一种农杆菌介导水稻遗传转化方法
阅读说明：本技术 一种农杆菌介导水稻遗传转化方法 (Agrobacterium tumefaciens-mediated rice genetic transformation method ) 是由 顾勇 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法,包括如下步骤：制备MS培养基,选取水稻种子,除菌后将种子均匀播种到MS培养基上；进行22-24℃的无光照培养,培养时间8-10天至种子发芽,然后剪取新鲜的子叶备用；活化农杆菌；侵染；转入共培养基进行共培养,同时在光照下培养2-3d；将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中,加入羧苄水进行清洗,同时不断摇晃培养瓶,清洗不再浑浊后倒去羧苄水,将愈伤通过无菌滤纸干燥；进行筛选培养；进行分化培养,直至愈伤组织出现绿芽。通过用无光照培养来替代现有技术愈伤组织的诱导培养、继代培养,免去预培养过程,提高了愈伤组织分化能力,进而增加了出苗率。(The invention discloses an agrobacterium-mediated rice genetic transformation method, which comprises the following steps: preparing an MS culture medium, selecting rice seeds, and uniformly sowing the seeds on the MS culture medium after degerming; culturing at 22-24 deg.C for 8-10 days until seed germinates, and shearing fresh cotyledon; activating agrobacterium; infection; transferring into co-culture medium for co-culture, and culturing under illumination for 2-3 d; putting the co-cultured callus into a culture bottle, adding the carboxybenzyl water for cleaning, continuously shaking the culture bottle, pouring the carboxybenzyl water after the cleaning is not turbid, and drying the callus through sterile filter paper; carrying out screening culture; carrying out differentiation culture until the callus shows green buds. By replacing the induction culture and the subculture of the callus in the prior art with the non-illumination culture, the preculture process is omitted, the differentiation capability of the callus is improved, and the emergence rate is increased.)
技术领域
本发明涉及生物遗传转化领域，具体是一种农杆菌介导水稻遗传转化方法。
背景技术
随着人们对转基因方法的研究越来越多，其中，对农杆菌介导的转化方法研究较多，应用最广。而目前农杆菌介导的转化方法包括愈伤组织的诱导培养，愈伤组织的继代培养，侵染，共培养，农杆菌的去除，筛选培养，抗性愈伤组织的分化培养。存在周期较长，愈伤分化能力不强，导致出苗率低的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，以至少达到减少预培养过程，提高愈伤分化能力，进而增加出苗率的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：
S1.制备MS培养基，在选用基础培养基后，加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；
S2.选取水稻种子，去颖壳；
S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；
S4.将S3中的MS培养基进行22-24℃的无光照培养，培养时间8-10天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；
S5.活化农杆菌；
S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；
S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2-3d；
S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；
S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；
S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，直至愈伤组织出现绿芽。
优选的，在所述S1中，所述基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。
优选的，在所述S4中，备用的新鲜子叶放置在22-24℃的无光照条件下。
优选的，在所述S5中，活化后的农杆菌含有目标基因。
优选的，在所述S10中，所述分化培养基9-10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽
本发明的有益效果是：
本发明通过用无光照培养来替代现有技术愈伤组织的诱导培养、继代培养，免去预培养过程，提高了愈伤组织分化能力，进而增加了出苗率。
具体实施方式
下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：
S1.基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。在基础培养基中加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；
S2.选取水稻种子，去颖壳；
S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；
S4.将S3中的MS培养基进行22℃的无光照培养，培养时间8天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；其中备用的新鲜子叶放置在22℃的无光照条件下。
S5.将含有目标基因的农杆菌活化；目标基因可以是抗旱基因、抗干旱诱导基因等。
S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；
S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2d；
S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；
S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；
S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，化培养基9d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。
愈伤组织分化能力测定
在24℃，4000lx，16hr光周期的条件下培养22-26d，统计绿色芽点；
相比现有技术绿色芽点率为76％左右，本发明的绿色芽点率为82％左右。其绿色芽点越多，证明其愈伤组织分化能力越强。
实施例2
一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：
S1.基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。在基础培养基中加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；
S2.选取水稻种子，去颖壳；
S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；
S4.将S3中的MS培养基进行24℃的无光照培养，培养时间8天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；其中备用的新鲜子叶放置在24℃的无光照条件下。
S5.将含有目标基因的农杆菌活化；目标基因可以是抗旱基因、抗干旱诱导基因等。
S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；
S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养3d；
S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；
S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；
S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，化培养基10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。
愈伤组织分化能力测定
在24℃，4000lx，16hr光周期的条件下培养22-26d，统计绿色芽点；
相比现有技术绿色芽点率为76％左右，本发明的绿色芽点率为81％左右。其绿色芽点越多，证明其愈伤组织分化能力越强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。