一种十字花科作物花粉电击遗传转化方法
阅读说明：本技术 一种十字花科作物花粉电击遗传转化方法 (Cruciferae crop pollen electric shock genetic transformation method ) 是由 张昌伟 杨宇 肖栋 任一鸣 刘同坤 侯喜林 李英 胡春梅 王建军 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种十字花科作物花粉电击遗传转化方法,以不结球白菜的成熟花粉细胞作为受体材料,把质粒DNA在电场的作用下,导入花粉中,结合常规的人工授粉,得到转基因种子。通过对电转染花粉的培养观察,以及获得的后代植株进行转基因检测,证明电击转化法可以成功的在不结球白菜上应用。本发明首次在不结球白菜上应用电击转化技术作为基因编辑的方法,与目前农杆菌转化,基因枪法等转基因方法相比,操作相对简洁,成本较低,可以进一步研究建立遗传转化体系,为不结球白菜的遗传育种提供更好的工具。(The invention discloses a cruciferous crop pollen electric shock genetic transformation method, which takes mature pollen cells of non-heading Chinese cabbage as receptor material, introduces plasmid DNA into pollen under the action of an electric field, and combines conventional artificial pollination to obtain transgenic seeds. The culture observation of the electrotransfection pollen and the transgene detection of the obtained progeny plants prove that the electric shock transformation method can be successfully applied to the non-heading Chinese cabbage. Compared with the prior agrobacterium transformation, gene gun method and other transgenic methods, the method has the advantages of relatively simple operation and low cost, can be used for further researching and establishing a genetic transformation system, and provides a better tool for genetic breeding of the non-heading Chinese cabbages.)
技术领域
本发明涉及一种十字花科作物花粉电击遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
不结球白菜属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)芸薹种白菜亚种，别名有小白菜，青菜，油菜等，原产于中国，是长江流域主要种植蔬菜作物，在北方也大量引种栽培，因而其种质资源十分丰富，有较多的地方品种。随着社会的进步，人民生活水平的提高，对于蔬菜品质的要求也日渐提高，而由于不结球白菜栽种时间跨度长，本身又容易染病产生病虫害，所以品质上变得良莠不齐，虽然产量巨大，但是产生的经济效益大打折扣。通过现代育种技术，有目的性的增强不结球白菜抗性、提高其品质，是目前研究的当务之急，研究应加快新品种培育进程，满足市场需求。
传统的育种方法在品种改良和品质创新方向发挥了极大的重要，但是常规育种方法受到自然的限制，如种质资源的匮乏。转基因技术是现代育种最大的一项支撑，该技术是当今科技发展下的一种新型的生物工程技术。转基因技术主要利用了现代分子生物学技术，将从外界分离得到的目的基因或修饰过的目的基因利用一定的转化手段导入到受体生物中。而这基因能在该生物中得到持续且稳定的遗传与表达，从而达到物种性状改良或品质创新的结果。近些年，植物的转基因生物技术由于操作简单、应用灵活、效率高等特点被广泛应用于诸多领域，在植物遗传育种及性状改良中同样施展着重要的作用，在农业生产中具备较好应用前景。此技术的优点在于弥补常规育种中的不足，拓宽了传统育种的生物资源范围，对于作物改良提供一定的靶向性，提供更精准、可控的预期的遗传改变。
