阅读说明：本技术 具有改进的营养价值的甘蓝植物 (Brassica oleracea plants with improved nutritional value ) 是由 F·G·范登博施 G·N·科里瓦尔 R·F·米森 于 2013-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供涉及与标准甘蓝品种相比萝卜硫苷增加的组合物和方法。本发明也涉及具有所需硫代葡萄糖苷含量的杂交品种的生产。本发明进一步提供包含这种性状并包含来自甘蓝麦的不与来自甘蓝麦的ELONG等位基因遗传连锁的Myb28等位基因的植物、植物部分和种子。(The present invention provides compositions and methods relating to increased glucoraphanin compared to standard cabbage varieties. The invention also relates to the production of hybrid varieties having a desired glucosinolate content. The invention further provides plants, plant parts and seeds comprising such a trait and comprising a Myb28 allele from Brassica oleracea that is not genetically linked to an ELONG allele from Brassica oleracea.)

具有改进的营养价值的甘蓝植物

本申请是申请日为2013年9月13日、申请号为 201310429742.1、发明名称为“具有改进的营养价值的甘蓝植物”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月13日提交的美国临时申请第61/700,762 号的权益，其以引用方式全部合并于此。

序列表的合并

包含在名称为“SEMB008US_ST25”、在微软Windows操作系统中计量为8000字节并创建于2012年9月13目的序列表在此以电子形式提交并通过引用方式合并于此。

发明领域

本发明涉及开发和使用具有重组染色体片断的甘蓝(Brassica oleracea)植物。

背景技术

硫代葡萄糖苷是存在于16个科的植物品种特别是十字花科 (Brassicaceae)中的化感物质，在这些植物品种中花椰菜是一个著名的例子。尽管在性质上存在超过120种鉴别的硫代葡萄糖苷，但密切相关的分类组通常仅包含少数的这类化合物。在花椰菜中占优势的硫代葡萄糖苷例如萝卜硫苷和屈曲花苷在生物化学上是衍生自氨基酸蛋氨酸。在该硫代葡萄糖苷途径中，蛋氨酸通过ELONG(延伸) 基因座的活性通过每次将单个碳单元添加至尾部而转化为同型蛋氨酸和二同型蛋氨酸。同型蛋氨酸最终转化为3-甲基硫代丙基硫代葡萄糖苷(屈曲花苷；“MSP”)而二同型蛋氨酸转化为4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷(萝卜硫苷；“MSB”)。这些硫代葡萄糖苷(屈曲花苷和萝卜硫苷)是促进潜在致癌物的代谢和***的II期解毒酶例如谷胱甘肽-S-转移酶和醌还原酶的有效诱导剂。

发明简述

一个方面，本发明提供一种甘蓝植物，其包含来自甘蓝麦 (Brassica villosa)的Myb28等位基因且缺乏来自甘蓝麦的与所述 Myb28等位基因遗传连锁的ELONG等位基因，其中当与缺乏Myb28 等位基因的植物相比时，所述Myb28等位基因赋予增加的硫代葡萄糖苷。

在一个实施方式中，所述植物是花椰菜植物。在其他实施方式中，所述植物是近交或杂交的。在另一个实施方式中，所述植物对于来自甘蓝麦的所述Myb28等位基因是纯合的。在又另一个实施方式中，所述植物对于来自甘蓝麦的所述Myb28等位基因是杂合的。在再另一个实施方式中，所述ELONG等位基因来自甘蓝。

另一个方面，本发明提供本发明的植物部分。在一些实施方式中，所述植物部分可以进一步定义为叶、胚珠、小花、花粉、头部(head) 或细胞。

又另一个方面，本发明提供产生本发明植物的种子。

再另一个方面，本发明提供一种包含染色体片断的甘蓝植物，所述染色体片断包含来自甘蓝麦的Myb28等位基因且缺乏来自甘蓝麦的与所述Myb28等位基因遗传连锁的ELONG等位基因，其中相对于缺乏Myb28等位基因的植物，所述片断赋予增加的硫代葡萄糖苷，且其中包含该染色体片断的种子样品以ATCC登录号PTA-13165保藏。在一个实施方式中，本发明提供产生这种植物的种子。在另一个实施方式中，本发明提供植物部分，其中所述部分是叶、胚珠、小花、花粉、头部或细胞。在另一个实施方式中，所述植物是甘蓝植物。

在本发明的另一个方面中，提供了包含来自甘蓝麦的Myb28等位基因和来自甘蓝的ELONG等位基因的重组DNA片断。在一个实施方式中，所述DNA片断进一步定义为包含于细胞内。在另一个实施方式中，所述DNA片断进一步定义为包含于种子内。在又另一个实施方式中，所述DNA片断进一步定义为包含于植物内。

另一方面，本发明提供用于获得包含所需的硫代葡萄糖苷组成的芸苔属植物的方法，包括：a)获得对于来自甘蓝麦的Myb28等位基因为杂合的芸苔属植物，所述Myb28等位基因赋予增加的硫代葡萄糖苷且在植物中与来自甘蓝麦的ELONG等位基因遗传连锁；(b)获得该植物的后代；和(c)选择其中发生重组以使得所述后代包含所述Myb28 等位基因但不包含来自甘蓝麦的ELONG等位基因的至少第一后代植物，其中由于存在Myb28等位基因但不存在来自甘蓝麦的ELONG等位基因，所述后代植物具有所需的硫代葡萄糖苷组成。

