阅读说明：本技术 一种低聚壳寡糖单体的制备方法 (Preparation method of oligo-chitosan oligosaccharide monomer ) 是由 夏文水 王斌 毛水芳 刘晓丽 姜启兴 许艳顺 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低聚壳寡糖单体的制备方法。本发明对壳聚糖溶液进行预处理,使壳聚糖溶液充分溶胀分散,扩大了酶与底物的接触范围,得到分布较为集中的壳寡糖产品,大大降低了单糖的生成。在制备壳寡糖的过程中与膜分离相结合,使活性壳寡糖及时得到分离,有效的控制了壳寡糖在酶作用下的进一步降解。超滤之后纳滤,除去低聚合度的无活性的寡糖和大量的水,使获得生理活性高的某聚合度范围内的壳寡糖产品。再进行凝胶排阻色谱分离,将相同组分合并收集,冷冻干燥得壳寡糖单体,得到的低聚壳寡糖单体的纯度达到40％以上。(The invention discloses a preparation method of an oligo-chitosan oligosaccharide monomer. The invention pretreats the chitosan solution, so that the chitosan solution is fully swelled and dispersed, the contact range of enzyme and substrate is enlarged, chitosan oligosaccharide products with concentrated distribution are obtained, and the generation of monosaccharide is greatly reduced. The process of preparing the chitosan oligosaccharide is combined with membrane separation, so that the active chitosan oligosaccharide is separated in time, and the further degradation of the chitosan oligosaccharide under the action of enzyme is effectively controlled. And (3) nanofiltration is carried out after ultrafiltration, and inactive oligosaccharide with low polymerization degree and a large amount of water are removed, so that a chitosan oligosaccharide product with high physiological activity and a certain polymerization degree range is obtained. And performing gel exclusion chromatography separation, separating and collecting the same components, and freeze-drying to obtain the chitosan oligosaccharide monomer, wherein the purity of the obtained chitosan oligosaccharide monomer reaches more than 40%.)

一种低聚壳寡糖单体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种低聚壳寡糖单体的制备方法，属于壳寡糖制备技术领域。

背景技术

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的衍生物，壳聚糖来源丰富且具有多种生理活性，但由于壳聚糖分子量大，被人体、动植物吸收有限，因此制备分子量小的壳寡糖成为了该邻域的热点，制备壳寡糖的方法主要有化学法、物理法和酶法。化学法成本较低，操作简便，但是壳寡糖分子量分布难以控制，且壳寡糖结构易破坏，安全饱受质疑。物理法污染小，操作较为简单，但产物聚合度高，分子量分布也较宽，单独使用效果不佳。酶法是用专一性酶或非专一性酶对壳聚糖进行降解得到壳寡糖的方法，具有污染小，反应条件温和等优点，但往往会由于产生过多的杂志无法及时处理导致提取物纯度过低，且提取出的壳寡糖往往由于分子大小不一而未进行分类，导致产物质量过低。因此如何制得分子量和性质均一的低聚窄分布壳寡糖是壳寡糖制备中的重要问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种低聚壳寡糖单体的制备方法。本发明综合使用酶法、膜分离和凝胶排阻色谱分离制备低聚壳寡糖单体，得到的低聚壳寡糖单体的纯度达到40％以上。

本发明的第一个目的是提供一种低聚壳寡糖单体的制备方法，包括如下步骤：

(1)溶解壳聚糖，加入酶进行水解，得到壳聚糖水解液；

(2)将步骤(1)得到的壳聚糖水解液经过微滤除杂，再经过超滤和纳滤处理，得到低聚壳寡糖粗品；

(3)将步骤(2)得到的低聚壳寡糖粗品通过凝胶排阻色谱进行分离，合并相同组分，得到低聚壳寡糖单体。

进一步地，所述的溶解是将壳聚糖加入水中分散均匀，再加入醋酸缓冲液进行溶解。

进一步地，所述的溶解具体是将壳聚糖加少量水溶解，再按照每g壳聚糖40-60mL加入pH 4-5的NaAc-HAc缓冲液，600-700r/min条件下常温搅拌4-6h。

进一步地，所述的酶为壳聚糖水解酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶中的一种或多种组合。优选壳聚糖水解酶。

