具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如前所述，ToBRFV对番茄安全生产具有巨大的威胁，但由于ToBRFV发现的时间较晚，相关研究尚不成熟，目前对于ToBRFV尚无有效的控制手段，只能及早检测进行预防。利用RT-PCR虽然可准确检测出ToBRFV，但检测需要精密仪器和专业的操作人员，仅适用于少量样品的检测，并不适合于田间大量样品的检测。

胶体金免疫试纸条操作简单，可在5-10分中内通过肉眼观察进行判断，对于田间应用十分适用。但由于ToBRFV、TMV、ToMV和ToMMV这4个病毒衣壳蛋白氨基酸之间一致率在85％以上，特异性识别ToBRFV胶体金试纸条的制备存在一定难度。由于缺少特异性识别ToBRFV的单克隆抗体，目前还未见有检测ToBRFV胶体金试纸条的报道。

有鉴于此，本发明首先开发了能够识别ToBRFV的单克隆抗体。本发明将提纯的ToBRFV病毒粒子免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠；免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合；然后筛选得到17株杂交瘤细胞株，再制备腹水抗体并进行纯化，最终制备得到17种单克隆抗体。

由于不同杂交细胞株分泌的单克隆抗体识别ToBRFV的特异性会存在差异，本发明将获得的17个单克隆抗体分别作为标记抗体和划膜抗体，共272个配对组合。将272个组合分别检测ToBRFV样本，筛选出26对配对抗体能够快速检测到ToBRFV。随后将这26对配对抗体对TMV、ToMV和ToMMV进行交叉反应，发现FL447-14作为标记抗体/FL447-16作为划膜抗体这一组合无交叉反应。因此，将单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16的组合用于特异性识别和检测ToBRFV，并将分泌单克隆抗体FL447-14的杂交瘤细胞株和分泌单克隆抗体FL447-16的杂交瘤细胞株进行了生物保藏。

基于本发明开发的单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16，本发明还设计了一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条。

在本发明的一种实施方案中，给出了检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条的制备过程，包括以下步骤：

(1)调节胶体金溶液的pH为6.0-6.5，向胶体金溶液中加入单克隆抗体FL447-14，使单克隆抗体FL447-14的终浓度为18-22μg/ml；混合均匀，室温反应35-45min，加入BSA溶液终止反应，静置20-40min，低速离心弃去凝聚的金胶粒沉淀，然后高速离心，弃去上清，沉淀物用金标液复溶，制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的免疫胶体金溶液；

(2)将步骤(1)制备的免疫胶体金溶液涂在金标垫上，得到免疫胶体金垫；

(3)将单克隆抗体FL447-16和羊抗鼠IgG抗体分别点射于硝酸纤维素膜上，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；

(4)在底板上依次搭接固定样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即制备得到胶体金免疫试纸条。

本发明的胶体金免疫试纸条的检测原理为：试纸条根据“抗体-抗原-抗体”夹心免疫层析原理设计，滴加样品后，在毛细作用下，样品溶液向上迁移，达到免疫胶体金垫时，金标单克隆抗体a将被溶解。当样品中为ToBRFV阳性时，ToBRFV将和金标单克隆抗体a结合，并一起向上迁移，达到固定有单克隆抗体b的检测线时，形成“金标抗体a-病毒-抗体b”复合物，最终形成一条红色沉淀线，而未被固定的金标抗体a继续上行至羊抗鼠IgG抗体处，形成“金标抗体-IgG”复合物，形成红色沉淀线，此线为质控线。当样品为ToBRFV阴性时，金标抗体溶解在样品中，并一起向上迁移，达到固定有单克隆抗体b的检测线时，不能被固定，检测线处不出现红色条带，未被固定的金标抗体继续上行至羊抗鼠IgG抗体处，形成“金标抗体-IgG”复合物，形成红色沉淀线，此线为质控线。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：ToBRFV山东分离物(ToBRFV-SD)采自山东禹城，接种12天后采取系统叶片进行病毒粒子提纯。该分离物的生物学特性和分子检测体系已经发表在2021年Journal ofIntegrative Agriculture，20(7):1871-1879。自申请日之日起20年内公众可从申请人处获得ToBRFV山东分离物(ToBRFV-SD)以用于重复本实验。