在一个实施方式中，后代植物的选择包括鉴别后代植物，所述后代植物(1)包含与甘蓝麦中的Myb28等位基因遗传连锁的遗传标志物和/或缺乏存在于所述芸苔属植物中相应基因座上的遗传标志物，和(2) 缺乏与来自甘蓝麦的ELONG等位基因遗传连锁的遗传标志物和/或包含存在于来自所述芸苔属植物的相应基因座上的遗传标志物。

在另一个实施方式中，后代植物的选择包括检测补体SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的互补序列侧邻的所述植物的基因组中发现的多态性。在进一步的实施方式中，这类等位基因通过基于PCR的方法采用寡核苷酸引物对来检测。在另一个实施方式中，后代植物的选择包括检测图5所示的所述后代植物中的多态性。在进一步的实施方式中，所述芸苔属植物可以是甘蓝植物。

在再进一步的方面，本发明提供通过本发明方法产生的植物或其后代，其包含Myb28等位基因但不包含来自甘蓝麦的ELONG等位基因。在一个实施方式中，本发明提供这种植物的部分。在另一个实施方式中，所述植物部分选自细胞、种子、根、茎、叶、头部、花和花粉。

在另一方面，本发明提供用于生产具有增加的硫代葡萄糖苷含量的杂交甘蓝植物的方法，包括将第一甘蓝亲本植物与不同基因型的第二甘蓝植物杂交，其中所述第一亲本植物包含来自甘蓝麦的Myb28等位基因且缺乏来自甘蓝麦的与所述Myb28等位基因遗传连锁的 ELONG等位基因，其中相对于缺乏Myb28等位基因的植物，所述 Myb28等位基因赋予增加的硫代葡萄糖苷。在一个实施方式中，所述方法进一步包括产生多种杂交甘蓝植物，包括将第一甘蓝亲本植物与不同基因型的多种第二甘蓝植物杂交。

在又另一个方面，本发明提供产生具有所需增加的硫代葡萄糖苷含量的甘蓝植物的方法，包括将包含来自甘蓝麦的Myb28等位基因且缺乏来自甘蓝麦的与所述Myb28等位基因遗传连锁的ELONG等位基因的染色体片断渗入所述植物中，其中相对于缺乏所述片段的植物，片断赋予所需的硫代葡萄糖苷含量，其中包含所述染色体片段的种子样品以ATCC登录号PTA-13165保藏。

术语“约”用于表示值包括用于测定该值的装置或方法的误差的标准偏差。权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指明仅指可选物或所述可选物是互斥的，尽管本公开支持仅指可选物和“和/或”的定义。权利要求书中，当与单词“包含”或其他开放式术语结合使用时，单词“一(a)”和“一个(an)”表示“一个或多个”，除非特定指明。术语“包含”、“具有”和“包括”为开放式联系动词。这些动词中一个或多个的任何形式或时态例如“包含”、“具有”、“含有”和“包括”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不局限于仅具有这些一个或多个步骤，且还覆盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一种或多种性状的任何植物不局限于仅具有这样的一种或多种性状，且还覆盖其他未列出的性状。

本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细说明中变得明显。然而，应理解，尽管表明了本发明的具体实施方式，所提供的详细说明和任何具体的实施例仅以举例方式给出，因为在本发明精神和范围内的多种变化和改变对于阅读所述详细说明的本领域技术人员而言将是明显的。

具体实施方式

，所提供的详细说明和任何具体的实施例仅以举例方式给出，因为在本发明精神和范围内的多种变化和改变对于阅读所述详细说明的本领域技术人员而言将是明显的。

附图说明

图1描绘了来自杂交花椰菜品种Ironman(左)和RX05991199 (右)的头部。品种在夏天以50x50cm的间隔生长。

图2显示来自杂交花椰菜品种Ironman(左)和RX05991199(右) 的茎的水平截面。品种在秋天以50x50cm的间隔生长。

图3显示来自杂交花椰菜品种Ironman(左)和RX05991199(右) 的头部和茎的轮廓。品种在秋天以50x50cm的间隔生长。

图4显示具有QTL1-BoGLS-ELONG标志物的不同ELONG等位基因的分析结果。V等位基因是与Myb28关联的甘蓝麦等位基因，其导致高的3-MSP/4-MSB比率和高的总硫代葡萄糖苷。A、B和C等位基因是在不含甘蓝麦ELONG等位基因的花椰菜中发现的等位基因的实例。

图5显示花椰菜品种FT69中包含的来自甘蓝麦的Myb28基因座的共有序列和来自不具有增加水平的硫代葡萄糖苷的花椰菜例如甘蓝(Oleracea)的相应基因座的共有序列之间的比对(SEQ ID NO：8-9)。

发明详述

本发明提供与甘蓝植物的植株、种子和衍生物有关的方法和组合物，该甘蓝植物包含能够赋予增加的4-甲基亚磺酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)(又名萝卜硫苷)的来自甘蓝麦的新的重组基因渗入。还意外地发现，包含所述基因渗入的植物能够稳定地产生相对于屈曲花苷具有增加的萝卜硫苷含量的杂种，而当使用包含非重组基因渗入的亲本品系时，例如在包含来自甘蓝麦的Myb28和ELONG等位基因的杂种PS05151639的Myb28供体亲体(美国专利申请公布号 2011/0055945)的情况下，结果显著更易变。从单一近交亲本生产多种具有增加的硫代葡萄糖苷含量和/或萝卜硫苷与屈曲花苷比率的优良杂种后代的能力的重要之处在于可用于产生杂交品种的优良甘蓝亲本品系是有限的。因此降低的基因渗入实际上增加了给定近交系的效用并且例如允许产生有可能适应不同的生长环境、最终用途或其他标准的多种杂种，其各自具有所需的萝卜硫苷含量。

