阅读说明：本技术 一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺 (Process for producing alcohol by using chitin as basic raw material ) 是由 王海东 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物工程技术领域,具体来说是一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺,包括预处理、几丁质的提取、壳聚糖的制备、壳聚糖提取物的降解及发酵过程,本发明以虾或蟹的甲壳为原料,经过一系列方法得到了几丁质、壳聚糖及分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物,再将低聚壳聚糖提取物与酵母菌共同发酵,得到了酒精产品,实现了虾或蟹的甲壳的废物利用,降低了虾或蟹的甲壳对环境造成的污染,并且降低了粮食和石油的资源浪费,且具有广泛的应用空间。(The invention relates to the technical field of bioengineering, in particular to a process for producing alcohol by using chitin as a basic raw material, which comprises the steps of pretreatment, chitin extraction, chitosan preparation, chitosan extract degradation and fermentation, wherein the chitin, the chitosan and an oligochitosan extract with the molecular weight distribution within the range of 10KD-20KD are obtained by using shrimp or crab shells as the raw material through a series of methods, and the oligochitosan extract and yeast are fermented together to obtain an alcohol product, so that the waste utilization of the shrimp or crab shells is realized, the pollution of the shrimp or crab shells to the environment is reduced, the waste of grains and petroleum resources is reduced, and the process has wide application space.)

一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体来说是一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺。

背景技术

几丁质又名甲壳素，是目前发现的自然界中唯一带正电荷的可食性动物纤维素，广泛存在于海洋节肢动物的外壳、甲壳动物(如虾、蟹)的外壳、以及昆虫、藻类细胞膜及真菌的细胞壁中，是一种天然的多糖类化合物，每年的生物合成量近100亿吨，是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源；然而由于几丁质不溶于稀酸、稀碱和普通的有机溶剂中，限制了它的广泛应用，且在我国一些江河湖海地区，许多富含甲壳素的虾头、蟹壳、鱼鳞等材料作为垃圾抛弃，不仅对几丁质资源造成浪费，而且还对环境造成了污染。

现有技术中以几丁质为原料生产的产品多是可降解材料、药品或者保健品，如缝合线、绷带、支架材料、硫酸氨基葡萄糖、盐酸氨基葡萄糖等，但是在这些产品中对壳聚糖的利用量极少而剩余的大量几丁质尚未被有效利用。

现有技术中酒精常用的生产方法是通过乙烯合成或者通过发酵获得，而生产过程中需要消耗大量的石油或者粮食，导致了资源浪费；目前以几丁质为原料生产酒精的研究较少，工艺还不成熟。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供了一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，本发明以几丁质为基础原料，经过物理、化学或生物酶法脱乙酰后得到壳聚糖，壳聚糖经过氧化分解或者生物酶降解后得到低聚壳聚糖，再将低聚壳聚糖发酵后得到了酒精产品；具体来说为以虾或蟹的甲壳为原料，经过一系列方法的得到了几丁质、壳聚糖及分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物，再将低聚壳聚糖提取物与酵母菌共同发酵，得到了酒精产品，实现了虾或蟹的甲壳的废物利用，降低了虾或蟹的甲壳对环境造成的污染，并且避免了粮食和石油的资源浪费，且具有广泛的应用空间。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，包括如下步骤：

步骤1、预处理：挑选无恶臭、无腐烂的虾或蟹的甲壳，剃去残肉，清洗干净，然后冷冻干燥，并在-20℃下贮藏，得到备用甲壳；

步骤2、几丁质的提取：提取步骤1的备用甲壳中的几丁质，得到几丁质提取物；

步骤3、壳聚糖的制备：提取步骤2几丁质提取物中的壳聚糖，得到壳聚糖提取物；

步骤4、壳聚糖提取物的降解：将步骤3制备得到的壳聚糖提取物与纤维素酶、壳聚糖酶及无菌水按照100：2-3：3-5：100的质量比混合，于50-70℃下搅拌2-4h后，然后调节pH为3-5，再加入H₂O₂溶液，在40-50℃下反应2-4h，并且反应过程中每隔0.5-1h进行超滤，收集分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物；

