二氢嘧啶类化合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 二氢嘧啶类化合物及其制备方法和应用 (Dihydropyrimidine compound and preparation method and application thereof ) 是由 黄龙 朱绪成 朱涛 牟霞 付海霞 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了二氢嘧啶类化合物及其制备方法和应用,属于药物化学技术领域,解决了现有技术中P2X3受体抑制剂效果不好、不良反应较大的问题。本发明二氢嘧啶类化合物的结构如式I所示。本发明还提供了式I化合物的制备方法,以及在制备治疗或预防P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病的药物中的应用。本发明提供的二氢嘧啶类化合物与P2X3具有良好的亲和力,同时对P2X3受体具有较强的拮抗作用,安全有效。(The invention discloses a dihydropyrimidine compound and a preparation method and application thereof, belongs to the technical field of pharmaceutical chemistry, and solves the problems of poor effect and large adverse reaction of a P2X3 receptor inhibitor in the prior art. The structure of the dihydropyrimidine compound is shown as a formula I. The invention also provides a preparation method of the compound shown in the formula I and application of the compound in preparing a medicament for treating or preventing P2X3 and/or P2X2/3 receptor related diseases. The dihydropyrimidine compound provided by the invention has good affinity with P2X3, has strong antagonistic action on a P2X3 receptor, and is safe and effective.)
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及二氢嘧啶类化合物或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及前药，以及其制备方法及在制备治疗和预防与P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病的药物中的应用，尤其在制备治疗和预防呼吸系统疾病的药物中的应用。
背景技术
慢性咳嗽是呼吸系统常见的临床症状之一。慢性咳嗽是指咳嗽时间持续在8周以上，X线胸片无明显肺疾病证据的咳嗽，咳嗽往往是患者惟一就诊症状。引起慢性咳嗽的病因有多种。慢性咳嗽的患者对在健康受试者中通常不会引起咳嗽的各种诱因更为敏感。现有技术中尚无专门针对慢性咳嗽的批准用药。临床上常用的中枢镇咳药物，如可待因、右美沙芬等，容易发生便秘和嗜睡等不良反应。
近年来发现嘌呤类受体P2X3与多种疾病密切相关，包括慢性咳嗽、神经痛、睡眠呼吸暂停等疾病。gefapixant(MK-7264)是由默沙东公司(Merck&Co)研制的新型止咳药，该药是首个公布III期临床数据的P2X3阻断剂，目前已向FDA新药申请(NDA)。两项临床III期试验表明，与安慰剂组相比，每天2次45mg剂量gefapixant治疗组在第12周(COUGH-1研究)和第24周(COUGH-2研究)的24小时咳嗽频率(采用24小时录音客观地测量每小时的咳嗽次数)有统计学意义的显著降低。2项研究中，每天2次15mg剂量gefapixant治疗组没有达到主要疗效终点。45mg组虽然达到临床终点，但45mg因不良事件而停药的频率更高、味觉相关不良事件发生率更高。因此提供一种更加安全、有效的P2X3受体拮抗剂，成为了本领域技术人亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种结构如式I所示的二氢嘧啶类化合物或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及前药，其与P2X3受体具有良好的亲和力，同时对P2X3受体具有良好的拮抗作用，并且不良反应小。
本发明的目的之二在于，提供该化合物的制备方法。
本发明的目的之三在于，提供该化合物在制备治疗或预防P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的一种结构如式I所示的化合物，或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及前药，
，其中，R1选自氢、烷基、环烷基、吡咯基或哌啶基；
R2、R3独立地选自氢、氘、取代或未取代的C1-12烷基，或者R2、R3连接形成的取代或未取代的3元至15元环烷基基团；
R4选自取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基；
R5选自1～5个氢、氘、取代与未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的烷硫基、取代或未取代的氨基或卤素。
本发明的部分实施方案中，R2、R3独立地选自氢、氘、取代或未取代甲基、取代或未取代乙基、取代或未取代丙基、取代或未取代环丙基；其中，R2、R3的取代基均独立地选自一个或多个的氘、卤素、羟基、胺基、甲基、乙基、环丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、环丙氧基、叔丁氧基、甲硫基、乙硫基、环丙硫基、叔丁硫基、胺基、甲胺基、乙胺基、环丙胺基、叔丁胺基、甲酰胺基、乙酰胺基、环丙酰胺基、叔丁酰胺基、NO2、CN或CF3；