包含来自甘蓝麦的Myb28基因座且缺乏来自甘蓝麦的迄今与其遗传连锁的ELONG基因座的新的“降低的基因渗入”能够稳定地赋予源自包含所述基因渗入的植物的杂种相对于屈曲花苷增加的萝卜硫苷。因此本发明的一个方面涉及用于获得包含至少一种这种降低的基因渗入的甘蓝植物的方法，其中所形成的甘蓝植物和/或源自其的后代相对于缺乏所述基因渗入的对照植物具有所需的萝卜硫苷含量。因此本发明提供具有由本发明的降低的基因渗入所赋予的所需的萝卜硫苷含量的植物。在某些实施方式中，用于获得这种植物的方法包括获得对于来自甘蓝麦的Myb28等位基因为杂合的甘蓝植物，所述Myb28 等位基因赋予增加的硫代葡萄糖苷且在植物中与来自甘蓝麦的 ELONG等位基因遗传连锁；获得这种植物的后代；和选择一种或多种这种后代植物，其中发生遗传重组以使得所述后代包含来自甘蓝麦的Myb28等位基因但不包含来自甘蓝麦的ELONG等位基因。由于存在Myb28等位基因而不存在来自甘蓝麦的ELONG等位基因，这种后代或其进一步的后代也可以具有所需的萝卜硫苷含量。在具体的实施方式中，所述方法可以包括通过鉴别一种或多种与Myb28和/或 ELONG等位基因遗传连锁的遗传标志物来获得包含这种等位基因的后代植物。鉴别遗传标志物可以包括表型、遗传或生物化学试验，且可包括筛选亲本和/或后代植物中例如一种或多种本文描述的等位基因，例如包括来自甘蓝麦的Myb28等位基因、来自甘蓝麦的ELONG 等位基因和来自甘蓝的ELONG等位基因的存在。

据发现对于甘蓝麦Myb28等位基因杂合的杂种后代中某些性状例如相对于屈曲花苷含量的萝卜硫苷含量或者硫代葡萄糖苷种类的不可预测性与来自甘蓝麦的Myb28等位基因和来自甘蓝麦基因渗入的ELONG等位基因中的硫代葡萄糖苷性状共定位(co-locate)。因此，“降低”的基因渗入的形成理解为由在Myb28和ELONG QTL附近的重组事件引起。包含降低的基因渗入，即，经历了具有增加的硫代葡萄糖苷的接近于该QTL的重组事件的品系可以通过利用分子和/或表型标志物来有效地筛选。因此，相对于由Myb28和ELONG基因渗入指定的QTL而言分离的(即杂合的)植物群体或这种群体的后代可以筛选具有重组表型例如相对于屈曲花苷水平增加的萝卜硫苷水平的植物。

在其他的实施方式中，本发明的方法可以包括鉴别包含源自于甘蓝麦的降低的基因渗入，并包含本文所描述的Myb28和ELONG等位基因之间的减数***重组的甘蓝植物。在特定的实施方式中，鉴别基因渗入可以包括采用标准方案测量萝卜硫苷和/或屈曲花苷。在某些实施方式中，与包含来自甘蓝麦的Myb28和ELONG等位基因的植物或缺乏来自甘蓝麦的Myb28等位基因的植物相比，包含如本文公开的降低的基因渗入的本发明植物包含增加的相对于屈曲花苷的平均萝卜硫苷比例。在一个实施方式中，包含增加的相对于屈曲花苷的平均萝卜硫苷比例的这种植物是近交系，以及在另一个实施方式中定义为以包含本发明的降低的基因渗入的植物作为一种或多种亲本的杂种F1。在特定的实施方式中，提供本发明的植物，其包含的萝卜硫苷与屈曲花苷的比率为约10∶1、12∶1、15∶1、18∶1、20∶1、23∶1、25∶1、28∶1、 30∶1、35∶1和约40∶1。在一个方面，萝卜硫苷含量的增加可以参照标准甘蓝品种例如花椰菜品种Ironman来计算。

A.具有增加的萝卜硫苷的甘蓝品系的培育

本发明的一个方面涉及使本文提供的包含降低的Myb28/ELONG 基因渗入的植物与其本身或第二植物杂交的方法，以及由这种方法生产的种子和植物。这些方法可用于生产和繁殖栽植的甘蓝植物，其具有所需的硫代葡萄糖苷组成，包括MSB和/或MSP含量。然而进一步地，本发明的具有增加的硫代葡萄糖苷含量的植物相对于不含增加的硫代葡萄糖苷的植物包含改进的植物营养价值。该方法也可用于生产杂种甘蓝种子和由其生长的植物。通过将这种品系与第二甘蓝亲本品系杂交产生杂种种子。所述杂种对于降低的基因渗入可以是杂合的或纯合的。