进一步地，所述的酶的添加量为5-10U/mL，在40-50℃，200-400r/min搅拌酶解反应1-3h。

进一步地，酶解反应后，将酶解液置于80-100℃加热40-50min终止反应。

进一步地，所述的微滤是采用0.1-10μm的微滤膜进行过滤。优选先采用滤纸进行过滤，再分别使用0.45μm和0.22μm的微滤膜进行过滤除杂。

进一步地，所述的超滤的操作压力为0.2-0.3MPa，超滤膜的截留分子量为2-12KDa。优选先采用10KDa超滤膜进行超滤，再采用3KDa超滤膜进行超滤，在超滤过程中，超滤恒容加水量为原液体积的2倍，操作温度为37℃，对pH无要求。

进一步地，所述的纳滤的操作压力为0.4-0.6MPa，纳滤膜的截留分子量为400-1000Da。优选采用500Da的纳滤膜进行纳滤，纳滤恒容加水量为原液体积的4倍，操作温度为37℃，对pH无要求。

进一步地，所述的凝胶排阻色谱是采用0.08-0.12mol/LNH₄HCO₃冲洗聚丙烯酰胺凝胶Bio Gel P-2树脂，将低聚壳寡糖粗品按照0.10-0.20mL/min的流速，每5-15min收集1组样品。

进一步地，所述制备方法还包括将低聚壳寡糖单体进行冷冻干燥。

本发明的有益效果是：

本发明对壳聚糖溶液进行预处理，使壳聚糖溶液充分溶胀分散，扩大了酶与底物的接触范围，得到分布较为集中的壳寡糖产品，大大降低了单糖的生成。在制备壳寡糖的过程中与膜分离相结合，使活性壳寡糖及时得到分离，有效的控制了壳寡糖在酶作用下的进一步降解。超滤之后纳滤，除去低聚合度的无活性的寡糖和大量的水，使获得生理活性高的某聚合度范围内的壳寡糖产品。再进行凝胶排阻色谱分离，将相同组分合并收集，冷冻干燥得壳寡糖单体，得到的低聚壳寡糖单体的纯度达到40％以上。

附图说明

图1为纳滤后壳寡糖粗品的TLC分析图，图中Std为混标，1为2％酶解液，2为透过微滤膜浓缩液，3为10KDa透过浓缩液，4-6为500Da截留浓缩液；

图2为纳滤后壳寡糖粗品的HPLC分析图；

图3为色谱分离后低聚壳寡糖单体的TLC分析图，图中51-56均为壳四糖的收集管数；

图4为壳四糖单体的HPLC分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

TLC分析：壳寡糖样品配制成1％的溶液，用毛细吸管取2μL点样于高效硅胶板上，各点之间间距0.5cm，距底端距离为1.0cm，将点样好的硅胶板至于展开体系为异丙醇：氨水：水＝15：7.5：1的层析缸中，待上行展开后取出，用电吹风吹干。硅胶板上喷洒0.5％的茚三酮显色剂，置于100℃的烘箱中5min加热显色，各种糖即呈现，显色点颜色为***。

HPLC分析：色谱条件：Aglient 1260高效液相色谱仪；示差折光检测器；ZoRBAXNH2 Analytical(4.6mmID×250mmL)色谱柱；柱温：30℃；流动相为乙腈：水＝7:4；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；样品浓度：5％。(混标：20mg/mL)

实施例1：低聚壳寡糖单体制备

准确称取32g原料壳聚糖(Mw四十几万，DD75％)，先加少量水溶解，再加PH 4.5的NaAc-HAc缓冲液至1600mL，600-700r/min条件下常温搅拌5h。然后45℃恒温水浴锅保温并按照6U/mL加入壳聚糖水解酶，在300r/min条件下搅拌反应2h，酶解结束后，将酶解液置于100℃加热45min终止反应。将上清液依次通过普通滤纸、0.45μm和0.22μm微滤膜进行除杂。再进行超滤、纳滤处理：超滤的操作压力为0.25MPa，料液浓度2％，温度为37℃，10KDa超滤恒容加水量为原液体积的2倍，3KDa超滤恒容加水量为原液体积的2倍，先进行10KDa超滤再进行3KDa超滤，超滤膜对壳寡糖的透过率如表1所示；纳滤的操作压力为0.5MPa，料液浓度2％，温度为37℃，恒容纳滤加水量为原液体积的4倍，采用500Da的纳滤膜进行处理，得到低聚壳寡糖粗品，对低聚壳寡糖粗品进行TLC和HPLC分析，结果如图1、2及表2所示，由图1、2、表2可知，低聚壳寡糖粗品中，主要为聚合度2～6的壳寡糖，含量达到64％。