或R2、R3连接形成的取代或未取代的环丙基；其中，取代环丙基的取代基选自一个或多个的氘、卤素、羟基、胺基、甲基、乙基、环丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、环丙氧基、叔丁氧基、甲硫基、乙硫基、环丙硫基、叔丁硫基、胺基、甲胺基、乙胺基、环丙胺基、叔丁胺基、甲酰胺基、乙酰胺基、环丙酰胺基、叔丁酰胺基、NO2、CN或CF3；或/和R4选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的吡嗪基、取代或未取代的哒嗪基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的苯并异恶唑基、取代或未取代的咪唑并哒嗪基，其中R4的取代基选自1～5个氘、氨基、氰基、甲基、甲氧基、卤素、三氟甲氧基或二氟甲氧基；
或/和R4选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的吡嗪基、取代或未取代的哒嗪基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的苯并异恶唑基、取代或未取代的咪唑并哒嗪基，其中R4的取代基选自1～5个氘、氨基、氰基、甲基、甲氧基、卤素、三氟甲氧基或二氟甲氧基；
或/和R5选自1～5个氢、氘、氨基、甲基、卤素、三氟甲基、二氟甲基。
本发明的部分实施方案中，R2、R3独立地选自氢、氘、甲基、乙基、丙基或环丙基；
或R2、R3连接形成环丙基。
本发明的部分实施方案中，选自下列化合物或其药学上可接受的盐或其前药：
表1
本发明的部分实施方案中，式I化合物中的氢可被一个或多个氘所取代。
本发明提供的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：化合物a及化合物k在碱的催化下进行取代反应，生成化合物b；
步骤2：化合物c与d在碱性条件下发生取代反应得到e；
步骤3：化合物e与f发生光延反应得到中间体g；
步骤4：化合物g与b在催化剂存在下，发生偶联反应得到化合物h；
步骤5：化合物h在无机碱催化或者酸催化发生水解反应得到化合物i；
步骤6：化合物i和化合物j发生缩合或酯化反应得到式(I)化合物；
优选地，步骤4中所用催化剂为钯类催化剂。
本发明提供的式I化合物，或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及前药在制备治疗或预防P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病的药物中的应用。
本发明的部分实施方案中，所述疾病为呼吸系统系统疾病。
本发明的部分实施方案中，所述化合物或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及前药在制备治疗或预防咳嗽、哮喘、疼痛、睡眠呼吸暂停药物中的应用。
本发明所述的英文缩写对应的化合物名称为：
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DIPEA：1-羟基苯并三唑(HOBT)N,N-二异丙基乙胺
xant-phos：4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DMSO：二甲基亚砜
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的二氢嘧啶类化合物与P2X3具有良好的亲和力，同时对P2X3受体具有较强的拮抗作用，安全有效。小鼠咳嗽试验表明，本发明的化合物具有良好的镇咳作用，体外生物活性评价表明本发明化合物对P2X3受体具有较强的抑制作用，味觉障碍试验表明小鼠的味觉几乎没有影响，且与阳性对照组有显著性的统计性差异。本发明可用于治疗或预防P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病。
本发明的制备方法简单，操作简便，易于工业化。
具体实施方式
以下将结合实施例和实验例对本发明作进一步的详细描述，本发明的实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开的内容所作的任何本领域的等同置换，均属于本发明的保护范围。
本发明实施例中化合物的结构是采用核磁共振(1H NMR)或液质联用(LC-MS)来确定的。
本发明实施例中的液质联用仪(LC-MS)为安捷伦G6120B(与液相Agilent1260配用)；核磁共振仪(1H NMR)为Bruker AVANCE-400或Bruker AVANCE-800，核磁共振(1H NMR)位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出，测定溶剂为DMSO，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6(ppm)作为单位给出。
本发明中所述“室温”指10～25℃。
实施例1：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物1)的制备
步骤1：4-(吡嗪-2-氧基)苯胺(化合物b-1)的制备
将2-氟吡嗪(50.0g，0.52mol)和对氨基苯酚(53.5g，0.49mol)溶解入二甲亚砜(360ml)中，加入碳酸铯(320g，0.98mol)得到反应混合物，并用机械搅拌匀速搅拌反应混合物。随后升温反应体系内温到80℃反应2h。薄层色谱跟踪反应进程，反应完全后，将反应混合物加入三倍体积(约1L)水中，并保持搅拌。之后用乙酸乙酯三次萃取产物，合并干燥乙酸乙酯后浓缩得到粗品，粗品以500ml水打浆1h后过滤，鼓风干燥箱干燥得到4-(吡嗪-2-氧基)苯胺(92.8g，褐色颗粒状固体)，收率96.8％。
ESI-MS:m/z＝187.1(M+H)+。
步骤2：6-氯-1-(4-氯苄基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(化合物e-1)的制备
将6-氯尿嘧啶(36.8g，0.25mol)和4-氯苄溴(52.5g，0.256mol)混合后用300mlDMF溶解后滴加DIPEA(96.9g，0.75mol)后保持30℃反应3h，薄层色谱跟踪反应进程，反应完全后，将反应混合物加入3倍体积的水中，洗出固体过滤，干燥后将滤饼用300ml乙酸乙酯打浆，过滤得到固体，鼓风干燥机干燥后得到6-氯-1-(4-氯苄基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮化合物(51.9g，白色固体)，收率76.6％，纯度为99.26％
ESI-MS:m/z＝271.0(M+H)+。