甘蓝麦是西西里西北部和中部的地方性野生品种，因此Myb28 等位基因可以通过本领域技术人员从选自野外的植物获得。或者， Myb28等位基因是本领域已知的且可从用于本发明的其他来源获得， 包括SNR 347(FT69；在Mithen等，Theor Appl Genet，106：727-734；2003 中称为428-11-69)、BR384-014、SNP13(580333)、SNP88 (BRM51-1210)、BR384-020、B1639(ATCC登录号PTA-9676，意大利 甘蓝，Brassica oleracea var.italica，保藏日2008年12月23日)、 BRM51-1162(ATCC登录号PTA-9675，意大利甘蓝，Brassica oleraceavar.italica，保藏日2008年12月23日)和RX 05991199(ATCC登录号 PTA-13165，花椰菜，甘蓝，Broccoli，Brassica oleracea，保藏日2012 年12月20日)。根据本发明，本文提供的植物通常将缺乏来自甘蓝麦 的与Myb28等位基因遗传连锁的ELONG等位基因。这可以根据本发 明通过将包含Myb28和来自甘蓝麦的ELONG等位基因的植物与不包 含Myb28和来自甘蓝麦的ELONG等位基因的芸苔属植物，包括标准 甘蓝品种，杂交而实现。这尤其包括本领域熟知的许多花椰菜品种。

蔬菜育种的目标是在单个品种/杂种中组合各种所需性状。这种所需性状可以包括任何种植者和/或消费者认为有益的性状，包括高产量、抗虫性或抗病性、对环境应力的耐受性和营养价值。用于尝试获得所需性状的育种技术利用了植物的授粉方法。存在两种常规的授粉方法：如果来自一朵花的花粉传递到相同植物的同一朵花或另一朵花，则为植物自花授粉，如果花粉从不同植物的花到达它，则为植物异花授粉。

开发均一的品种需要产生纯合近交植物、这些近交植物的杂交和杂交的评价。系谱育种和轮回选择是已用于从育种群体产生近交植物的育种方法的实例。那些育种方法将来自两种或更多种植物或各种其他广泛来源的遗传背景结合入育种池中，通过近交和所需表型的选择来从育种池产生新品系和源自该新品系的杂种。

根据本发明，新品种可以通过杂交本发明植物然后按照所需选择代并近交以产生均一品系而建立。新品种也可以通过与任何第二植物杂交来建立。在选择这种第二植物用于杂交而开发新品系的目的时，可能需要选择其本身表现出一种或多种选定的所需特性或在杂种组合时显示所需特性的那些植物。一旦进行初次杂交，进行近交和选择以产生新品种。为了开发均一品系，通常包括五代或更多代的自交和选择。

新品种的均一品系也可通过单倍体加倍的方式来开发。该技术允许建立真实育种品系(true breeding line)而不需要多代的自交和选择。以这种方式，真实育种品系可以在少至一代的情况下产生。单倍体胚可从小孢子、花粉、花药培养或子房培养产生。然后单倍体胚可以自发地或通过化学处理(例如秋水仙碱处理)来加倍。或者，单倍体胚可以生长成单倍体植物并经处理以诱导染色体加倍。在任何一种情况下，获得能繁殖的纯合植物。根据本发明，任何一种这种技术可用于与本发明植物及其后代结合以获得纯合品系。

回交也可以用于改良近交植物。回交将特定的所需性状，例如增加的萝卜硫苷，从一种近交或非近交来源转移到缺乏该性状的品种。这可以例如通过首先将亲本(A)(轮回亲本)与携带用于所讨论的性状的一个或多个适当的基因座的供体近交系(非轮回亲本)杂交。然后这一杂交的后代与轮回亲本(A)回配，然后在生成的后代中选择待从非轮回亲本转移的所需性状。在选择所需性状的五个或更多个的回交世代之后，后代对于控制所转移的特性的基因座是杂合的，但是对于大部分或几乎所有的其他基因座而言，其类似于第一亲本。最后的回交世代将自交以提供所转移性状的纯育种后代。

适当的轮回亲本的选择对于成功的回交程序而言是重要的步骤。回交方案的目标是改变或代替原品种的单一性状或特性。为实现该目标，用来自非轮回亲本的所需基因座改良或替代轮回品种的单个基因座，同时基本上保持原品种的所有其余的所需遗传组成，并因此保持所需生理和形态学构成。具体的非轮回亲本的选择将取决于回交的目的；主要目的之一是将一些商业所需的性状添加至该植物。精确的回交方案将取决于待改变的特性或性状以确定适当的测试方案。尽管当所转移的特性是显性等位基因时回交方法简化，然而也可以转移隐性等位基因。可能有必要引入后代测试以确定所需特性是否已经成功转移。

甘蓝品种也可从两种以上的亲本开发。称为改良回交的该技术在回交期间使用不同的轮回亲本。改良回交可用于以具有某些更期望的特性的品种代替原始轮回亲本或多个亲本可用于获得来自各亲本的不同的所需特性。

许多单个基因座性状已被鉴别，其在开发新的近交体系的过程中并非有规律地选择，但可以通过回交技术改进。单个基因座性状可以是或不是转基因的；这些性状的实例包括但不限于，雄性不育性、除草剂抗性、对细菌、真菌或病毒疾病的抗性、抗虫性、雄性能育性的恢复、改良的脂肪酸或碳水化合物代谢和提高的营养质量。这些包含通常通过细胞核遗传的基因。

