阅读说明：本技术 一种固定化聚半乳糖醛酸酶制备具有抑菌性的芒果皮果胶低聚糖的方法 (Method for preparing mango peel pectin oligosaccharides with antibacterial activity by using immobilized polygalacturonase ) 是由 金征宇 龙杰 薛琳 谢正军 周星 王金鹏 田耀旗 柏玉香 赵建伟 焦爱权 徐学明 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：一种固定化聚半乳糖醛酸酶制备具有抑菌性的芒果皮果胶低聚糖的方法,属于天然防腐剂制备及酶工程技术领域。本发明首先从芒果皮中提取芒果皮果胶,并用醋酸钠缓冲液溶解芒果皮果胶配成果胶溶液；将聚半乳糖醛酸酶稀释后加入溶胶-凝胶体系中反应融合制成固定化酶；将固定化酶与果胶溶液按比例混合后反应,得到抑菌性的芒果皮果胶低聚糖。本发明首次以固定化聚半乳糖醛酸酶水解芒果皮果胶,增加了酶的重复使用及热稳定性；本发明以芒果皮为原料,减轻了环境污染,还加大资源利用,降低了工业生产成本,在天然防腐剂的研发等领域具有广泛的应用前景。(A method for preparing mango peel pectin oligosaccharide with antibacterial activity by immobilized polygalacturonase belongs to the technical field of natural preservative preparation and enzyme engineering. Firstly, extracting mango peel pectin from mango peel, and dissolving the mango peel pectin by using a sodium acetate buffer solution to prepare a pectin solution; diluting polygalacturonase, adding the diluted polygalacturonase into a sol-gel system, and reacting and fusing to prepare immobilized enzyme; mixing the immobilized enzyme and pectin solution in proportion, and reacting to obtain antibacterial mango peel pectin oligosaccharide. The method uses the immobilized polygalacturonase to hydrolyze mango peel pectin for the first time, so that the repeated use and the thermal stability of the enzyme are increased; the invention takes the mango peel as the raw material, thereby reducing the environmental pollution, increasing the resource utilization, reducing the industrial production cost and having wide application prospect in the fields of the research and development of natural preservatives and the like.)

一种固定化聚半乳糖醛酸酶制备具有抑菌性的芒果皮果胶低 聚糖的方法

技术领域

本发明涉及一种固定化聚半乳糖醛酸酶制备具有抑菌性的芒果皮果胶低聚糖的方法，属于天然防腐剂制备及酶工程技术领域。

背景技术

食品添加剂是现代食品工业的催化剂和基础，被誉为“现代食品工业的灵魂”，它已渗透到食品加工的各个领域，从某种意义上讲，食品添加剂在食品工业的发展中起了决定性的作用。随着人民生活水平的提高和消费观念的更新，人们越来越注重食品的安全性，而在这其中微生物的危害是食品安全的首要问题。为了解决这一问题，强化食品的防腐保鲜，延长食品的货架期，食品工业中会常用各种防腐剂，其中以化学合成防腐剂居多，化学合成防腐剂的致癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题引起人们的担忧，同时化学人工合成食品防腐剂还可生成某些对人体有害的物质。所以，食品防腐剂的发展趋势正朝天然、营养化和功能化方向进行，寻找广谱、高效、安全、经济的天然防腐剂巳成为食品领域的一个热点。

果胶低聚糖（POS），也称为聚半乳糖醛酸，是由2至20个半乳糖醛酸通过α-1,4-糖苷键键合而成的一类新型益生元。近年来，果胶低聚糖因其特定的益生元活性而在各个领域得到应用，如抗肿瘤，抗氧化等活性，但对其抑菌活性关注较少。目前研究的天然防腐剂如壳聚糖只适用于不含蛋白质的酸性食品，因此国内外天然防腐剂市场仍不成熟。另一方面，有报道证明果胶寡糖对细菌的生长具有很好的抑制效果，也就是说把果胶寡糖作为防腐剂的研究将是一个崭新的领域，具有很大的开发价值和发展前途。

聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.15）是果胶酶中一种主要的水解酶，它可以随机的切断果胶主链内部非酯化半乳糖醛酸间的α-1,4糖苷键，产生不同聚合度的果胶低聚糖。但游离酶价格较高，热稳定性差等特点制约了它工业化的可能。酶的固定化是人们针对游离酶的缺点发展起来的新技术，固定化后可提高酶的热力学稳定性，调节和控制酶的活性和选择性，有利于在底物溶液中的反应，并可以很方便地分离和重复使用，对提高酶的利用效率，延长使用时间，降低工业成本具有重要意义。溶胶-凝胶法是将硅酯、水、催化剂和溶剂等物质混合，通过水解、缩合（包括聚缩合）、溶胶、老化、凝胶而进行固定化，由于二氧化硅比有机聚合物材料更具有化学和热稳定性，所以应用得较为广泛。固定化酶因其节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

芒果是重要的热带水果之一，我国是仅次于印度的第二大芒果生产国。由于芒果极易腐烂变质，因此芒果还被广泛的用于商业加工，如：芒果汁、芒果酱、芒果粉、芒果干等深加工产品。然而，芒果加工过程中会产生大量的芒果皮，芒果皮占水果重量的15％至20％，没有商业应用价值，如果处理不当会造成严重的资源浪费和环境污染等问题。如今，使用植物细胞壁多糖作为新型高附加值低聚糖的来源已成为一种趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化聚半乳糖醛酸酶制备具有抑菌性的芒果皮果胶低聚糖的方法，首次采用溶胶-凝胶法固定聚半乳糖醛酸酶水解芒果皮果胶，得到具有抑菌性的低聚糖，提高了果胶低聚糖产量及酶的使用效率，降低了工业成本。

本发明的技术方案，一种固定化聚半乳糖醛酸酶制备具有抑菌性的芒果皮果胶低聚糖的方法，首先从芒果皮中提取芒果皮果胶，并用醋酸钠缓冲液溶解芒果皮果胶配成果胶溶液；将聚半乳糖醛酸酶稀释后加入溶胶-凝胶体系中反应融合制成固定化酶；将固定化酶与果胶溶液按比例混合后反应，得到抑菌性的芒果皮果胶低聚糖。

进一步地，具体步骤如下：

（1）芒果皮果胶溶液的制备：取芒果皮，洗净煮沸灭酶，酸浸，热水浸提后过滤得上清提取液，用乙醇沉淀，无水乙醇洗涤后抽滤，并冷冻干燥得到芒果皮果胶，并用醋酸钠缓冲液溶解芒果皮果胶配成果胶溶液；

（2）固定化聚半乳糖醛酸酶的制备：取聚半乳糖醛酸酶液，在搅拌状态下加入PVA溶液，NaF溶液及去离子水，搅拌得均匀溶液，然后缓慢加入正辛基三乙氧硅烷OTES及正硅酸四乙酯TEOS溶液，继续搅拌，离心倒出上清液，用去离子水洗涤若干次，得到固定化酶；

（3）水解：取步骤（2）制备所得固定化酶于离心管中，加入步骤（1）制备所得芒果皮果胶溶液为底物，固定化酶与底物的体积比为1：1~10，反应离心后得到抑菌性的芒果皮果胶低聚糖。

步骤（1）中芒果皮果胶溶液的制备过程为：

a、将芒果皮煮沸灭酶，40~60℃烘干，粉碎过40~60目的筛；

b、按照固液比为1：10~50加入水，用0.01~1mol/L的盐酸调节pH为2~5，放入温度为70~90℃的水浴锅内浸提1~5h后过滤，得到提取液；

c、将所得提取液与体积浓度为95%的乙醇以1:1~3的体积比混合后搅拌均匀，在4℃环境中静置6~12h，过滤得到沉淀；

d、将所得沉淀用无水乙醇洗涤2~3次，最后-40~-60℃冷冻干燥48~72h得提取的芒果皮果胶；

e、采用醋酸钠缓冲液并配成质量浓度为0.1%~2%的芒果皮果胶溶液。

步骤（1）中芒果皮果胶的提取率为7%~15%。

步骤（2）固定化聚半乳糖醛酸酶制备的具体过程为：

f、将聚半乳糖醛酸酶稀释10~50倍，得到稀释后的纯酶溶液；

g、在搅拌状态下按照步骤f所得纯酶溶液：质量体积比为2%~5%的PVA溶液：0.1~1mol/L的NaF溶液：去离子水的体积比为4~10：2：1：1~2加料，搅拌30~60min得均匀溶液；