步骤3：甲基(S)-3-(4-氯-3-(4-氯苄基)-2,6-二氧基-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸酯(化合物g-1)的制备
将化合物e-1(27.1g，0.1mol)，(S)-(+)-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯(11.8g，0.1mol)以及三苯基膦(52.4g，0.2mol)，用300ml无水四氢呋喃溶解澄清，用氩气置换反应体系内空气后，冰水浴冷却反应体系，保持搅拌下缓慢匀速滴加偶氮二甲酸二异丙酯(40.4g，0.2mol)，30min内滴加完毕后，保持室温反应，薄层色谱跟踪反应进程，反应完全后，反应液用500ml水淬灭后，用30ml乙酸乙酯萃取三次，有机溶液干燥后浓缩的到油状物粗品。用100ml乙酸乙酯和500ml石油醚的混合溶剂分散油状物粗品，析出大量三苯基氧膦固体，过滤除去三苯基氧膦，母液浓缩后这层析提纯得到甲基(S)-3-(4-氯-3-(4-氯苄基)-2,6-二氧基-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸酯(32.1g，白色固体)，收率86.6％，纯度98.71％。
ESI-MS:m/z＝371.1(M+H)+。
步骤4：甲基(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸酯(化合物h-1)的制备
将化合物g-1(3.71g，0.01mol)，化合物b-1(1.87g，0.01mol)，xant-phos(868mg，1.5mmol)，醋酸钯(337mg，1.5mmol)，磷酸钾(4.24g，0.02mol)混合后用30ml二氧六环溶解，氩气置换反应瓶内空气，并且氩气保护反应，反应混合物在油浴中升温到80℃反应1h，薄层色谱检测反应至化合物g-1消耗完全，反应混合物减压蒸馏除去二氧六环后用100ml乙酸乙酯和100ml水分液萃取三次，乙酸乙酯相干燥浓缩后柱层析提纯得到甲基(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸酯(4.56g，黄褐色泡沫状固体)，收率87.3％，纯度96.82％。
ESI-MS:m/z＝522.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),δ8.17(s,1H),7.55–7.48(m,1H),7.46–7.37(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.16(s,4H),7.14–7.11(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.28(s,2H),4.61(s,1H),3.88(m,2H),3.46(s,3H),2.76(m,1H),0.99(m,3H)。
步骤5，S-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸(化合物i-1)的制备
将化合物h-1(522mg，1.0mmol)溶于甲醇(3ml)和四氢呋喃(3ml)的混合溶剂中，保持温度在10℃左右，加入氢氧化锂(168mg，4mmol)的水(3ml)溶液，以得到反应混合物，使所述反应混合物在室温下反应过夜。薄层色谱跟踪反应进程，反应完全后，经柱层析纯化得到化合物i-1(388mg，类白色固体)，收率：76.5％，纯度为98.62％。
ESI-MS:m/z＝508.1(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.11(s,1H)，δ8.85(s,1H)，δ8.18(s,1H),7.56–7.49(m,1H),7.48–7.39(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.16(s,4H),7.14–7.11(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.30(s,2H),4.62(s,1H),4.06–3.79(m,2H),2.79-2.68(m,1H),0.99-0.95(m,3H)。
步骤6，(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物1)的制备
将化合物j-1(288mg，0.57mmol)，HATU(433mg，1.14mmol)，HOBT(38mg，0.29mmol)，NH4Cl(46mg,0.86mmol)，DIPEA(183mg,1.42mmol)用DMF(5ml)溶解，室温反应16小时，薄层色谱跟踪反应进程，反应完全后冰水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次后，合并干燥浓缩后经柱层析提纯得到化合物1(198mg，)收率60.6％，纯度99.87％。
ESI-MS:m/z＝585.1(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H)，δ8.19(s,1H)，7.91(s，2H),7.86–7.76(m,1H),7.48–7.39(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.16(m,4H),7.14–7.11(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.42–5.15(s,2H),4.62(s,1H),3.92-3.86(m,2H),2.73-2.67(m,1H),0.98-0.92(m,3H)。
实施例2：3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-N-乙基-2,2-二甲基丙酰胺(化合物2)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤3中(S)-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯替换为等摩尔的3-羟基-2,2-二甲基丙酸甲酯，以及将步骤6中的氯化铵替换为等摩尔的乙胺，其余条件均相同；得到白色固体状的化合物2，收率：66.5％，纯度为99.78％。