可以应用直接选择，其中单个基因座作为显性性状发挥作用。选择用于育种的甘蓝植物不一定取决于植物的表型，而可以相反地基于遗传研究。例如，可以利用与目标性状紧密遗传连锁的适当的遗传标志物。这些标志物之一可用于鉴别特定杂交的后代中某性状的存在或不存在，以及可用于选择用于继续育种的后代。该技术通常称为标志物辅助育种。能够鉴别植物中目标性状的相对存在或不存在的任何其他种类的遗传标志物或其他试验也可以用于育种目的。

标志物辅助选择的程序对于给定性状的渗入特别有用。根据本发明可用的公知的遗传标志物类型包括但不是必定限于，简单序列长度多态性(SSLP)、酶切扩增多态性序列(CAP)、随机扩增多态性DNA (RAPD)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特征性扩增区域(SCAR)、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)、扩增片段长度多态性(AFLP)和单核苷酸多态性(SNP)。

B.通过遗传工程而源自本发明植物的植物

可通过回交引入以及直接引入植物中的许多有用的性状是可通过遗传转化技术引入的那些。因此遗传转化可用于将选定的转基因***本发明的芸苔属植物中，或者，可用于制备可通过回交引入的转基因。转化植物(包括芸苔属)的方法是本领域技术人员所熟知的。

用于转化植物细胞的载体不受限制，只要所述载体可以在细胞中表达***的DNA。例如，可以使用包含用于在芸苔属细胞中组成型基因表达的启动子(例如花椰菜花叶病毒35S启动子)和可通过外部刺激诱导的启动子的载体。适当的载体的实例包括pBI二元载体。载体待引入其中的“芸苔属细胞”包括各种形式的芸苔属细胞，例如培养的细胞悬液、原生质体、叶切片和愈伤组织。

可将载体通过已知方法引入芸苔属细胞中，例如聚乙二醇法、聚阳离子法、电穿孔法、土壤杆菌介导的转移、粒子轰击和原生质体 DNA直接摄取。

为通过电穿孔法实现转化，可以使用易碎组织例如细胞的悬浮培养物或胚胎发生愈伤组织，或可以直接转化未成熟胚或其他组织化的组织。在该技术中，可以通过将细胞暴露于果胶降解酶(果胶裂解酶) 或以受控方式机械损伤组织来部分降解所选细胞的细胞壁。

将转化DNA片断递送到植物细胞的一种有效方法是微粒轰击。在该方法中，将颗粒用核酸包被并通过推进力递送入细胞中。示例性的颗粒包括由钨、铂和优选金组成的那些。对于轰击，悬浮中的细胞在过滤器或固体培养基上浓缩。或者，可以将未成熟胚胎或其他靶细胞设置在固体培养基上。待轰击的细胞可以以适当的距离定位在微粒停止板(macroprojectile stopping plate)下。微粒轰击技术是可广泛应用的，且可用于有效地转化任何植物品种。

农杆菌介导的转移是用于将基因座引入植物细胞的另一种能广泛应用的系统。该技术的优点是可以将DNA引入整个植物组织中，从而不需要从原生质体再生完整植物。现代的农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌(及其他根瘤菌)中复制，从而允许方便的操作。此外，用于农杆菌介导的基因转移的载体中的最新技术进步改进了载体中基因和限制性位点的布置以促进能够表达各种多肽编码基因的载体的构建。所描述的载体具有用于所***的多肽编码基因的直接表达的侧邻启动子和聚腺苷酸化位点的方便的多接头区域。另外，包含武装和解除武装的Ti基因的农杆菌可用于转化。

在其中农杆菌介导的转化是有效的那些植物株系中，其由于基因座转移的易实现和限定的性质而是特别选择的方法。使用农杆菌介导的植物整合型载体来将DNA引入植物细胞中是本领域熟知的(美国专利第5,563,055号)。例如，美国专利第5,349,124描述了采用农杆菌介导的转化来转化植物细胞的方法。通过***具有编码全长B.t.毒素蛋白质的DNA编码序列(其表达对于鳞翅目幼虫毒性的蛋白质)的嵌合基因，该方法使得植物具有对这种昆虫的抗性。

许多启动子能用于任何目标基因的植物基因表达，所述目标基因包括但不限于，选择标记、可评分标志物(scorable marker)、用于害虫耐受、疾病抗性、营养增强的基因和任何其他的具有农艺学意义的基因。用于芸苔属植物基因表达的组成型启动子的实例包括但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)P-35S启动子(其在大多数植物组织(包括单子叶植物)中赋予组成型的高水平表达)、CaMV 35S启动子的连续重复形式、增强的35S启动子(P-e35S)、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子；和如美国专利第5,378,619号描述的玄参花叶病毒(P-FMV)启动子和增强型FMV启动子(P-eFMV)(其中P-FMV的启动子序列串联重复)、花椰菜花叶病毒19S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子和已知在植物细胞中表达的其他植物 DNA病毒启动子。

