阅读说明：本技术 一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法 (Construction method of CRISPR/Cas9 vector applied to potatoes ) 是由 闫建俊 白云凤 左静静 左敏 李萌 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,属于植物分子生物学领域。该方法包括如下步骤：根据马铃薯中糖苷生物碱合成关键酶基因PGA2设计用于基因敲除的gRNA靶点,合成引物gRNA,然后将gRNA和Cas9蛋白结合形成表达盒,再将表达盒插入到表达载体PCAMBIA 1300中,将得到的连接物转化到大肠杆菌中,摇菌测序后,构建用于遗传转化的农杆菌工程菌,转化马铃薯,提取基因组DNA,筛选出阳性植株。本发明首次在马铃薯作物中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对马铃薯中糖苷生物碱合成关键酶基因进行编辑,为后续基因功能研究或马铃薯基因工程育种等奠定技术基础。(The invention discloses a construction method of a CRISPR/Cas9 vector applied to potatoes, belonging to the field of plant molecular biology. The method comprises the following steps: designing a gRNA target point for gene knockout according to a glucoside alkaloid synthesis key enzyme gene PGA2 in the potato, synthesizing a primer gRNA, combining the gRNA and Cas9 protein to form an expression cassette, inserting the expression cassette into an expression vector PCAMBIA1300, transforming the obtained connector into escherichia coli, shaking the bacteria for sequencing, constructing agrobacterium engineering bacteria for genetic transformation, transforming the potato, extracting genome DNA, and screening out positive plants. The invention edits the glucoside alkaloid synthesis key enzyme gene in the potato by the CRISPR/Cas9 gene editing technology for the first time in potato crops, and lays a technical foundation for subsequent gene function research or potato gene engineering breeding and the like.)

一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种应用于马铃薯上的 CRISPR/Cas9载体的构建方法。

背景技术

基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术，又称为基因打靶。其技术原理是构建一个人工核酸酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。而CRISPR-Cas9(cluster regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)基因编辑技术由于它的简单性和低成本，是目前最受欢迎的基因编辑技术。此技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。在向导RNA(sgRNA) 的带领下，通过碱基互补配对可以靶向PAM(原间隔序列临近基序， protospacer adjacent motif)附近的目标序列，Cas9蛋白是一种双链DNA核酸酶，会对该基因上下游的靶点进行切割，使DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中靶标基因的敲除。这种技术在生物工程等方面具有广阔的应用前景，已经在很多作物中得到应用。

马铃薯具有抗衰老的功效。它含有丰富的维生素B1、B2、B6和泛酸等B 族维生素及大量的优质纤维素，还含有微量元素、氨基酸、蛋白质、脂肪和优质淀粉等营养元素。近年来，随着人们生活水平的提高，对马铃薯的品质要求也越来越高，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术也对提高马铃薯的品质起到了创新性的作用。

发明内容

本发明的目的在于利用一种CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑载体在马铃薯基因功能方面的研究或马铃薯基因工程育种中的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

S1、CRISPR靶点设计：

根据马铃薯PGA2基因序列号AB839753.1设计sgRNA： GGTGTGAAATCGTGGTGCAATGG；

S2、利用同源重组的原理设计引物oligo：

正向序列：5’-AGTCGAAGTAGTGATTGGGGTGTGAAATCGTGGTGCAA-3’，

反向序列：5’-ATTTCTAGCTCTAAAACCTTGCACCACGATTTCACACC-3’；

S3、引物gRNA的形成：

将合成的引物oligo分别稀释成10μM，按如下比例混合，进行退火反应后形成引物gRNA；

反应条件：95℃，2min；95℃，20s；60℃，40s；72℃，15s；15cycles； 72℃，5min；

S4、将gRNA和Cas9蛋白结合形成表达盒，连入载体psgR-Cas9-At中，形成中间载体，然后将中间载体用EcoRI和HindⅢ双酶切，得到酶切产物为 Oligo引物二聚体，将PCAMBIA 1300载体同样用EcoRI和HindⅢ双酶切，得到酶切线性化载体，并按照如下比例混合，在37℃下连接30min得到编辑载体；