ESI-MS:m/z＝549.2(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H)，δ8.66(s,1H)，δ8.16(s,1H),7.85–7.76(m,1H),7.48–7.38(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.16(m,4H),7.14–7.11(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.42–5.15(s,2H),4.62(s,1H),3.92(s,2H),3.22-3.16(m,2H),1.09(s,6H),1.02-0.96(m,3H)。
实施例3：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(2-氰基嘧啶-5-氧基)苯基)-氨基)-2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物3)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的5-氟-2-氰基嘧啶，其余条件均一致。得到化合物3，收率：67.3％，纯度为99.76％。
ESI-MS:m/z＝532.2(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.63(s,1H)，δ8.11(s,2H),7.95(s，2H),7.86–7.76(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.18-7.09(m,4H),7.14–7.11(m,1H),5.32(s,2H),4.62(s,1H),3.88-3.79(m,2H),2.72-2.68(m,1H),1.01-0.96(m,3H)。
实施例4：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(3-(3-甲基吡嗪-2-氧基)苯基)氨基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物4)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟-3-甲基吡嗪，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物4，收率：66.5％，纯度为98.54％。
ESI-MS:m/z＝521.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(s,1H),7.96(s，2H),7.84(d,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝8.3Hz,1H),7.29(d,J＝8.4Hz,2H),7.16(d,J＝2.5Hz,4H),7.11(d,J＝6.6Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),5.26(s,2H),4.59(s,1H),3.95-3.89(m,2H),2.98(s,3H),2.71-2.63(m,1H),1.02-0.98(m,3H)。
实施例5：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-苯氧基苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物5)的制备
本实施例的制备方法与实施例2相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的氟苯，其余条件均一致，得到白色固体状的化合物5，收率：62.2％，纯度为99.56％。
ESI-MS:m/z＝505.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),7.99(s，2H)，7.92(m,2H),7.58(m,2H),7.29(d,J＝8.4Hz,2H),7.22(m,1H),7.16(d,J＝2.5Hz,4H),7.11(d,J＝6.6Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),5.26(s,2H),4.59(s,1H),3.98-3.90(m,2H),2.72-2.68(m,1H),1.03-0.98(m,3H)。
实施例6：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(2-甲氧基嘧啶-4-氧基)苯基)-氨基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物6)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的4-氟-2-甲氧基嘧啶，其余条件均一致，得到白色固体状的化合物6，收率：68.6％，纯度为98.68％。
ESI-MS:m/z＝537.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(s,1H),7.99(s,2H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.56(d,J＝8.3Hz,1H),7.29(d,J＝8.4Hz,2H),7.16(d,J＝2.5Hz,4H),7.11(d,J＝6.6Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),5.26(s,2H),4.59(s,1H),3.98-3.90(m,2H),2.72-2.66(m,1H),1.02-0.95(m,3H)。
实施例7：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡啶-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物7)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物7，收率：68.2％，纯度为98.64％。
ESI-MS:m/z＝506.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),7.99(s,2H),8.16-8.05(m,1H),7.94–7.80(m,1H),7.48–7.39(m,2H),7.35–7.26(m,2H),7.16(s,4H),7.14–7.11(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.30(s,2H),4.62(s,1H),4.06–3.79(m,2H),2.75-2.68(m,1H),1.02-0.96(m,3H)。