示例性的可引入本发明植物中的核酸包括例如，来自另一物种的 DNA序列或基因，或甚至来源于或存在于相同物种中但通过遗传工程方法而不是传统的繁殖或育种技术引入受体细胞中的基因或序列。然而，术语“外源”也用来指通常不存在于正转化的细胞中或也许仅仅不是以如在转化DNA片断或基因中发现的形式、结构等存在的基因，或者正常存在的且期望以不同于天然表达模式表达(例如过表达)的基因。因此，术语“外源”基因或DNA用来指引入受体细胞中的任何基因或DNA片断，不管类似的基因是否可能已经存在于这种细胞中。外源DNA中所包含的DNA的种类可以包括已经存在于植物细胞中的 DNA、来自另一种植物的DNA、来自不同生物体的DNA或外部产生的DNA，例如包含基因的反义信使的DNA序列，或编码合成或修饰形式的基因的DNA序列。

成百上千的不同基因是已知的且可潜在地引入根据本发明的芸苔属植物中。可以选择以引入芸苔属植物可的特定基因和相应的表型的非限制性实例包括用于昆虫耐受性(如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis(B.t.))基因)，害虫耐受性(例如用于真菌疾病控制的基因)，除草剂耐受性(例如赋予草甘磷耐受性的基因)，和用于品质改进例如产量、营养增强、环境或应激耐受性、或任何植物生理、生长、发育、形态学或植物产品中的期望变化的一种或多种基因。例如，结构基因将包括赋予昆虫耐受性的任何基因，包括但不限于芽胞杆菌昆虫控制蛋白质基因，如WO99/31248所描述，其通过引用方式全部合并于此；如美国专利第5,689,052所描述，其通过引用方式全部合并于此；如美国专利5,500,365和5,880,275所描述，其通过引用方式全部合并于此。在另一个实施方式中，所述结构基因可以赋予除草剂草甘磷耐受性，如通过包括但不限于如美国专利第5,633,435(其通过引用方式全部合并于此)所描述的农杆菌菌株CP4草甘磷抗性 EPSPS基因(aroA：CP4)或如美国专利第5,463，175(其通过引用方式全部合并于此)所描述的草甘磷氧化还原酶基因(GOX)的基因所赋予的。

或者，DNA编码序列可以通过编码例如经由反义或共抑制介导的机制引起内源基因表达的靶向抑制的非翻译RNA分子来影响这些表型。RNA也可以是经工程化以切割所需内源mRNA产物的催化性 RNA分子(即核酶)。因此，产生表达目标表型或形态学改变的蛋白质或mRNA的任何基因能用于实施本发明。

D.定义

在说明书和本文的表格中使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的明确和一致的理解，提供以下定义：

等位基因：基因座的任何一种或多种可选形式，所有该等位基因与一种性状或特性有关。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。

回交：育种者将杂种后代(例如第一代杂种(F1))与杂种后代的亲本之一重复杂交的过程。回交可用于将来自一种遗传背景的一种或多种单基因座转化引入另一种遗传背景中。

栽培品种：适于消费并满足商业栽培要求的甘蓝品种。一个实例是花椰菜品种。除植物本身和适于消费的其部分例如头部或叶之外，本发明包括适于繁殖的植物部分或衍生物。适于繁殖的部分的实例是器官组织，例如叶、茎、根、芽等、原生质体、体细胞胚、花粉囊、叶柄、培养中的细胞等。适于繁殖的衍生物例如为种子。根据本发明的植物可以以常规方式栽培或繁殖，但也可以从植物部分通过组织培养技术栽培或繁殖。

杂交：两种亲本植物的交配。

异花授粉：通过来自不同植物的两个配子的结合来受精。

二倍体：具有两套染色体的细胞或生物体。

酶：可以用作生物反应中的催化剂的分子。

F1杂种：两个非同基因植物杂交的第一代后代。

基因型：细胞或生物体的遗传组成。

单倍体：具有二倍体的两套染色体中的一套的细胞或生物体。

连锁：其中相同染色体上的等位基因比它们的转移是独立的情况下所预期的随机情况趋于更频繁地一起分离的现象。

标志物：可容易检测的表型，优选以共显性形式(二倍体杂合体中基因座上的两个等位基因可容易地检测)遗传，没有环境变异成分，即，遗传力为1。

表型：细胞或生物体的可检测特征，该特征是基因表达的表现。

数量性状位点(QTL)：数量性状位点(QTL)是指在某种程度上控制通常连续分布的可用数字表示的性状的基因位点。

重组事件理解为是指减数***交换。

再生：从组织培养发育成植物。

自花授粉：花粉从花粉囊转移至同一植物的柱头。

单基因座转化的(转化)植物：通过称为回交的植物育种技术开发的植物，其中恢复了花椰菜品种基本上所有所需的形态学和生理特征，除经由回交技术和/或通过遗传转化转移入该品种中的单基因座的特征之外。

实质上等同：当比较时，未显示与平均值的统计学显著差异(例如，p＝0.05)的特征。

组织培养物：包含相同或不同种类的分离细胞或组织化为植物部分的这种细胞的集合的组合物。

转基因：包含已通过转化引入花椰菜植物的基因组中的序列的基因位点。

尽管前述发明已经为明确和理解目的较详细地通过例证和实例的方式进行了描述，但很明显，可在本发明范围内实施某些变化和改变，本发明仅由所附的权利要求的范围限制。

本文引用的所有参考文献以引用方式明确地合并于此。

E.保藏信息

保藏由花椰菜杂种RX05991199的至少2500粒种子组成，其包括 本文所述的来自甘蓝麦的Myb28等位基因和来自甘蓝的ELONG等位 基因的降低的基因渗入。该保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)， 10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA进行。该保 藏指定ATCC登录号PTA-13165。保藏日期是2012年8月20日。在 本申请未决期间按要求向有资格的人提供获得该保藏的权利。该保藏 将在ATCC保藏机构(其是公共保藏机构)保藏30年或最新要求之 后的5年的时间，或对于本专利的可实施期限，以较长者为准，且如 果在该时期期间为非存活的，则将进行替换。申请人不豁免对本专利 或任何其他形式的品种保护授予的其权利的任何侵犯，包括植物品种 保护条例(7 U.S.C.2321etseq.)。