S5、将步骤S4中得到的编辑载体转化到大肠杆菌中；

S6、挑取5个单菌落摇菌并进行测序；

S7、将构建成功的载体转入农杆菌中构建工程菌，通过遗传转化转入马铃薯中。

优选的，所述步骤S1中，sgRNA序列为GGTGTGAAATCGTGGTGCAATGG，GGTGTGAAATCGTGGTGCAA为设计用于基因敲除的gRNA靶点，TGG为PAM序列。

优选的，所述S5的具体步骤为取编辑载体10μL，加入到50μL Top10 感受态细胞中，混匀后，热激转化，涂抹在含有卡那霉素的培养基平板上， 37℃过夜培养。

优选的，所述S7的具体步骤如下：

S71、无菌苗的扩繁

茎段繁殖培养基为MS固体培养基；无菌苗扩繁时将无菌苗茎段切成2cm 左右***培养基中；

S72、农杆菌扩繁

将甘油菌在LB固体培养基上划线，28℃培养两天后，挑取单克隆接种到 5ml LB液体培养基中，28℃，220rpm恒温震荡培养过夜至OD600约为0.6 时，5000rpm离心10min收集菌体，将收集的菌体用MS液体培养基重悬至 OD600＝0.4；

S73、农杆菌侵染和共培养

将无菌苗茎段切成2cm左右，置于重悬好的农杆菌菌液中，轻柔摇晃 10min，用无菌滤纸吸干茎段表面的菌液，将茎段转移到共培养培养基上黑暗培养2-3天；

S74、芽诱导分化

共培养后，将外植体转移到芽诱导分化培养基上，诱导生芽，每隔两周更换一次培养基；

S75、生根及抗性植株筛选

当抗性芽长到2cm时，切芽并将其转入生根培养基中，待形成完整小植株时，切取部分叶片，使用全式金植物组织直接扩增试剂盒提取基因组DNA，设计特异性引物检测植株；

S76、PCR扩增

将提取的基因组DNA，按如下比例混合，混匀后，PCR产物的大小通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳得到；

反应条件：94℃5min；94℃30s；58℃30s；72℃30s；30cycles；72℃ 5min。

具体地，

所述的MS培养基包括：4.42g/LMS，3％蔗糖，7g/L琼脂粉，PH＝5.8；

所述的LB培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、 50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素；

所述的共培养培养基包括：MS、1.0mg/L吲哚乙酸、0.2mg/L赤霉素、 2.0mg/L玉米素、0.5mg/L细胞***素，PH＝5.8；

所述的芽诱导分化培养基包括：MS、1.0mg/L吲哚乙酸、0.2mg/L赤霉素、2.0mg/L玉米素、0.5mg/L细胞***素、50mg/L卡那霉素、500mg/L 噻孢霉素，PH＝5.8；

所述的生根培养基包括：MS、50mg/L卡那霉素，PH＝5.8。

与现有的技术相比，本发明的优点包括：本发明首次在马铃薯中通过 CRISPR/Cas9基因编辑技术获得基因编辑载体，为后续基因功能研究或马铃薯基因工程育种等奠定技术基础。

附图说明

图1为构建成功的基因编辑载体的图谱；

图2为部分转基因马铃薯再生植株基因组DNA聚合酶链式反应检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一种应用于马铃薯上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

S1、CRISPR靶点设计：

根据马铃薯PGA基因序列号AB839753.1设计sgRNA： GGTGTGAAATCGTGGTGCAATGG；

S2、利用同源重组的原理设计引物oligo：

正向序列：AGTCGAAGTAGTGATTGGGGTGTGAAATCGTGGTGCAA，

反向序列：ATTTCTAGCTCTAAAACCTTGCACCACGATTTCACACC；

S3、引物gRNA的形成：

将合成的引物oligo分别稀释成10μM，按如下比例混合，进行退火反应后形成引物gRNA；

正向引物	1μL
		反向引物	1μL
2*fast pfu mix	12.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	10.5μL
总体积	25μL