实施例8：(S)-3-(4-(4-((5-氯吡啶-2-基)苯基)氨基)-3-(4-甲基苄基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基丙酰胺(化合物8)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟-5-氯-吡啶，将步骤2中1-(溴甲基)-4-氯苯替换为等摩尔的1-(溴甲基)-4-甲苯，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物8，收率：62.8％，纯度为98.51％。
ESI-MS:m/z＝520.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.63(s,1H),8.20–8.11(m,1H),7.97(s,2H),7.90–7.79(m,1H),7.48–7.38(m,1H),7.29(d,J＝8.3Hz,2H),7.21–7.14(m,4H),7.14–7.10(m,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,1H),5.28(s,2H),4.61(s,1H),3.92-3.85(m,2H),2.81-2.75(m,1H),1.02-0.98(m,3H)。
实施例9：1-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡啶-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-甲基)-正己基环丙烷-1-羧酰胺(化合物9)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶，将步骤6中的氯化铵替换为等摩尔的正己烷胺，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物9，收率：65.2％，纯度为99.27％。
ESI-MS:m/z＝602.3(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.91(s,1H),8.60(s,1H),8.15(dd,J＝5.0,2.0Hz,1H),7.90–7.79(m,1H),7.45–7.37(m,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(s,4H),7.14–7.09(m,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,1H),5.28(s,2H),4.62(s,1H),4.03(s,2H),3.12-3.03(m,2H),1.38-1.26(m,8H),1.07–0.92(m,4H),0.91-0.88(m,3H)。
实施例10：1-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡啶-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-甲基)-N-环己基环丙烷-1-羧酰胺(化合物10)的制备
本实施例的制备方法与实施例2相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶将步骤6中的氯化铵替换为等摩尔的环己烷胺，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物10，收率：69.6％，纯度为98.66％。
ESI-MS:m/z＝600.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.91(s,1H),8.60(s,1H),8.15(dd,J＝5.0,2.0Hz,1H),7.90–7.79(m,1H),7.45–7.37(m,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(s,4H),7.14–7.09(m,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,1H),5.28(s,2H),4.62(s,1H),4.03(s,2H),1.52-1.39(m,6H),1.28-1.19(m,4H),1.08–0.92(m,4H)。
实施例11：(S)-3-(3-(4-氟苄基)-4-(4-(3-(3-氟吡啶-2-基)氧苯基)氨基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基-N-(哌啶-4-基)丙酰胺(化合物11)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶，将步骤2中1-(溴甲基)-4-氯苯替换为等摩尔的1-(溴甲基)-4-氟-苯，将步骤6中的氯化铵替换为等摩尔的4-哌啶胺，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物11，收率：65.2％，纯度为97.57％。
ESI-MS:m/z＝591.3(M+H)+。
实施例12：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(3-(3-氟吡啶-2-基)氧苯基)氨基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基丙酰胺(化合物12)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物12，收率：67.8％，纯度为98.48％。
ESI-MS:m/z＝538.2(M+H)+。
实施例13：(2S)-3-(2,6-二氧-4-(4-(吡啶-2-氧基)苯基)氨基)-3-(4-(三氟甲基)苄基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基-N-(吡咯烷酮-3-基)丙酰胺(化合物13)的制备
本实施例的制备方法与实施例2相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶，将步骤2中1-(溴甲基)-4-氯苯替换为等摩尔的1-(溴甲基)-4-三氟甲基苯，将步骤6中的氯化铵替换为等摩尔的3-吡咯烷胺，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物13，收率：66.6％，纯度为98.53％。
ESI-MS:m/z＝609.3(M+H)+。
