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5g(498mg,3.01mmol)溶于1,4-二氧六环(13mL)中，120℃回流反应24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(70mL)溶解，有机层再用饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得黄色固体91mg，收率38.2％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.71(s,1H),7.22-7.17(m,1H),7.03-7.11(m,2H),6.40(d,J＝8.4Hz,1H),4.94-5.03(m,1H),4.77(s,1H),4.57-4.66(m,1H),2.80-2.67(m,3H),1.96-1.89(m,1H),1.81-1.68(m,3H),1.33(d,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.90,152.04,150.96,138.90,138.85,133.75,131.30,131.24,114.85,73.83,49.62,42.86,28.78,28.19,19.89,19.70.
实施例14
(S)-3-异丙基-6-((7-溴-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-29)的制备
I-29的合成：将4a(67mg,0.36mmol)和(S)-7-溴-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5h(236mg，1.04mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)中，于120℃回流反应24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(20mL)溶解，H2O(50mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体40mg，收率29.8％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.68(s,1H),7.25-7.19(m,3H),7.12-7.18(m,1H),6.40(d,J＝7.0Hz,1H),4.94-5.04(m,1H),4.77(s,1H),4.65-4.57(m,1H),2.84-2.65(m,2H),1.95-1.85(m,1H),1.82-1.70(s,3H),1.33(d,J＝6.9Hz,6H).13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.92,152.05,150.94,137.65,136.55,129.42,129.00,127.80,126.53,73.55,49.54,42.82,29.05,28.91,19.91,19.54.
实施例15
(S)-3-异丙基-6-((4-甲基-1-(1,2,3,4-四氢萘基))氨基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(I-30)的制备
I-30的合成：将4a(130mg,0.69mmol)和(S)-4-甲基-1,2,3,4-四氢-1-萘胺5i(442mg,2.74mmol)溶于1,4-二氧六环(8mL)中，于120℃回流反应24h。TLC(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)检测原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，减压浓缩，并加入CH2Cl2(30mL)溶解，H2O(50mL)萃取洗涤，有机层再用饱和氯化钠(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:1作为洗脱剂)，再通过混合溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)打浆得白色固体78mg，收率36.3％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.67(s,1H),7.31-7.18(m,4H),6.41(s,1H),4.89-5.05(m,1H),4.77(s,1H),4.63-4.52(m,1H),2.81-2.88(m,1H),1.78-1.97(m,3H),1.56-1.48(m,1H),1.33(d,J＝6.9Hz,6H),1.29(d,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.63,152.45,151.70,138.37,133.78,129.07,127.14,127.00,126.57,76.86,52.11,43.02,27.91,21.13,19.84,19.81.
实施例16
化合物对肌球蛋白ATP酶的抑制活性：