反应条件：95℃，2min；95℃，20s；60℃，40s；72℃，15s；15cycles； 72℃，5min；

S4、将gRNA和Cas9蛋白结合形成表达盒，连入载体psgR-Cas9-At中，形成中间载体，然后将中间载体用EcoRI和HindⅢ双酶切，得到酶切产物为 Oligo引物二聚体，将PCAMBIA 1300载体同样用EcoRI和HindⅢ双酶切，得到酶切线性化载体，并按照如下比例混合，在37℃下连接30min得到编辑载体；

Oligo引物二聚体	8μL
		酶切线性化载体	5μL
重组连接酶	1μL
		重组连接酶Buf.	2μL
ddH<sub>2</sub>O	4μL
		总体积	20μL

S5、取步骤S4中得到的编辑载体10μL，加入到50μL Top10感受态细胞中，混匀后，热激转化，涂抹在含有卡那霉素的LB培养基平板上，37℃过夜培养。

S6、挑取5个单菌落摇菌并进行测序载体,测序结果如下：

TTTTCGTTTGAAACGGAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTT TTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTA GCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGT CCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCAT TCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCC CATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCT TCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGA AGTAGTGATTGGGGTGTGAAATCGTGGTGCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCATGCCTGCAGGTGAG ACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA CTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAG GAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACG AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGA TATCTCCACTGACGTACGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTA TATAAGGAAGTC；

S7、将构建成功的载体工程菌转入马铃薯中，具体步骤如下：

S71、无菌苗的扩繁

茎段繁殖培养基为MS固体培养基(含3％蔗糖，PH＝5.8)；无菌苗扩繁时将无菌苗茎段切成2cm左右***培养基中。

S72、农杆菌扩繁

将甘油菌在LB固体培养基(50mg/L卡那霉素+50mg/L庆大霉素)上划线，28℃培养两天后，挑取单克隆接种到5ml LB液体培养基(含50mg/L 卡那霉素+50mg/L庆大霉素)中，28℃，220rpm恒温震荡培养过夜至OD600 约为0.6时，5000rpm离心10min收集菌体，将收集的菌体用MS液体培养基重悬至OD600＝0.4。

S73、农杆菌侵染和共培养

将无菌苗茎段切成2cm左右，置于重悬好的农杆菌菌液中，轻柔摇晃 10min，用无菌滤纸吸干茎段表面的菌液，将茎段转移到共培养培养基(MS+1.0 mg/L吲哚乙酸+0.2mg/L赤霉素+2.0mg/L玉米素+0.5mg/L细胞***素， PH＝5.8)上黑暗培养2-3天。

S74、芽诱导分化

共培养后，将外植体转移到芽诱导分化培养基(MS+1.0mg/L吲哚乙酸 +0.2mg/L赤霉素+2.0mg/L玉米素+0.5mg/L细胞***素+50mg/L卡那霉素+500mg/L噻孢霉素，PH＝5.8)上，诱导生芽，每隔两周更换一次培养基。

S75、生根及抗性植株筛选

当抗性芽长到2cm时，切芽并将其转入生根培养基中(MS+50mg/L卡那霉素，PH＝5.8)，待形成完整小植株时，切取部分叶片，使用全式金植物组织PCR Kit试剂盒提取基因组DNA，设计特异性引物检测植株。

S76、PCR扩增

将提取的基因组DNA，按如下比例混合，混匀后，在此条件下反应：94℃ 5min；94℃30s；58℃30s；72℃30s；30cycles；72℃5min，PCR产物的大小通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳得到；

检测引物序列，并筛选出阳性植株，如图2，聚合酶链式反应检测结果，泳道1-16为转基因再生植株，“阴性”为非转基因阴性对照株，“阳性”为转基因阳性对照株，“双蒸水”为空白对照；阳性植株中PCR的产物大小是 499bp，检测的引物序列如下：

正向序列：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

反向序列：5’-TTGCACCACGATTTCACACC-3’

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。