实施例14：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(嘧啶-2-氧基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物14)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物14，收率：79.2％，纯度为98.96％。
ESI-MS:m/z＝507.2(M+H)+。
实施例15：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(5-氯吡啶-2-氧基)苯基)氨基)-2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物15)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物15，收率：65.8％，纯度为98.51％。
ESI-MS:m/z＝540.1(M+H)+。
实施例16：(S)-3-(4-(4-(苯并[D]异噁唑-3-氧基)苯基)氨基)-3-(4-甲基苄基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物16)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2，3-二氟吡啶，将步骤2中1-(溴甲基)-4-氯苯替换为等摩尔的1-(溴甲基)-4-甲苯，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物16，收率：68.5％，纯度为98.89％。
ESI-MS:m/z＝526.2(M+H)+。
实施例17：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(6-甲氧基哒嗪-3-氧基)苯基)-氨基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物17)的制备
制备方法按实施例3制备方法，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的3-氟-6-甲氧基-哒嗪，得到白色固体状的标题化合物，收率：68.9％，纯度为99.19％。
ESI-MS:m/z＝537.2(M+H)+。
实施例18：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(6-氟吡啶-2-基)苯基)-氨基)-2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物18)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2,6-二氟吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物18，收率：68.2％，纯度为98.29％。
ESI-MS:m/z＝524.1(M+H)+。
实施例19：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(5-((三氟甲氧基)吡啶-2-基)氧苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物19)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟-5-(三氟甲氧基)吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物19，收率：62.1％，纯度为98.28％。
ESI-MS:m/z＝590.1(M+H)+。
实施例20：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-((5-(二氟甲氧基)吡啶-2-基)氧苯基)-氨基)-2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物20)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟-5-(二氟甲氧基)吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物20，收率：69.1％，纯度为98.17％。
ESI-MS:m/z＝572.2(M+H)+。
实施例21：(S)-3-(4-(4-(苯并[D]噻唑-2-氧基)苯基)氨基)-3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物21)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟-4-苯并[D]噻唑，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物21，收率：65.6％，纯度为98.59％。
ESI-MS:m/z＝562.1(M+H)+。
实施例22：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(咪唑并[1,2-B]吡啶-6-氧基)苯基)氨基)-2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酰胺(化合物22)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的6-氟-4-咪唑并[1,2-B]吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物22，收率：61.1％，纯度为99.84％。
ESI-MS:m/z＝546.2(M+H)+。
实施例23：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(5-氯吡啶-2-基)苯基)氨基)-2,6-二氧杂-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-N-十六烷基-2-甲基丙烷胺(化合物23)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2-氟-5-氯吡啶，将步骤6中的氯化铵替换为等摩尔的十六烷氨，其余条件均一致。得到白色固体状的化合物23，收率：78.3％，纯度为98.19％。
ESI-MS:m/z＝764.4(M+H)+。