心脏肌球蛋白ATP酶通过催化ATP水解为ADP，为心肌收缩提供能量。采用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶(PK/LDH)构成的酶偶联体系可检测大鼠心脏肌球蛋白ATP酶活性。PK通过将PEP(磷酸烯醇丙酮酸)转化为丙酮酸而将ADP转化为ATP(三磷酸腺苷)。然后LDH通过将NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转化为NAD(氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)而将丙酮酸转化为乳酸。通过检测NADH的吸光度(在340nm)降低作为时间的函数，可反映肌球蛋白ADP的变化，从而评估药物对肌球蛋白ATP酶的抑制活性。心脏肌球蛋白的来源为肌原纤维形式的大鼠心脏。
麻醉大鼠(SPF级，200-220g，雄性)，取心脏，使用冷的0.9％NaCl冲洗，除去脂肪、***后，切除右心部分，剩余左心部分切成小块。转移至含4倍(缓冲液体积/左心组织重量)的0.3M蔗糖的标准缓冲溶液(75mM KCl,10mM咪唑,pH 7.2,2mM MgCl2，2mM EGTA,0.3M蔗糖)中，匀浆1min后离心(17300×g,15min,4℃)，取沉淀。沉淀转移至4倍的标准缓冲溶液(75mM KCl,10mM咪唑,pH 7.2,2mM MgCl2,2mM EGTA)，混匀打散后离心(750×g,15min,4℃)取沉淀，重复4次。沉淀转移至4倍的含有Triton x-100的标准缓冲溶液(75mMKCl，10mM咪唑,pH 7.2，2mM MgCl2，2mM EGTA,1％v/v Triton X-100)中匀浆后离心(750×g,15min,4℃)取沉淀，重复2次。沉淀转移至8倍的标准缓冲溶液中，混匀打散后离心(750×g,15min,4℃)取沉淀，重复4次。沉淀转移至PM12缓冲溶液(12mM PIPES,2mM MgCl2,pH6.8)。BCA法(BCA试剂盒(增强型)购自上海碧云天)测定PM12缓冲液中肌原纤维浓度。在测试药物前评估大鼠肌原纤维的钙应答且选择实现肌原纤维系统的50％(pCa50)活化的钙浓度作为评估药物活性的最终条件。上述所有操作均于冰上进行。测定条件为1mg/mL大鼠心脏肌原纤维，0.4mM PK/LDH，0.1mg/mL BSA和1mM DTT；50μM ATP，0.5mM NADH和1.5mM PEP以及钙浓度为实现肌原纤维系统50％活化的钙溶液。
用DMSO将化合物按3倍梯度稀释成11个不同浓度，起始浓度为0.1mM。取2μL上述不同浓度的化合物加入96孔板中，加入大鼠心脏肌原纤维100μL，加入含有PK/LDH、BSA和DTT的溶液40μL以及含有ATP、NADH和PEP的溶液40μL，最后加入20μL钙溶液(实现肌原纤维系统50％活化所需要的游离钙浓度)以启动酶促反应。于25℃下，通过
表2化合物对大鼠肌球蛋白ATP酶的抑制活性
实施例16
化合物对大鼠离体心脏收缩功能的抑制作用：
SD大鼠腹腔注射20％乌来糖和肝素(500IU/kg)，迅速打开胸腔，摘除心脏迅速置于预冷的K-H液中，在最短的时间内将主动脉与HSE离体心脏灌流系统连接，丝线固定，打开离体心脏灌流装置恒温循环泵，保持系统温度至37℃，开始进行离体心脏灌流，待心脏恢复正常跳动，稳定15-20min后进行试验。受试物以K-H液为溶媒配制成系列浓度，注入灌流系统，采用心脏米勒导管进行左心室心功能的检测。
结果：与溶媒对照组比较，I-1可明显降低左心室收缩压(LVSP)和左心室压力上升速率(+dP/dt)，上述作用具有浓度依赖性，显示I-1可抑制左心室心肌收缩。而且，I-1可降低左心室压力下降速率(-dP/dt)，显示心肌舒张功能的增强。同等摩尔浓度下I-1的抑制效应优于MYK-461，半数抑制浓度(IC50)均低于MYK-461。实验结果详见附表3、图1-3。
表3对大鼠离体心脏左心室功能的抑制作用
实施例17
化合物在大鼠的药代动力学试验：
雄性SD大鼠6只，分为两组，3只/组，分别静脉注射和灌胃给予受试化合物I-1，剂量分别为0.2mg/kg和2mg/kg。给药前禁食过夜，给药后4h恢复给食，整个试验期间自由饮水。给药后按照时间点(给药前、给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h和24h)经眼眶静脉丛取血0.2-0.3mL，置入含2μL 20％EDTA-K2的抗凝化试管中并保存于湿冰上。1小时内低温(4-10℃)下6000rpm离心8min取得上清血浆，保存于超低温冷冻冰箱(低于-60℃)中，待测。采用LC-MS/MS方法检测血浆样品中I-1的浓度，用软件
结果显示：大鼠静脉注射给药，血浆I-1消除迅速，平均T1/2为0.4h，平均Vz为0.65L/kg，平均CLp为1.14L/h/kg。口服给药，I-1可实现迅速、良好的体内吸收，平均Tmax为0.5小时，AUC0-inf为1553ng.hr/mL，平均生物利用度可达90.2％。相较MYK-461，I-1的药代动力学特性明显改善，表现为表观分布容积减小、体内清除加快、半衰期缩短，并显示更好的口服生物利用度。有望克服MYK-461体内消除过慢、不利于剂量调整的缺陷。(MarkP.Grillo et al.Xenobiotica,2019；49(6):718-733)
表3大鼠口服I-1的药代动力学参数
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种吡啶喹唑啉中间体的制备方法