步骤5、发酵：将步骤4制备得到的低聚壳聚糖提取物溶于水形成体积分数为10-20％的低聚壳聚糖溶液，在低聚壳聚糖溶液中接种酵母菌，调节pH为5.5-6.5，并在温度为30±5℃、摇床转速为50-150r/min的发酵条件下，避光密封厌氧发酵5-7天，定时排气，直到不产生二氧化碳气体，得到酒精产物。

优选的，所述步骤2的提取过程为：将备用甲壳完全浸没于质量分数为3-8％的HCl溶液中，搅拌9-14h后，清洗至中性，然后将处理后的甲壳完全浸没于质量分数为8-10％的NaOH溶液，并加热至75-100℃搅拌1.5-3.5h，趁热过滤，再加入HCl调节至中性后，依次通过质量分数为均1％的KMnO₄和NaHSO₄溶液进行漂洗，每次漂洗1h，然后水洗至中性，冷冻干燥，得到几丁质提取物。

优选的，所述步骤3的提取过程为：将步骤2制备得到的几丁质提取物完全浸没在质量分数为40-60％的NaOH溶液，然后在100-150℃下加热搅拌1-1.5h，冷却至室温，用HCl调节pH至中性，然后经水洗、干燥，得到壳聚糖提取物。

优选的，所述步骤4中每次超滤时，采用上层20KD与下层10KD的双层超滤膜对40-50℃下反应的溶液进行超滤，收集双层超滤膜之间的固体，多次收集的固体合并后得到分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物。

优选的，所述步骤4中的H₂O₂溶液的体积浓度为25-30％，且壳聚糖提取物与H₂O₂的料液比为100g：2-3mL。

优选的，所述步骤4及所述步骤6均通过HCl或H₂SO₄来调节pH。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、本发明以虾或蟹的甲壳做为原料来生产酒精，通过将虾或蟹的甲壳经过脱钙、除蛋白及脱色后，得到几丁质，再将几丁质进行脱乙酰处理后得到壳聚糖，然后先用壳聚糖酶和纤维素酶对壳聚糖进行酶解，再通过H₂O₂溶液使得壳聚糖催化降解，并通过采用上层20KD与下层10KD的双层超滤膜对40-50℃下反应的溶液进行超滤，得到分子量分布在10KD-20kD范围内的低聚壳聚糖提取物，最后将低聚壳聚糖提取物与酵母菌共同发酵，得到了酒精产品，实现了虾或蟹的甲壳的废物利用，降低了虾或蟹的甲壳对环境造成的污染，并且避免了粮食和石油的资源浪费，且具有广泛的应用空间。

2、本发明将分子量分布在10KD-20kD范围内的低聚壳聚糖提取物与酵母菌混合后进行发酵，经研究证实分子量分布在10KD-20kD范围内的低聚壳聚糖与分子量分布在20KD-30kD范围内及分子量分布在10kD以下的低聚壳聚糖提取物相比，分子量分布在10-20kD发酵后得到的酒精纯度更高。

具体实施方式

下面用以较佳的实施例1-11及对比例1-4配合详细的说明。

实施例1

一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，包括如下步骤：

步骤1、预处理：挑选无恶臭，无腐烂的虾或蟹的甲壳，剃去残肉，清洗干净，然后低温冷冻干燥，并在-20℃下贮藏，得到备用甲壳；

步骤2、几丁质的提取：在步骤1的备用甲壳中加入质量分数为3％的HCl 溶液，使得HCl溶液将备用甲壳浸没并不断搅拌14h后，用清水清洗至中性，然后加入8％的NaOH溶液，使得NaOH溶液将备用甲壳浸没并加热至75℃搅拌 3.5h，趁热过滤，再加入HCl调节至中性后，依次通过质量分数均为1％的KMnO₄和NaHSO₄分别进行，每次漂洗1h后，然后蒸馏水清洗至中性，冷冻干燥，得到几丁质提取物；