h、缓慢加入按照体积比正辛基三乙氧硅烷：正硅酸四乙酯喂1：2~5，加入正辛基三乙氧硅烷和正硅酸四乙酯溶液，继续搅拌8~12h；

i、6000-8000r/min离心5-20min，倒出上清液，用去离子水洗涤三次以上，得固定化酶。

步骤g中，PVA溶液的体积浓度为4%；NaF溶液的浓度为1mol/L。

步骤（2）中固定化酶中蛋白质负载率为60%~90%。

步骤（3）水解的具体过程为：取固定化酶于离心管中，加入果胶溶液，固定化酶：果胶溶液质量体积比为1：1~10；随后在30~60℃、pH 3~7的条件下反应5~60min，5000-10000r/min离心5-30min后得到抑菌性的芒果皮果胶低聚糖。

所述抑菌性的芒果皮果胶低聚糖聚合度不同；所述固定化酶能够重复利用。

本发明主要通过氟化钠作为引发剂，正辛基三乙氧基硅烷和正硅酸四乙酯作为硅烷前驱体，以水为溶剂在液相下将原料均匀混合，进行一系列的水解、缩合反应，在溶液中形成稳定的透明溶胶体系，经过陈化，胶粒缓慢聚合，不断形成长链，形成凝胶网络，将酶包裹在里面，最后得到固定好聚半乳糖醛酸酶的凝胶，克服了传统固定方法酶活回收率低、机械强度低、操作稳定性不高，操作复杂、成本高等缺点，提供的溶胶-凝胶法固定化聚半乳糖醛酸酶的方法酶活回收率高并且重复使用性好，制备的固定化酶在连续化生产果胶低聚糖等领域具有广泛应用前景。

本发明制备的固定化酶与游离酶相比在酸性环境下的相对酶活要高，固定化酶比游离酶更耐受酸性环境，具有更宽泛的pH值耐受性。在pH 3.0的环境下，游离酶保留了75.72%的相对酶活，而固定化酶保留94.60%的酶活。

本发明制备的固定化酶比游离酶具有更好的耐热性，当反应温度提高到80℃时，游离酶仅保留了6.3%酶活，而固定化酶仍保留有81.5%的酶活。

本发明制备的固定化酶回收利用步骤简单，反应结束后离心取出上清液，加入新的反应液在沉淀里即可实现酶的回收利用，大大降低了生产成本，酶活回收率达93.4%；且重复稳定性较好，重复使用6次后的酶活力保留达65%。

本发明的有益效果：本发明制得的芒果皮果胶低聚糖不仅可以解决现有的芒果皮污染问题，做到资源综合利用，而且安全，无污染，有广谱抑菌性，能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，是极具发展潜力的天然抑菌剂。

具体实施方式

实施例1

（1）芒果皮果胶溶液的制备：取烘干后的芒果皮放入粉碎机粉碎后过40目筛，取过筛粉末10g，后加入200mL的去离子水，并用0.01mol/L的盐酸调节pH为2.5，在70℃的高温浸提2h，将混浊液进行过滤，得到上清液量取体积，加入2倍的95%乙醇，静置过夜，得果胶沉淀。将得到的果胶沉淀用无水乙醇洗涤三次后冷冻干燥得果胶，将果胶配成0.2%的芒果皮果胶溶液。

（2）固定化聚半乳糖醛酸酶的制备：取聚半乳糖醛酸酶100μL稀释50倍，取稀释后的纯酶40mL加入反应釜，在搅拌状态下加入10mL的PVA溶液（4%，w/v）5mL的NaF溶液（1mol/L）及10mL的去离子水，搅拌30min得均匀溶液，然后缓慢加入3.7mL的正辛基三乙氧硅烷（OTES）及7.4mL 的正硅酸四乙酯（TEOS）溶液，继续搅拌12h，离心倒出上清液，用去离子水洗涤三次以上，得固定化酶。

（3）水解：取0.1g的固定化酶于离心管中，加入1mL的果胶溶液，在50℃，pH 4.5的条件下，反应30min，10000r/min离心后得到一定聚合度的具有抑菌性的芒果皮果胶低聚糖。