实施例24：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(6-(6-氟吡啶-2-基)氧苯基)氨基)-2,6-二氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-N-十六烷基-2-甲基丙酰胺(化合物24)的制备
本实施例的制备方法与实施例3相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的2，6-二氟吡啶，将步骤6中的氯化铵替换为等摩尔的十六烷氨，得到白色固体状的化合物24，收率：68.6％，纯度为98.82％。
ESI-MS:m/z＝748.4(M+H)+。
对比例1：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(3-氟吡啶-2-氧基)苯基)氨基)-2,6-二氧杂-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基丙酸的制备
本对比例的制备方法与实施例1中化合物i-1相比，将步骤1中的2-氟吡嗪替换为等摩尔的2，3-二氟吡啶，其余条件均一致。得到白色固体状的对比例1化合物，收率：61.4％，纯度为99.27％。
ESI-MS:m/z＝525.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.09(s,1H),8.65(s,1H),8.03(q,J＝8.2Hz,1H),7.44(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),7.22(brs,4H),6.95(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),6.90(dd,J＝7.9,2.5Hz,1H),5.31(s,2H),4.66(s,1H),4.08–3.80(m,2H),2.77(m,1H),0.99(m,3H)。
试验例1：小鼠咳嗽试验
1试验材料
1.1供试品基本信息：实施例1-22化合物(本发明人实验室合成)、阳性对照药(gefapixant，批号：01030-210326-2-1，掌心医药购买获得)、对比例1化合物(本发明人实验室合成)。
1.2试验试剂：生理盐水，氨水。
2实验动物：健康成年KM小鼠，雌雄各半，每组6只，体重28-30g左右。
3试验方法
3.1剂量设计及供试品使用量
目前文献报道的动物咳嗽模型多采用机械、化学和电刺激等方法刺激动物的神经和感受器，引发咳嗽。根据候选化合物的特点和已有相似靶点化合物为参考，初步选择浓氨水诱导的方法建立小鼠咳嗽造模试验。
3.2供试品的配制方法
50％氨水溶液的配制方法：量取2.5ml氨水溶于5ml的0.9％的氯化钠注射液中，充分混匀即可。
阳性对照药及对比例1溶液配制方法：分别称取9mg阳性对照药和对比例1化合物溶于3ml 0.5％CMC-Na溶液，充分混匀，配置成3mg/ml的溶液。
实施例溶液配制方法：称取9mg实施例化合物溶于3ml 0.5％CMC-Na溶液，充分混匀，配置成3mg/ml的溶液。
3.3实验操作方法
分组：分为模型组、阳性对照组、对比例1组、实施例1组～实施例22组；每组取6只KM小鼠，灌胃给药；其中，阳性对照组给予阳性对照药(gefapixant，购买获得)、对比例1组给予对比例1化合物；实施例组给予相应实施例制备所得化合物，；每个组别对应三个剂量：30mg/kg、10ml/kg；模型组给予等体积的0.5％CMC-Na溶液。给药60min或120min后，分别将小鼠置于500ml烧杯，烧杯中放入1枚棉球(重量为100±5mg)，棉球内含有50％氨水0.3ml。观察小鼠3min内出现典型咳嗽的次数(典型咳嗽动作：腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，伴有咳声)。
4结果与讨论
4.1结果判断标准
①咳嗽判定标准：
咳嗽的表现为：腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，伴有咳声。
②用秒表计时，记录小鼠3min内咳嗽次数(次)，用软件进行统计学分析，各组数据采用均数±标准差统计描述，进行多组间单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4.2结果讨论
表2
备注：与模型组比较：**P<0.01，*P<0.05。与对比例1组比较：△P<0.05。
由表2可知，30mg/kg剂量下，给药60min时，阳性对照组、对比例1组及多个实施例组的化合物小鼠3min内出现典型咳嗽的次数与模型组对比，均具有明显的差异(**P<0.01，*P<0.05)，但120min测试时，对比例1组小鼠3min内出现典型咳嗽的次数与模型组相比不具有统计学差异；而120min时，实施例1组、2组、3组、7组、8组、9组、18组、22组的小鼠3min内出现典型咳嗽的次数与模型组和对比例1组相比，均具有明显的差异(**P<0.01，△P<0.05)。
10mg/kg剂量下，阳性对照组、对比例1组的小鼠3min内出现典型咳嗽的次数与模型组相比，均无明显差异。但实施例1组、7组、8组的小鼠3min内出现典型咳嗽的次数，与模型组相比，均具显著的差异(**P<0.01)。
试验例2：体外生物活性评价
1.本试验例所用试剂、耗材和仪器均为市售。
2.细胞系
使用稳定转染人源P2X3受体的HEK 293细胞系。
3.细胞培养
生长培养基：DMEM high glucose；10％FBS；1％PenStrep。
4.细胞培养过程：
a)复苏细胞
1)将细胞冻存管浸入37℃水浴中，并持续晃动使其尽快溶解；
2)用1mL移液枪上下缓慢地吹打细胞使其至悬浮，滴加到含有10mL新鲜预温生长培养基的15mL离心管中，然后以1000rpm/min，离心5分钟；
3)弃去上清液，用5mL新鲜生长培养基重悬细胞。将细胞悬液转移到培养皿中，放于5％CO2的培养箱中37℃静置培养；
4)24小时后，缓慢去除培养基(注意不要破坏细胞单层)，用新鲜生长培养基培养。
b)传代培养
细胞系通常以1：3到1：4的比例稀释传代，每周传代两次(1：3的传代比例更常用)，传代后的细胞需要2-3天才能生长达到85％的汇合度；
1)当细胞在10cm培养皿中达到>85％饱和后，用0.25％Trypsin-EDTA溶液消化约1min，将培养皿中的细胞吸出；
2)根据稀释比将细胞转移到含有完全生长培养液的培养皿中。注意：为保持细胞的对数生长，应该维持细胞单层培养；
3)根据细胞系细胞倍增时间(HEK293-P2X3：24小时)，使用0.25％胰蛋白酶溶液对细胞进行传代。
c)冻存细胞