步骤3、壳聚糖的制备：将步骤2制备得到几丁质提取物中加入质量分数为 40％的NaOH溶液，并使得NaOH溶液将几丁质提取物浸没，然后在100℃下加热搅拌1.5h，冷却至室温，用HCl调节pH至中性，然后经水洗、干燥，得到壳聚糖提取物；

步骤4、壳聚糖提取物的降解：将步骤3制备得到的100g壳聚糖提取物中加入2g纤维素酶和3g壳聚糖酶及100g无菌水，然后在50℃下搅拌4h后，加入 HCl调节pH为5，再加入体积浓度为25％的H₂O₂溶液3mL，在40℃下反应4h，并且反应过程中每隔0.5h进行超滤，每次超滤时，采用上层20KD与下层10KD 的双层超滤膜对40-50℃下反应的溶液进行超滤，收集双层超滤膜之间的固体，然后再继续反应1h，并重复上述超滤操作，多次收集的固体合并后得到分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物；

步骤5、发酵：将60g步骤4制备得到的低聚壳聚糖提取物溶于600g无菌水中形成低聚壳聚糖溶液，在低聚壳聚糖溶液中接种酵母菌，酵母菌活化菌种接种量为66ml/660g低聚壳聚糖溶液，通过HCl调节pH为5.5，然后在发酵条件为 25℃、摇床转速为50r/min的条件下避光密封厌氧发酵7天，中间定时排气，得到酒精。

其中酵母菌活化菌种的浓度为10⁷个/ml。

实施例2

一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，包括如下步骤：

步骤1、预处理：挑选无恶臭，无腐烂的虾或蟹的甲壳，剃去残肉，清洗干净，然后低温冷冻干燥，并在-20℃下贮藏，得到备用甲壳；

步骤2、几丁质的提取：在步骤1的备用甲壳中加入质量分数为6％的HCl 溶液中，使得HCl溶液将备用甲壳浸没并不断搅拌12h后，用清水清洗至中性，然后加入9％的NaOH溶液，使得NaOH溶液将备用甲壳浸没并加热至90℃搅拌 2.5h，趁热过滤，再加入HCl调节至中性后，依次通过质量分数均为1％的KMnO₄和NaHSO₄溶液分别进行漂洗，每次漂洗1h，然后水洗至中性，冷冻干燥，得到几丁质提取物；

步骤3、壳聚糖的制备：将步骤2制备得到几丁质提取物中加入质量分数为 50％的NaOH溶液，并使得NaOH溶液将几丁质提取物浸没，然后在120℃下加热搅拌1.25h，冷却至室温，用HCl调节pH至中性，然后经水洗、干燥，得到壳聚糖提取物；

步骤4、壳聚糖提取物的降解：在步骤3制备得到的100g壳聚糖提取物中加入2.5g纤维素酶和4g壳聚糖酶及100g无菌水，然后在60℃下搅拌3h后，加入 H₂SO₄调节pH为4，再加入体积浓度为28％的H₂O₂溶液2.5mL，在45℃下反应 3h，并且反应过程中每隔45min进行超滤，每次超滤时，采用上层20KD与下层 10KD的双层超滤膜对40-50℃下反应的溶液进行超滤，收集双层超滤膜之间的固体，然后再继续反应0.5h，并重复上述超滤操作，多次收集的固体合并后得到分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物；

步骤5、发酵：将60g步骤4制备得到的低聚壳聚糖提取物溶于600g无菌水中形成低聚壳聚糖溶液，在低聚壳聚糖溶液中接种酵母菌，酵母菌活化菌种接种量为99ml/660g低聚壳聚糖溶液，通过HCl调节pH为6，然后在发酵条件为30℃、摇床转速为100r/min的条件下避光密封厌氧发酵，定时排气，6天后，得到酒精。