近年来多种遗传转化方法被用于白菜的遗传改良，其中包括农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等，这些遗传改良方法对白菜的种质资源创新和新品种培育具有十分重要的意义。但是目前各种转化方法都有其局限性，在现在的遗传转化方法中，农杆菌侵染植物是目前应用最为广泛的建造植物遗传转化体系的技术，具有转化手段比较稳定、转化成功率高、成本相对较低等优点，但其受组织培养的依赖较强。花粉电击转化法是将外源DNA通过电击法导入成熟花粉中，再利用常规杂交授粉的方式实现遗传转化的，是电击法和杂交授粉相结合的一种转化方法。电穿孔的工作原理是，在高电压，低电容的环境下，利用高压电流在细胞壁和细胞膜中产生短暂可逆的孔隙，然后外源DNA或RNA可以通过这些毛孔进入细胞。去除外部电场后，然后细胞壁和膜电载体关闭，外源DNA整合到花粉粒核DNA中。电穿孔是受体细胞周围的电场的应用，如原生质体细胞、花粉细胞、胚胎和愈伤组织和通过快速在细胞膜中创造可逆开口即孔极性改变。与农杆菌转化法和基因枪转化法等目前主要转基因方法相比，花粉电击转化法具有操作简单、成本较低、省去了组织培养的过程、避免了再生性不强和容易产生嵌合体的问题，而且受体也没有种属限制等优点。目前利用花粉电击法进行遗传转化已成功应用于烟草、苦瓜、玉米、小麦等多种植物。但是，这些植物均非十字花科植物，其花器官特点与十字花科植物有显著不同，花粉电击法是否适用于十字花科植物的转化还无法预料。要将其应用于十字花科作物的转化需要进行哪些方面的调整也还需要进一步的探索。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种十字花科作物花粉电击遗传转化方法。
本发明利用一种电场作用，将载有外源目的基因的质粒通过花粉孔导入到悬浮在花粉液体培养基的花粉细胞中，经过人工授粉，得到转基因种子，是电极法与常规杂交授粉结合应用在不结球白菜上的一种遗传转化技术的研究。
本发明采用的技术方案是：
一种十字花科作物花粉电击遗传转化方法，以不结球白菜的成熟花粉细胞作为受体材料，在电击缓冲液中将质粒DNA在电场的作用下导入花粉中，结合常规的人工授粉，得到转基因种子；其中，所述的电击缓冲液配方为：12-15％蔗糖、10-12mg H3BO3、5-6mg KNO3、10-11mg Ca(NO3)2、51-53mg MnSO4、9-10.5mg MgSO4·7H2O和2-3mg GA3。
作为本发明的一种优选，所述的十字花科作物花粉电击遗传转化方法，包含以下步骤：
(1)从提取待转化质粒：带有GFP基因(载体Pcambia1302)的质粒、pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体质粒[1]；
(2)将不结球白菜花粉用电击缓冲液清洗后加入待转化质粒混合后进行电击处理，得到电转染花粉；电击的相关参数为：电压500-600V,电击杯2mm,电击1-2次；
(3)将电击处理花粉进行人工授粉及后处理；
(4)收取获得的转基因对种子进行播种检测。
作为本发明的一种优选，所述步骤(2)具体操作为：采集天气晴朗下的白菜花粉，一般选择盛花期花药成熟最新开放的新鲜花粉，加入电击缓冲液清洗花粉，使花粉和缓冲液混合均匀，并在花粉悬浮液中加入待转化质粒，混合均匀，不要产生气泡，然后从其中取200ul含质粒的花粉悬浮液移入到2mm的电击杯中利用电穿孔仪进行电击操作，电穿孔的相关参数为：电压600V,电击杯2mm,电击一次，电击处理后，将花粉悬浮液在冰上静止30min。
作为本发明的一种优选，所述步骤(2)电击缓冲液的配方为：15g/100ml蔗糖、10mg/100ml H3BO3、5.3mg/100ml KNO3、10.3mg/100ml Ca(NO3)2、51.7mg/100ml MnSO4、10.3mg/100ml MgSO4·7H2O和3mg/100ml GA3。
作为本发明的一种优选，所述步骤(3)的具体操作为：用移液枪将静置的花粉悬浮液上清吸去，将下层花粉放置到滤纸上，晾干多余水分，然后去试验田中对提前已经去雄的材料进行授粉，即用毛笔蘸取花粉涂抹在柱头上，再套上杂交袋以防其它花粉的传播，最后对转化植株套袋并挂牌，记录好处理蕾数及授粉时间，到秋季待种子成熟之后，收获经过转化处理后的种子并且在37℃烘箱烘干种子。
作为本发明的一种优选，所述步骤(4)中将收获的种子进行播种，待其长出3片真叶后，分别取其叶片,并且用TPS法提取其基因组,具体方法为：取少量叶片放入2ml离心管中，加入800ulTPS，加入钢珠打碎；75摄氏度水浴30分钟；拿出来摇一摇，12000rpm离心10分钟；取上清到1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀；放在-20℃半个小时；12000rpm离心10分钟，弃上清；加入500ul 75％酒精，悬浮白色DNA；离心去酒精，干燥1-2小时，直至无酒精残留，加入100ul ddH20,溶解即可。最后，将提取的DNA产物放置在-20℃冰箱待用。
作为本发明的一种优选，待转化植物为十字花科蔬菜作物，优选的，为不结球白菜。
本发明所述十字花科作物花粉电击遗传转化方法在不结球白菜遗传转化中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果及优点：
本发明选用的是不结球白菜品种‘49菜心’的花粉细胞作为电击转化受体，不结球白菜属于十字花科的双子叶植物，该类植物的花粉资源优秀，是遗传转化的理想转化受体。另外，十字花科的植株本身的种荚中种子数量较多，在数量上具有明显的优势，在遗传转化实验中，获得较多的转化植株。
白菜类蔬菜具有AA基因组使得其再生体系的建立相对困难，还受基因型影响，使得白菜类蔬菜作物在遗传转化中效率低。本发明采取的电击遗传转化方法省去了传统组织培养的过程、避免了再生性不强和容易产生嵌合体的诸多问题。
本发明通过一种不结球白菜花粉电击遗传转化技术的研究，提供了一种简单快捷，便宜高效，无需组培的，将电击法与杂交授粉相结合的一种遗传转化方法。这种方法具有操作简单、成本较低、没有种属限制等优点，可以进一步研究建立遗传转化体系，为不结球白菜的遗传育种提供更好的技术支持和保障。
参考文献：
[1]曾栋昌,马兴亮,谢先荣,等.植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法[J].中国科学:生命科学,2018,048(007):783-794.