实施例

实施例1

具有改进的MSB特征的亲本品系的开发

本发明的一种益处是可以产生包含本发明的降低的基因渗入的亲本品系，其中所述品系和由其衍生的杂种具有增加的MSB/MSP比例和/或MSB表达的较高稳定性。这种包含Myb28/ELONG降低的基因渗入的花椰菜品系的开发可概括如下：

将由于存在来自甘蓝麦的Myb28和ELONG基因座而具有增加的植物化学MSP(屈曲花苷)水平的品系FT69(Mithen等，2003；Theor. Appl.Genet.，106：727-734)与称为BR9的育种品系杂交。将所形成的后代与来自Ironman(BRM 56-3905 SI)的雄性亲本杂交。F1子代在 Wageningen选择试验中重复生长。从称为408、409、410、411和412 的地块中，选择89株植物分析屈曲花苷(MSP)和萝卜硫苷(MSB)。选择具有最高MSB的六株植物。

将所有6株植物自交并与轮回亲本BRM 56-3905 SI回交。6个自交和6个BC1在Wageningen的的重复选择试验中种植。每个BC1(其中BC＝回交)具有2个地块，其中24株植物/地块。从这12个地块中，选择大部分与轮回亲本类似的总共84株植物。来自这些选择的头部用于MSP和MSB分析。留下七株具有最高MSB的植物用于进一步的自交和BC。将所有7株BC1植物自交并与轮回亲本(BRM 56-3905 SI)回交。播种自交和5个BC2群体并在Wageningen秋季重复选择试验中选择。选择大部分与轮回亲本类似的总共73株植物，并用于 MSP/MSB分析。留下八株具有最高MSB水平的BC2植物用于进一步的自交和BC。

将所有8株BC2植物自交并与轮回亲本(BRM 56-3905 SI)回交。获得四株BC3并在Wageningen以1-4复制种植。最接近轮回亲本的 47株植物用于MSP/MSB分析。留下7株具有最高MSB水平的BC3 植物用于进一步的自交和BC。将所有7株BC3植物自交并与轮回亲本(BRM 56-3905 SI)回交。获得6株BC4，这些在选择试验中种植。最接近轮回亲本的54株植物用于MSP/MSB分析。留下8株具有最高 MSB水平的BC4植物用于进一步的自交和BC。

将所有8株BC4植物自交。7株BC4植物产生自交种子且BC4F2 在未重复Wageningen选择试验中种植。选择最接近轮回亲本的37株 BC4F2植物，且这些用于MSP/MSB分析。留下4株具有最高MSB 水平的BC4F2植物用于进一步的自交和BC。

将所有4株BC4F2植物自交。所有4株产生自交种子且BC4F3 在未重复选择试验中种植。选择最接近轮回亲本的12株BC4F3植物并用于MSP/MSB分析。留下4株具有最高MSB水平的BC4F2植物用于进一步的自交和BC。来自地块1169(570114)的所有选择的植物具有同样高的平均2.3mmol/kg的MSB水平，或约5x标准参照品种的水平(General)。这显示该来源具有固定用于高MSB的等位基因。

将来自1169(BC4F3)的所有3种选择自交。所有3株产生种子且它们在选择试验中种植。SNP13-580333(1169-1，A75-1)在类型上是最均一的，并选择5株植物用于MSB检查。所有5株具有同样高的约 3.2mmol/kg的MSB水平。将1169-1，也称为BRM 53-3934 SI，放在组织培养物上用于增长和用作RX-1199(RX 05991199)的雄性亲本。 BRM 53-3934 SI分析显示它包含Myb28的降低的基因渗入，这导致能够稳定地产生包含硫代葡萄糖苷的后代的亲本品系，相对于具有甘蓝麦ELONG基因座的植物，所述硫代葡萄糖苷包含增加的MSB/MSP 比例，如下所示。

实施例2

具有增加的萝卜硫苷的杂种花椰菜品系的分析

如表1中所示，杂交中使用不同的标准花椰菜品系作为雌性亲本进行自交和与以下品种进行远交：(1)FT69(具有来自甘蓝麦的 ELONG和Myb28的高屈曲花苷品系)，(2)SNP13-580333(具有来自甘蓝的ELONG和来自甘蓝麦的Myb28的高萝卜硫苷品系，如上所述)，和(3)SNP88-BRM51-1210(具有来自甘蓝麦的ELONG和Myb28的高屈曲花苷品系)。如可见的，常规花椰菜品系具有相对低含量的总硫代葡萄糖苷。尤其在FT69(428-11-69)的情况中MSB与MSP之间的比率显示为取决于常规花椰菜雌性品系，其包含来自甘蓝麦的ELONG 和Myb28等位基因。相反，在所有与SNP 13-580333的杂交中，大部分硫代葡萄糖苷是萝卜硫苷。这表明降低的基因渗入在与多种不同的第二亲本的杂交中稳定地产生包含增加的萝卜硫苷的杂交品种中的益处。