其中酵母菌活化菌种的浓度为10⁷个/ml。

实施例3

一种以几丁质为基础原料生产酒精的工艺，包括如下步骤：

步骤1、预处理：挑选无恶臭，无腐烂的虾或蟹的甲壳，剃去残肉，清洗干净，然后低温冷冻干燥，并在-20℃下贮藏，得到备用甲壳；

步骤2、几丁质的提取：在步骤1的备用甲壳中加入质量分数为8％的HCl 溶液，使得HCl溶液将备用甲壳浸没并不断搅拌9h后，用清水清洗至中性，然后加入10％的NaOH溶液，使得NaOH溶液将备用甲壳浸没并加热至100℃搅拌 1.5h，趁热过滤，再加入HCl调节至中性后，依次通过质量分数为1％的KMnO₄和NaHSO₄溶液分别进行漂洗，每次漂洗1h，然后水洗至中性，冷冻干燥，得到几丁质提取物；

步骤3、壳聚糖的制备：将步骤2制备得到几丁质提取物中加入质量分数为 60％的NaOH溶液，并使得NaOH溶液将几丁质提取物浸没，然后在150℃下加热搅拌1h，冷却至室温，用HCl调节pH至中性，然后经水洗、干燥，得到壳聚糖提取物；

步骤4、壳聚糖提取物的降解：在步骤3制备得到的100g壳聚糖提取物中加入3g纤维素酶和5g壳聚糖酶及100g无菌水，然后在70℃下搅拌2h后，加入盐酸调节pH为3，再加入体积浓度为30％的H₂O₂溶液2mL，在50℃下反应2h，并且反应过程中每隔0.5h进行超滤，每次超滤时，采用上层20KD与下层10KD 的双层超滤膜对40-50℃下反应的溶液进行超滤，收集双层超滤膜之间的固体，然后再继续反应0.5h，并重复上述超滤操作，多次收集的固体合并后分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物；

步骤5、发酵：将60g步骤4制备得到的低聚壳聚糖提取物溶于600g无菌水中形成低聚壳聚糖溶液，然后在低聚壳聚糖溶液中接种酵母菌，酵母菌活化菌种接种量为132ml/660g低聚壳聚糖溶液，通过HCl调节pH为6.5，然后在发酵条件为35℃、摇床转速为150r/min的条件下避光密封厌氧发酵5天后，得到酒精。

其中酵母菌活化菌种的浓度为10⁷个/ml。

对比例1

发酵：在60g蔗糖中加入600g无菌水并混合均匀形成蔗糖溶液，然后接种步骤5得到的酵母菌筛选菌种，通过HCl调节pH为6.5，酵母菌活化菌种在蔗糖溶液中的接种量为99ml/660g蔗糖溶液，然后在发酵条件为30℃、摇床转速为 150r/min的条件下避光密封厌氧发酵6天后，中间定时排气，得到酒精。

对比例2

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，步骤4中采用上层30KD与下层20KD的超滤膜对40-50℃下反应的溶液进行超滤，收集双层超滤膜之间的固体，多次收集的固体合并后得到分子量分布在20KD-30KD范围内的低聚壳聚糖提取物，并将分子量分布在20KD-30KD范围内的低聚壳聚糖提取物进行步骤 5的操作。

对比例3

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，步骤4中采用10KD的超滤膜对40-50℃下反应的溶液进行超滤，收集超滤膜滤液中的固体，多次收集的固体合并后得到分子量分布在10KD以下的低聚壳聚糖提取物，并将分子量分布在 10KD以下的低聚壳聚糖提取物进行步骤5的操作。

对比例4

与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于：将实施例2制备得到的低聚壳聚糖提取物替换为购买的低聚壳聚糖，购买的低聚壳聚糖由上海伊卡生物技术有限公司生产，脱乙酰度≥95％，分子量40KD-50KD。

本发明实施例1-实施例3制备得到的酒精均具有优异的性能，下面对酒精正交实验确定最优发酵参数，正交实验工业研究与生产过程中具有重要的作用，利用正交实验的方法选择出最适宜壳聚糖发酵的条件，因此本发明主要通过发酵条件的正交实验来分析以几丁质为基础原料生产酒精的酒精状况。