附图说明
图1：本发明实施例提供的不结球白菜花粉细胞电击遗传转化技术研究的流程图。
图2：本发明实施例提供的花粉管观察。
图a和b:电击处理花粉，图c和d:花粉(CK)，UP:未萌发花粉PT:花粉管GA:萌发孔图3：本发明实施例提供的GFP荧光检测。a:电击花粉培养6h b:电击花粉培养24h
图4：本发明实施例提供的卡那霉素霉素抗性反应级别。a：2级反应b：3级反应c：4级反应
图5：本发明实施例提供的PCR检测电泳图。
其中，M:DL 2000bp DNA marker；+:质粒阳性对照；－:非转基因植株阴性对照
具体实施方式
下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用未标明的试剂均为可以购买得到的常规试剂产品。
下面对本发明做进一步具体描述，但本发明的保护范围并不仅仅局限于下述实施例。
下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例
1.实验方法
1.1从对应菌液中提取带有GFP基因(载体Pcambia1302)的质粒、pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体质粒。
(1)摇菌
实验室提供-80℃保存的大肠杆菌，在250ml锥形瓶里将甘油菌加入含有相应抗生素的LB培养基中(LB培养基配方为10g/L蛋白胨，10g/LNacl，5g/L酵母提取物)，37℃、200r/min过夜培养至整个培养基浑浊即可。
(2)含有外源基因的重组载体的制备。
选择带有GFP基因的载体Pcambia1302、载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N，利用天根生化科技有限公司的质粒大提试剂盒分别进行提取，提取结束后检测质粒浓度且做好标记。将提取好的质粒放于-20℃备用。
1.2.电击处理花粉及人工授粉
实验花粉的制备。采集天气晴朗下的白菜花粉，一般选择盛花期，此时花药成熟饱满，育性正常，最好选择花药成熟，最新开放的新鲜花粉，加入电击缓冲液清洗花粉，使花粉和缓冲液混合均匀，并在花粉悬浮液中加入外源DNA，并且注意要混合均匀，不要产生气泡，然后从其中取200ul(每200ul的花粉悬浮液中含有5ug的质粒)移入到2mm的电击杯中。电击缓冲液(100mL)的配方为：15g蔗糖、10mgH3BO3、5.3mgKNO3、10.3mgCa(NO3)2、51.7mgMnSO4、10.3mg MgSO4·7H2O和3mgGA3。
利用电穿孔仪进行电击操作。电穿孔的相关参数为：电压600V,电击杯2mm,电击一次。电击处理后，将花粉悬浮液在冰上静止30min。
白菜花粉去雄。对于授粉材料提前进行去雄，去雄植株生长健壮、无病虫害，花蕾生长良好，选取即将开放的花蕾，去除所有成熟开放的花和其他过小的花蕾，用镊子剥开留下的花蕾，去除花萼、花瓣及全部的雄蕊，留下柱头，然后用套上杂交袋进行生殖隔离，防止其他花粉污染。
田间授粉。用移液枪将静置的花粉悬浮液上清吸去，将下层花粉放置到滤纸上，晾干多余水分，然后去试验田中对提前已经去雄的材料进行授粉，即用毛笔蘸取花粉涂抹在柱头上，再套上杂交袋以防其它花粉的传播，最后对转化植株套袋并挂牌，记录好处理蕾数及授粉时间。到秋季待种子成熟之后，收获经过转化处理后的种子并且在37℃烘箱烘干种子。
到秋季待种子成熟之后，收获经过转化处理后的种子并且在37℃烘箱烘干种子。且做好数据统计：统计处理数、有效荚数及收获的种子数。
1.3电转染花粉萌发状态观察
利用GFP基因(载体Pcambia1302)作为外源基因，利用电压600V操作对收集的不结球白菜花粉进行电击一次处理。将电击处理完成的花粉溶液，离心去上清，将花粉转移到不含有赤霉素的花粉培养液中，放置在光培养箱25℃、黑暗条件下培养。在培养6h，24h，48h时，吸取少量花粉溶液在体式显微镜与激光共聚焦显微镜下观察其花粉细胞的萌发状态。