实施例3

花椰菜杂种的开发

如以上所解释，本发明的一个实施方式包括生产花椰菜杂种，其中该杂种的一个或两个亲本包含Myb28降低的基因渗入，并因此相对于缺乏包含该基因渗入的亲本的杂种具有增加的MSB含量和/或更稳定的MSB含量。所产生的这种杂种的一个实例是杂种RX05991199。该杂种通过将亲本BRM 53-3934 SI和BRM 56-3907 CMS杂交，典型地以BRM 53-3934 SI作为雄性亲本而产生。BRM 53-3934 SI的生产在以上实施例1中描述。如所解释的，该亲本包含Myb28降低的基因渗入。雌性亲本BRM 56-3907 CMS是用作商业杂种“Ironman”的亲本的已知近交系。BRM 56-3907 CMS是2007年6月18日授权的EU植物品种权证书#20341的主题并在其中描述。

花椰菜杂种RX 05991199及其亲本品系的生理学和形态学特性的描述显示于下。

表2：杂种RX 05991199的生理学和形态学特征

*这些是典型值。值可以由于环境而改变。基本上等同的其他值也在本发明的范围内。

表3：品系BRM 53-3934 SI的生理学和形态学特征

*这些是典型值。值可以由于环境而改变。基本上等同的其他值也在本发明的范围内。

杂种RX 05991199相对于杂种”Heritage”的MSB含量是客观分析的主题。分析结果显示如下。

表4：RX 05991199的MSB含量分析

还进行多重位置和种植中RX 05991199相对于杂种Ironman的萝卜硫苷(MSB)含量的头对头分析。结果显示如下。

表5：RX 05991199相对于杂种的萝卜硫苷(MSB)含量分析

实施例4

使用遗传标志物来鉴别和追踪降低的基因渗入

开发了遗传标志物试验来对Myb28和ELONG等位基因进行基因分型。因此该试验允许鉴别根据本发明的降低的基因渗入以及将所述降低的基因渗入标记辅助引入任何其他基因型中。

A.用于检测ELONG的标志物

获得了称为QTL1-BoGLS-ELONG的标志物，其允许检测甘蓝麦 ELONG等位基因的存在或不存在。该标志物可采用引物对 AF399834F2：5’-cggattttcaaattttctcg-3’(SEQ IDNO：1)和AF399834R2： 5’-atttcgcatgaccactaggc-3’(SEQ ID NO：2)来检测。为检测所述标志物，平板加载2μL体积中的20ng DNA模板(样品)。将3μL预混物(0.437 μL水、2.5μL Q PCR(ROX)混合物、0.063uL试验混合物)添加到各孔中使得最终体积为5μL。PCR条件如下：95℃下15分钟，然后40次循环的95℃下15秒，60℃下1分钟。图4显示采用所述标志物用于不同的ELONG等位基因的试验的结果。V等位基因指示甘蓝麦等位基因，而A、B和C等位基因是不含甘蓝麦ELONG等位基因的花椰菜中发现的等位基因的实例。

B.用于检测Myb28的标志物

Myb28等位基因中遗传多态性的鉴别及其用作遗传标志物在与本申请同时提交的美国临时申请序列号61/700,731中描述，其公开内容以引用方式全部合并于此。具体地，其中描述了甘蓝等位基因与相应的Myb28序列之间的序列比对以鉴别可用于所选Myb28等位基因的基于标志物的选择的多态性。结果显示于图5中，其是花椰菜品种 FT69中包含的来自甘蓝麦的Myb28基因座的共有序列和来自不具有增加水平的硫代葡萄糖苷的花椰菜例如甘蓝(Oleracea)的相应基因座的共有序列之间的比对。显示了在总长2202bp的中检测的26个多态性(例如，单征多态性(SFP)-其中具有16个SNP和10个indel)。它们中的任一个或其它鉴别的多态性可以用作所需Myb28(包括来自甘蓝或甘蓝麦)的存在或不存在的遗传标志物。

基于所鉴别的序列多态性之一按如下设计TaqMan试验 (NBOLI009111370)：

NBOLI009111370序列(SEQ ID NO：3)：

正向引物(SEQ ID NO：4)： GTGAAAGAGATAAGATGGAAGACCAAAGT

反向引物(SEQ ID NO：5)： GTGACTAAAAATTGCAATAGCACACATCA

Vic探针(SEQ ID NO：6)：CTATTCCATAGAAAAGC

Fam探针(SEQ ID NO：7)：CTATTCCATAAAAAAGC

采用如下标准过程进行该试验：用5μL体积中的20ng DNA模板加载平板。将10μL预混物(2份，每份为1XPCR混合物、0.437μL 水、2.5μL Q PCR(ROX)混合物、0.063uL试验混合物、2μL的5ng/μL 引物)添加到各孔中使得最终体积为15μL。

PCR条件如下：50℃下2分钟，然后95℃下2分钟，然后40次循环的95℃下15秒，60℃下1分钟。

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根据本公开，本文公开并要求保护的所有组合物和/或方法可以在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选实施方式来描述，对本领域技术人员显而易见的是，可在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文描述的组合物和/或方法和所述方法中的步骤或步骤中的顺序施加变化。更具体地，很明显，某些化学和生理学相关的试剂可用于替代本文描述的试剂而实现相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这种类似的替代和改变被认为在如所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。