发酵条件的正交实验方法：

1、将菌株接种到体积分数为15％的壳聚糖溶液中，在30±5℃下摇床培养，观察产气情况，并将发酵后5-7天后得到的溶液进行减压蒸馏得到馏液，将馏液加入至重铬酸钾酸性溶液中，并使用重铬酸钾酸性溶液进行颜色反应鉴定，重铬酸钾酸性溶液由红色变为绿色，实验证明发酵后得到的是酒精产物。

2、以10％壳聚糖溶液作为培养基，接种量的体积分数为15％做单因素实验确定发酵最适pH、温度、时间、转速的参数，以四个因素做正交实验，通过正交实验确定最优发酵参数：

实施例4

与实施例1的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中通过HCl调节pH为6，摇床转速为100r/min的条件下避光密封厌氧发酵6天，得到酒精。

实施例5

与实施例1的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中通过HCl调节 pH为6.5，摇床转速为150r/min的条件下避光密封厌氧发酵7天，得到酒精。

实施例6

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中通过HCl调节 pH为6.5，摇床转速为150r/min的条件下避光密封厌氧发酵7天，得到酒精。

实施例7

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中摇床转速为 150r/min的条件下避光密封厌氧发酵5天，得到酒精。

实施例8

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中通过HCl调节 pH为6.5，摇床转速为50r/min的条件下发酵，得到酒精。

实施例9

与实施例3的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中通过HCl调节 pH为5.5，发酵6天，得到酒精。

实施例10

与实施例3的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中通HCl调节pH 为6，摇床转速为50r/min的条件下发酵，得到酒精。

实施例11

与实施例3的制备过程相同，不同之处仅在于，发酵过程中摇床转速为 100r/min的条件下，发酵5天，得到酒精。

试验因素水平表见表1，正交试验结果见表2：

表1 试验因素水平表

表2 正交试验结果

如表2所示，本发明以虾或蟹的甲壳为原料，通过制备得到的壳聚糖来发酵生产酒精，使得酒精浓度均达到了20％以上，不仅证明了在本发明的制备条件下得到了酒精，而且实现了富含甲壳素的虾头、蟹壳、鱼鳞等材料的二次利用，并减轻了通过粮食发酵而导致的资源浪费，因此本发明在工业生产中具有广泛的应用前景。

本发明还将实施例1-3的制备得到的酒精与对比例1-4制备得到的酒精浓度进行对比，对比结果如表3所示：

表3 实施例1-3的制备得到的酒精与对比例1-4制备得到的酒精的浓度对比

结果表明，实施例1-实施例3的壳聚糖发酵后的酒精浓度均明显高于对比例 2及对比例3的酒精浓度，可知分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物在发酵过程中能够得到酒精浓度更高的酒精，对比例2及对比例3的低聚壳聚糖提取物与对比例4相比，均明显低于对比例4，原因是对比例4的脱乙酰度高，但是由于对比例4的分子量高，因此其发酵后的酒精浓度低于实施例1- 实施例3的酒精浓度，实施例1-3与对比例1相比，实施例1-3得到的酒精浓度均略低于对比例1得到的酒精浓度，因此通过壳聚糖发酵得到酒精的量略低于蔗糖发酵得到酒精的量，但是实施例1-3与对比例1发酵后产生的酒精量相差无几，说明本发明通过发酵壳聚糖可以替代现有技术的蔗糖来发酵得到酒精，从而实现了虾或蟹的甲壳的废物利用，并且避免了粮食和石油的资源浪费，具有广泛的应用空间。

综上所述，通过表2和表3能够得出：将菌株接种到菌株接种到体积分数为 15％的壳聚糖溶液中，30±5℃下摇床培养，能够产生大量二氧化碳气体，并有较浓的酒精气味散出，与重铬酸钾溶液能够产生明显的绿色反应，判定了溶液中有酒精生成，经过单因素实验确定A2B2C3D3为最佳的反应条件，此时菌株产生酒精的最适温度为30℃，pH为6.0，转速150r/min，时间为7天，且转速对酒精生成的影响较大；采用最优条件发酵酒精的浓度可以达到29.1mg/ml，且分子量分布在10KD-20KD范围内的低聚壳聚糖提取物在发酵过程中能够得到酒精浓度更高的酒精。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。