1)将培养皿从培养箱中取出，置于超净工作台中，用0.25％Trypsin-EDTA溶液消化约1min，收集细胞并计数，再以1000rpm/min，离心5min；
2)吸出上清液，将细胞重新悬浮于冻存液(90％FBS和10％DMSO)中，密度为2×106cells/mL，每支冻存管中加入1mL细胞悬液；
3)将细胞冻存管放入冻存盒中，然后将其转移到-80℃过夜；
4)把冻存管转移到液氮罐中(-196℃)。
5.实验过程
步骤1：细胞实验板的准备
1)当15cm培养皿中的细胞长至80％融合时，去除上清液，加入5mL DPBS清洗细胞并吸出，再加入2.5mL 0.25％Trypsin-EDTA溶液至培养皿中，将培养皿放入培养箱1-3分钟，或直到细胞消化下来，再加入3mL完全培养基终止消化，用细胞计数仪检测细胞密度；
2)1000rpm/min离心5min后，用生长培养基重悬细胞并调节悬浮液体积，使细胞密度达到4×105cells/mL(1×104cells/25μL)；
3)黑色微孔板中加入10μL 5×Matrigel，将微孔板置于培养箱中15分钟后，取出微孔板，倒置300g/min离心30s，除去5×Matrigel。然后将配好的细胞悬浮液加入384黑色微孔板中，每孔25μL；
4)将微孔板放入5％CO2的培养箱中37℃培养过夜，直到第二天细胞生长至融合状态。
步骤2：化合物的准备
拮抗剂模式
1)测试化合物母液浓度：20mM；
2)384-LDV板上的化合物运用Bravo进行12点稀释，化合物起始浓度10μM，稀释倍数为3倍稀释；
3)HPE(高效药效对照)：阳性对照化合物单剂量；FAC(终效浓度)：40μM；ZPE(零效对照)：100％DMSO；
4)使用ECHO将384-LDV板上的化合物及HPE、ZPE转移至384孔板(PE6008590)作为化合物板；
5)将化合物板保存在-20℃。
步骤3：进行筛选试验
1)将生长至融合状态的细胞板从培养箱中取出；
2)准备检测缓冲液：30mL缓冲液含0.3mL 250mM probenecid、0.6mL 1M HEPES和29.1mL HBSS，实际的检测缓冲液量将根据细胞板数而定；
3)准备C6 dye，C6 dye原液为10×，用缓冲液将C6 dye稀释至1×；
4)使用Bluewasher的gentle spin模式进行倒置离心弃去培养基。
5)用移液排枪在细胞板上加入C6 dye，20μL/孔；
6)将细胞板300rpm/min离心30s后，在培养箱中孵育1.5h；
7)在预先准备好的化合物板上使用Dragonfly自动加样仪在每孔加入20μL的实验缓冲液，根据实验板布局用Bravo将10μL的化合物转移到细胞板中，测试化合物最终检测浓度最高剂量FAC：10μM，3倍稀释，12个浓度点。
8)细胞板300rpm/min离心30s，放入培养箱中孵育30min；
9)在激动剂板(PE 6008590)上准备25μL 4×BZATP(终浓度3.5uM)激动剂作用于P2X3细胞。
10)将细胞板、FLIPR枪头和激动剂板置于室温15min；
11)用FLIPR转移10μL的BZATP激动剂到细胞板中并读数。
步骤4：用Excel和Xlfit进行数据分析6.实验结果与分析
实施例化合物对P2X3受体的抑制作用IC50如下表所示，其中A表示小于10nM，B表示10.1～50nM，C表示大于50.1nM。
表3
试验样品
P2X3 IC<sub>50</sub>(nM)
阳性对照药
C
对比例1
B
化合物1
A
化合物2
B
化合物3
A
化合物4
C
化合物5
C
化合物7
A
化合物8
A
化合物11
C
化合物12
A
化合物13
C
化合物14
B
化合物18
A
化合物21
A
化合物22
A
由表3可知，化合物1、3、7、8、12、18、21、22对P2X3受体的抑制作用IC50优于阳性对照药和对比例1化合物。
试验例3：味觉障碍试验
1试验材料
1.1供试品基本信息
实施例3、8、21化合物(本发明人实验室合成)、阳性对照药(gefapixant，批号：01030-210326-2-1，掌心医药购买获得)。
1.2试验试剂
0.9％氯化钠注射液、盐酸奎宁(Quinie，批号：C12476271)
2实验动物
健康成年SD大鼠，全雄，体重280-300g左右。
3试验方法
3.1供试品的配制方法
0.3mM的奎宁溶液配制方法：称取119.20mg盐酸奎宁溶于1000ml的自来水中，充分混匀即可。
试验样品溶液配制方法：称取40mg试验样品先加入适量DMSO溶解后再加入HS-15溶液，充分混匀，加入16ml生理盐水，配置成2.5mg/ml的溶液。
3.2实验操作方法
动物及分组：160-180g/只左右的雄性SD大鼠，每组10只，各组平均体重相近，单笼饲养。
饮水习惯训练：各组动物每天上午8:30和下午16:30分别给正常饮水30分钟，其余时间禁水，持续5天，每天更换两瓶水左右摆放位置。
给药：实验前一天晚上禁水，次日上午试验组按以下剂量尾静脉注射给予4mL/kg(10mg/kg)的试验样品，模型组静脉注射给予4mL/kg(10mg/kg)的0.5％HS-15。
4结果与讨论
4.1结果判断标准
①饮水量测量：注射后将动物放回原来的笼子，各组的测量时间分别在各种药物Tmax区间(测量时间为给药后0min-15min)，每个笼子同时放入一瓶正常饮用水，一瓶含有0.3mM盐酸奎宁(Quinie)的饮水，所有动物饲养笼中两瓶水放置的左右位置一致。让动物自由饮水15min，分别测量两瓶水的饮水量，精确到0.1ml。
②数据统计分析：分别统计奎宁苦味水、自来水的饮用量，以及奎宁水占自来水量的百分比，用方差分析比较各组之间的差异有无显著性。
4.2结果讨论
表4
组别
奎宁/自来水(％)
溶媒组
38.16％
阳性对照组
79.01％*
实施例3组(化合物3)
44.21％<sup>△</sup>
实施例8组(化合物8)
36.16％<sup>△</sup>
实施例21组(化合物21)
39.22％<sup>△</sup>
备注：与溶媒组比较：*P<0.01；与阳性对照组比较：△P<0.01。
由上表可知，阳性对照组相对溶媒组，小鼠饮用奎宁/自来水的比例具有统计学差异(P<0.01)，说明阳性对照组化合物对小鼠的味觉有显著的影响，而实施例3组、8组和21组，小鼠饮用奎宁/自来水的比例不具备统计学意义，因此以上实施例组化合物在10mg/kg静脉给药下对小鼠的味觉几乎没有影响，且与阳性对照组有显著性的统计性差异。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
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