表1超滤膜对壳寡糖的透过率

10KDa壳寡糖透过率	74.58％
		3KDa壳寡糖透过率	69.98％
10KDa蛋白质截留率	38.54％
		3KDa蛋白质截留率	84.27％

表2低聚壳寡糖粗品HPLC分析表

	保留时间(min)	峰面积％	浓度(mg/mL)
				二糖	6.365	7.104	16.740
三糖	7.951	11.410	22.456
				四糖	9.679	21.194	38.285
五糖	11.987	15.134	30.667
				六糖	14.429	9.051	35.907

将上述低聚壳寡糖粗品采用凝胶排阻色谱进行分离，采用聚丙烯酰胺凝胶BioGel P-2树脂，0.1mol/LNH₄HCO₃冲洗树脂，按0.15mL/min的流速每10min收集1管，大约收集60-90管，并将相同组分合并收集。将收集的低聚壳寡糖单体进行冷冻干燥，得到壳寡糖单体产品。对壳四糖单体进行TLC分析，结果如图3所示，以及HPLC分析，结果如图4所示。低聚寡糖单体的纯度都达到了40％以上，其中，壳四糖单体的纯度达到60％以上；另外，低聚壳寡糖单体的总收率达到30％以上。

实施例2：低聚壳寡糖单体制备

准确称取32g原料壳聚糖(Mw四十几万，DD75％)，先加少量水溶解，再加pH 4的NaAc-HAc缓冲液至1280mL，600-700r/min条件下常温搅拌6h。然后45℃恒温水浴锅保温并按照10U/mL加入壳聚糖水解酶，在200r/min条件下搅拌反应1h，酶解结束后，将酶解液置于100℃加热45min终止反应。将上清液依次通过普通滤纸、0.45μm和0.22μm微滤膜进行除杂。再进行超滤、纳滤处理：超滤的操作压力为0.25MPa，料液浓度2％，温度为37℃，10KDa超滤恒容加水量为原液体积的2倍，3KDa超滤恒容加水量为原液体积的2倍，先进行12KDa超滤再进行2KDa超滤；纳滤的操作压力为0.5MPa，料液浓度2％，温度为37℃，恒容纳滤加水量为原液体积的4倍，采用1000Da的纳滤膜进行处理，得到低聚壳寡糖粗品。

将上述低聚壳寡糖粗品采用凝胶排阻色谱进行分离，采用聚丙烯酰胺凝胶BioGel P-2树脂，0.1mol/LNH₄HCO₃冲洗树脂，按0.1mL/min的流速每15min收集1管，大约收集60-90管，并将相同组分合并收集。将收集的低聚壳寡糖单体进行冷冻干燥，得到壳寡糖单体产品。

实施例3：低聚壳寡糖单体制备

准确称取32g原料壳聚糖(Mw四十几万，DD75％)，先加少量水溶解，再加PH 4.5的NaAc-HAc缓冲液至1920mL，600-700r/min条件下常温搅拌4h。然后45℃恒温水浴锅保温并按照5U/mL加入壳聚糖水解酶，在300r/min条件下搅拌反应2h，酶解结束后，将酶解液置于100℃加热45min终止反应。将上清液依次通过普通滤纸、0.45μm和0.22μm微滤膜进行除杂。再进行超滤、纳滤处理：超滤的操作压力为0.25MPa，料液浓度2％，温度为37℃，10KDa超滤恒容加水量为原液体积的2倍，3KDa超滤恒容加水量为原液体积的2倍，先进行8KDa超滤再进行4KDa超滤；纳滤的操作压力为0.5MPa，料液浓度2％，温度为37℃，恒容纳滤加水量为原液体积的4倍，采用400Da的纳滤膜进行处理，得到低聚壳寡糖粗品。

将上述低聚壳寡糖粗品采用凝胶排阻色谱进行分离，采用聚丙烯酰胺凝胶BioGel P-2树脂，0.1mol/LNH₄HCO₃冲洗树脂，按0.2mL/min的流速每5min收集1管，大约收集60-90管，并将相同组分合并收集。将收集的低聚壳寡糖单体进行冷冻干燥，得到壳寡糖单体产品。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。