实施例2

（1）芒果皮果胶溶液的制备：取烘干后的芒果皮放入粉碎机粉碎后过60目筛，取过筛粉末15g，后加入150mL的去离子水，并调节pH为2.2，在80℃的高温浸提1.5h，将混浊液进行过滤，得到上清液量取体积，加入2倍的95%乙醇，静置过夜，得果胶沉淀。将得到的果胶沉淀用无水乙醇洗涤三次后冷冻干燥得果胶，将果胶配成0.5%的果胶溶液。

（2）固定化聚半乳糖醛酸酶的制备：取聚半乳糖醛酸酶100μL稀释50倍，取稀释后的纯酶30mL加入反应釜，搅拌状态下加入10mL PVA溶液（4%，w/v），5mL NaF溶液（1mol/L）及10mL水，搅拌30min得均匀溶液，然后缓慢加入4mL正辛基三乙氧基硅烷（OTES）及10mL正硅酸四乙酯（TEOS）溶液，继续搅拌过夜，离心倒出上清液，用水洗涤3次，得固定化酶。

（3）水解：取0.2g的固定化酶于离心管中，加入1mL的果胶溶液，在45℃，pH5的条件下，反应30min，离心后得到具有一定抑菌性的果胶低聚糖。

实施例3

（1）芒果皮果胶溶液的制备：取烘干后的芒果皮放入粉碎机粉碎后过60目筛，取过筛粉末5g，后加入100mL的去离子水，并调节pH为2.3，在70℃的高温浸提2h，将混浊液进行过滤，得到上清液量取体积，加入1倍的95%乙醇，静置过夜，得果胶沉淀。将得到的果胶沉淀用无水乙醇洗涤三次后冷冻干燥得果胶，将果胶配成1%的果胶溶液。

（2）固定化聚半乳糖醛酸酶的制备：取聚半乳糖醛酸酶稀释50倍，50mL搅拌状态下加入10mL PVA溶液（4%，w/v），5mL NaF溶液（1mol/L）及10mL水，搅拌60min得均匀溶液，然后缓慢加入3mL正辛基三乙氧基硅烷（OTES）及8mL正硅酸四乙酯（TEOS）溶液，继续搅拌过夜，离心倒出上清液，用水洗涤3次，得固定化酶。

（3）水解：取0.5g的固定化酶于离心管中，加入1mL的果胶溶液，在40℃，pH4.5的条件下，反应15min，离心后得到一定聚合度的果胶低聚糖。

结果显示，固定化酶具有较好的重复使用性，在使用6次后，还保留了65%酶活力。固定化酶的酶分子结构较稳定，能够重复多次使用，提高了具有抑菌性的果胶低聚糖的得率，为发展天然、营养化和功能化食品防腐剂提供依据。

本发明中提取的果胶低聚糖具有较广的抑菌谱，对食品中常出现的致病菌如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，沙门氏菌均有不同程度的抑制作用。下面结合具体实验说明本方法提取的芒果皮果胶低聚糖的体外抑菌作用。

应用实施例1

用牛津杯法测果胶低聚糖对不同革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果；具体步骤如下：

（1）将革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）与革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌）分别接种到固体培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15~20g，水1000mL，pH 7.0~7.2，121℃灭菌20min）划线培养活化，在37℃的培养箱中培养12~24h，再划取单菌落接种到液体培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.0~7.2，121℃灭菌20min）培养12~24h，制成菌悬液。

（2）取10~200μL的菌悬液涂布于固体培养基中，再放3个灭过菌的牛津杯于培养基上，保证各培养基之间距离的相似性，然后用移液枪移取100~200μL由实施例1-3提取的果胶低聚糖加入牛津杯中。以无菌水作对照，将培养皿放到培养箱中培养24h，最后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈的直径。

抑菌实验结果如表1所示。

表1 芒果皮的果胶低聚糖对不同菌种的抑菌直径

由表1可知芒果皮果胶低聚糖对不同致病菌的抑菌直径均大于7，说明成功提取了具有抑菌性的芒果皮果胶低聚糖，且果胶低聚糖具有广谱、高效、安全等特点，为天然防腐剂的应用提供依据。