与此同时，选取刚开放的新鲜花朵，取饱满、育性正常的花药，用手轻弹花药，收集花粉，按照上述相同条件离体萌发培养，作为对照组。
1.4卡那霉素霉素抗性的筛选
用非转基因苗，待其长出3-4片真叶后，配置不同浓度的卡那霉素霉素对其进行浓度筛选试验，筛选出最佳浓度。合理设计试验，最终确定设置7个梯度处理，配制Kanamycin溶液的浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L，在5，10，15天分别观察记录不结球白菜叶片的变化情况。
1.5基因组DNA的提取
对候选转基因植株，分别取其叶片,并且用TPS法提取其基因组,具体方法为：
1.取少量叶片放入2ml离心管中，加入800ulTPS，加入钢珠打碎，
2. 75摄氏度水浴30分钟
3.拿出来摇一摇，12000rpm离心10分钟
4.取上清到1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀
5.放在-20半个小时
6. 12000rpm离心10分钟，弃上清
7.加入500ul 75％酒精，悬浮白色DNA
8.离心去酒精，干燥1小时，直至无酒精残留
9.加入100ul ddH20,溶解即可。
最后，将提取的DNA产物放置在-20℃冰箱待用。
1.6植株PCR鉴定
以pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体质粒为阳性对照，非转基因植株为阴性对照，根据pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体设计的引物为：
PCR检测体系：
PCR扩增程序：
2实验结果
2.1花粉管萌发与GFP荧光检测
如图2所示，对离体培养的花粉细胞进行观察，每个不同培养阶段的大部分花粉细胞呈圆球形，细胞壁完整，能观察到有花粉细胞周围有细长的花粉管伸出，表明电击处理后，大部分不结球白菜花粉细胞仍具有完整形态和花粉活力。将离体培养的电击处理的花粉与普通花粉进行对比，经过电击处理的花粉萌发率相对更高。
如图3所示，用携带有GFP的质粒基因作为外源基因电击导入花粉中进行离体培养，培养一段时间的花粉细胞在激光共聚焦显微镜下进行观察。以未处理的花粉作为参照，经过电击处理的花粉在视野中可以发现激发绿色荧光的花粉细胞，且在培养24h的花粉细胞中能看出萌发的花粉管中有荧光表达，证明电击技术将外源基因成功转入花粉细胞并得到表达。
2.2植株的卡那霉素抗性的筛选与鉴定
以普通野生苗作为实验材料，观察了涂抹Kanamycin后叶片的反映情况如图4所示，本实验中选择500mg/L的Kanamycin对种植于田间的转基因一代植株进行叶片涂抹筛选，当植株叶片对卡那霉素存在抗性，初步鉴定为转基因阳性植株。
2.3转基因植株的PCR鉴定
通过初步筛选的候选植株和一株非转基因的对照植株提取DNA，根据pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体设计的引物进行PCR检测。PCR产物用150V电压、1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的片段长度为953bp。通过琼脂糖凝胶电泳胶图显示，出现与质粒DNA相同的条带，即为阳性植株，与空白对照植株一样未出现电泳条带，为阴性植株。如图5所示。
2.4不结球白菜品种49菜心转化效率
经过对播种植株的筛选检测，在249棵存活植株中，扩增出pYLCRISPR/Cas9P35S-N片段的植株一共有24棵，转化效率为9.61％。数据显示，对于不结球白菜进行花粉电击遗传转化是切实可行的，对此技术可进行进一步的研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。