实施例1：ToBRFV单克隆抗体制备

1.1免疫小鼠

利用采自山东禹城的ToBRFV分离物(ToBRFV-SD)接种番茄，接种12天后采取系统叶片进行病毒粒子提纯。将提纯的ToBRFV粒子对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫，共进行三次免疫，采取皮下多点注射。每次每只小鼠抗原免疫用量为25μg共100μL，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。

1.2单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1.2.1细胞融合

将分离得到的脾细胞与提前复苏备用的骨髓瘤细胞按10:1比例进行混匀，1500rpm离心6min后弃上清后，加入1mL 50％PEG，融合3分钟，用细胞培养基终止融合后1500rpm离心6min。沉淀的细胞用培养液洗涤一次，加入用HAT细胞培养液吹打成单细胞悬液，铺入96孔细胞培养板。

1.2.2阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆

细胞融合后第7天，培养板孔底长出肉眼可见的克隆，首先对所有细胞孔通过间接法ELISA筛选强阳性的细胞孔。将阳性的各细胞孔在24孔细胞培养板中进行扩大培养。采用有限稀释法获得单克隆细胞株。将获得的17株单克隆杂交瘤细胞扩大培养，随后冻存和用于制备腹水。

1.3单克隆抗体的大量制备与纯化

1.3.1小鼠腹水的制备

取6周龄健康BALB/c雌性小鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，一至两周后，小鼠腹腔注射10⁶个杂交瘤细胞，7-10天后见小鼠腹腔明显膨大后收集腹水，腹水在室温条件下4000rpm离心15min，上清液即为单克隆抗体腹水。

1.3.2单克隆抗体的纯化

在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和后继续搅拌30min。在4℃条件下13000rpm离心30min，弃上清。沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH 7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％后继续搅拌30min，在4℃条件下13000rpm离心30min，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH 7.4)，4℃透析过夜。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，对纯化后的抗体采用BCA法进行浓度测定，最终纯化得到17个单克隆抗体(单克隆抗体FL447-01～单克隆抗体FL447-17)。

1.4特异性识别ToBRFV的单克隆抗体组合的筛选

将获得的17个单克隆抗体分别作为标记抗体和划膜抗体，共272个配对组合。通过将这272个配对组合制备成简易的胶体金试纸条装置，分别检测ToBRFV样本，检测结果见表1。

表1：

注：表中的“-”代表和ToBRFV无反应，“+”代表和ToBRFV有反应，“+”前的数字代表反应信号强度，数字越大，表示反应信号强度越高。

“标记抗体”是指用胶体金颗粒进行标记的单克隆抗体；“划膜抗体”是指点射于硝酸纤维素膜上形成检测线的单克隆抗体。标记抗体和划膜抗体所对应的数字1-17分别表示所制备的17个单克隆抗体(数字1对应单克隆抗体FL447-01，数字2对应单克隆抗体FL447-02，依次类推)

由此筛选出26对配对单克隆抗体能够快速检测到ToBRFV，随后将这26对配对抗体制备成简易的胶体金试纸条装置，考察其对TMV、ToMV和ToMMV的交叉反应，检测结果见表2。

表2：

注：表中的“-”代表和相应的检测对象无反应，“+”代表和相应的检测对象有反应，“+”前的数字代表反应信号强度，数字越大，表示反应信号强度越高。

结果发现，FL447-14作为标记抗体/FL447-16作为划膜抗体无交叉反应，其它配对抗体组合均存在一定程度的交叉反应。

因此，选取FL447-14作为标记抗体/FL447-16作为划膜抗体这个配对组合作为特异性识别ToBRFV的单克隆抗体组合。

对单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16用SouthernBiotech抗体亚型检测试剂盒进行检测，结果表明：FL447-14和FL447-16单抗亚型分别为IgG1和IgG2a。

以1μg/ml ToBRFV病毒粒子作为抗原，通过ELISA间接法对单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16的效价进行检测，结果表明：单克隆抗体FL447-14的效价为1:243000，单克隆抗体FL447-16的效价为1:243000。

将分泌单克隆抗体FL447-14的杂交瘤细胞株和分泌单克隆抗体FL447-16的杂交瘤细胞株进行了生物保藏，生物保藏信息如下：

保藏材料：分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16。

保藏机构：中国典型培养物保藏中心。

保藏日期：2021年8月15日

保藏编号：分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14的保藏编号为CCTCC NO：C 2021207；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16的保藏编号为CCTCC NO：C 2021208。

实施例2：ToBRFV胶体金免疫试纸的制备及使用方法

1、ToBRFV胶体金免疫试纸的制备：

1.1胶体金溶液配备：

(1)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中(重铬酸钾：浓硫酸：超纯水＝120g:200ml:1000ml)浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用。

(2)1％氯金酸溶液配制：将1g氯金酸溶于100mL超纯水中。

(3)1％枸橼酸钠溶液配制：将1g枸橼酸钠溶于100mL超纯水中。

(4)胶体金的制备：量取90mL超纯水于烧杯中，加入1mL 1％氯金酸溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2mL新制备的1％枸橼酸钠溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮7-10min，自然冷却至室温，加超纯水定容100mL。倒入棕色瓶，4℃避光保存。

1.2抗体标记

取1.5ml制取好的胶体金，用0.1M的K₂CO₃调节pH值为6-7，加入30μg单克隆抗体a，混合均匀，室温反应40min。加入10％的BSA(m/v)终止，静置30min。先用低速(1500r/min)离心弃去凝聚的金胶粒沉淀。然后用高速(8500r/min)离心30分钟。仔细吸去上清，沉淀物用金标液(PBS缓冲液，含1％BSA(m/v)，1％吐温20(v/v))复溶制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的免疫胶体金溶液(1.5mg/mL)于4℃保存。

1.3喷金

将终浓度1.5mg/mL的免疫胶体金溶液喷于金标垫，涂覆量2.5μl/cm²，制备免疫胶体金垫，烘干待用。

1.4划膜

利用划膜机将浓度为1mg/ml的单克隆抗体b点在硝酸纤维素膜检测(T)线上，将浓度为1mg/ml的羊抗鼠IgG点在硝酸纤维素膜质控(C)线上，涂覆量均为0.7μl/cm，使T线和C线之间相距6～6.5mm。

1.5组装

将样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次粘贴到底板上，组装ToBRFV胶体金试纸条(图1)。

2、胶体金免疫试纸检测ToBRFV的步骤

2.1.样品制备：将0.1g番茄叶片和5mL 0.01M PBS缓冲液(pH7.2)在研钵中研磨均匀，吸取匀浆液到离心管中，12000rpm离心2min或静置5min。

2.2.加样：平放ToBRFV胶体金免疫试纸，用吸管吸取3滴(约100μL)匀浆液到加样孔中。

2.3.肉眼判读结果：加样5min根据图2判读结果。C线和T线同时显色，代表样品为阳性；C线显色、T线不显色，代表样品为阴性；C线不显色、T线显色或者C线和T线不显色代表试纸条失效。

实施例3：ToBRFV胶体金免疫试纸的特异性分析

取100μL健康番茄样品、感染TMV的番茄样品、感染ToMV的番茄样品、感染ToMMV的番茄样品、感染ToBRFV的番茄样品的稀释液(1：50)加到胶体金免疫试纸加样孔中，加样5min后肉眼判读结果(图3)。检测结果显示，当稀释度为1：50加样后5min，感染ToBRFV的番茄样品为阳性，其余样品为阴性，表明该试纸条具有较高的特异性。

实施例4：ToBRFV胶体金免疫试纸的灵敏度分析

1、检测感染ToBRFV的番茄样品

首先制备1：100稀释的健康番茄样品以及1：100、1：400、1：1600、1：6400、1：12800、1：25600稀释的感染ToBRFV的番茄样品稀释液。各取100μL加到加样孔中，加样5min后肉眼判读结果(图4)。检测结果显示，加样后5min，1：100、1：400、1：1600、1：6400、1：12800稀释的感染ToBRFV的番茄样品为阳性，表明该试纸条具有较高的灵敏度。

2、检测ToBRFV粒子

首先制备50μg/mL、5μg/mL、500ng/mL和50ng/mL的ToBRFV粒子稀释液。取100μL各稀释液到加样孔中，加样5min后肉眼判读结果(图5)。检测结果显示，加样后5min，50μg/mL、5μg/mL和500ng/mL的ToBRFV粒子稀释液为阳性，50ng/mL呈微弱阳性。

ToBRFV胶体金免疫试纸能快速、特异、灵敏地检测番茄样品内的ToBRFV。该试纸条在5min即可用肉眼直接判读结果，适用于田间检测。限定条件下不与健康番茄和感染TMV、ToMV、ToMMV的番茄样品反应。最低可检测稀释12800倍ToBRFV侵染的番茄样品(含约8μg植物组织)和500ng/mL的ToBRFV粒子稀释液(含50ng病毒粒子)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。