一种组织工程角膜及其制备方法
阅读说明：本技术 一种组织工程角膜及其制备方法 (Tissue engineering cornea and preparation method thereof ) 是由 弥胜利 王杰琼 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：一种组织工程角膜及其制备方法,该组织工程角膜包括至少三层的层叠结构,其中每一层为静电纺丝或静电直写或光固化3D打印制备的纤维支架与胶原、脱细胞基质、丝素蛋白中的一种或多种固化复合形成的复合层,相邻两层之间接种有角膜基质细胞和神经元,所述角膜基质细胞和所述神经元可沿着支架的纤维的方向生长,相邻两层之间的角膜基质细胞分泌细胞外基质,形成类似于人的角膜基质的组织结构,所述层叠结构的上、下表面分别接种角膜上皮细胞和角膜内皮细胞。该组织工程角膜能很好地模拟角膜的结构,制备简单,生物相容性好,并且易于与组织融合。(A tissue engineering cornea and a preparation method thereof are disclosed, the tissue engineering cornea comprises a laminated structure of at least three layers, wherein each layer is a composite layer formed by solidifying and compounding a fibrous scaffold prepared by electrostatic spinning or electrostatic direct writing or photocuring 3D printing and one or more of collagen, acellular matrix and silk fibroin, corneal stromal cells and neurons are inoculated between two adjacent layers, the corneal stromal cells and the neurons can grow along the direction of fibers of the scaffold, the corneal stromal cells between two adjacent layers secrete extracellular matrix to form a tissue structure similar to human corneal stroma, and the upper surface and the lower surface of the laminated structure are respectively inoculated with corneal epithelial cells and corneal endothelial cells. The tissue engineering cornea can well simulate the structure of the cornea, is simple to prepare, has good biocompatibility and is easy to fuse with tissues.)
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，特别是涉及一种组织工程角膜及其制备方法。
背景技术
角膜疾病是眼科的常见多发病，角膜病致盲率在盲目流行病学调查中排名第二，角膜移植是治疗角膜盲的唯一有效方法。但由于捐献角膜的高度匾乏致使绝大部分患者得不到角膜移植而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起与发展为组织工程角膜的体外重建及其临床应用创造了条件，也为角膜病盲患者通过组织工程角膜的移植重见光明带来了新的希望，但如何获得理想的载体支架仍然是当前组织工程角膜体外重建研究的热点和难点。
角膜从结构上可分为5层，角膜基质层由人角膜基质细胞和200-250个胶原纤维板层构成，占据角膜厚度的80％-90％。角膜基质细胞主要合成细胞外基质。基质层的胶原纤维排列规则、均匀，成片状，层层紧密相叠，各纤维层又成十字交叉排列，角膜基质的结构决定角膜的透光度，因此组织工程角膜能否具有与人角膜相似的三维结构至关重要。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种组织工程角膜及其制备方法，更好地模拟在人体环境内的角膜并提高组织工程角膜的性能。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种组织工程角膜，包括至少三层的层叠结构，其中每一层为静电纺丝或静电直写或光固化3D打印制备的纤维支架与胶原、脱细胞基质、丝素蛋白中的一种或多种固化复合形成的复合层，相邻两层之间接种有角膜基质细胞和神经元，所述角膜基质细胞和所述神经元可沿着支架的纤维的方向生长，相邻两层之间的角膜基质细胞分泌细胞外基质，形成类似于人的角膜基质的组织结构，所述层叠结构的上、下表面分别接种角膜上皮细胞和角膜内皮细胞。
进一步地：
所述纤维支架的材料为单一材料或者混合材料。
所述单一材料或者所述混合材料选自PCL、PLGA、明胶、甲基丙烯酸酯PDC(mPDC)预聚物、GelMA中的一种或多种。
相邻两层支架的纤维对齐或者以任意角度堆叠。
相邻两层支架的纤维呈正交排列。
所述角膜基质细胞由接种于相邻两层之间的干细胞分化而来，优选地，所述干细胞为角膜基质干细胞。
所述神经元为大鼠或小鼠海马神经元。
所述层叠结构的上下表面接种的角膜上皮细胞和角膜内皮细胞来源于原代或者传代培养的角膜上皮细胞和内皮细胞。
所述纤维支架为有序或无序仿角膜基质板层结构或仿神经结构支架。
一种所述的组织工程角膜的制备方法，包括如下步骤：
通过静电纺丝、静电直写或者光固化3D打印，制备纤维支架；
将制备好的支架置于模具中，然后倒入配好的胶原溶液、脱细胞基质水凝胶溶液、丝素蛋白溶液中的一种或多种，经过固化成型，其中胶原溶液还经过压缩脱水，最后得到一层；
在所得的层上接种角膜基质细胞和神经元，经过培养，角膜基质细胞分泌出细胞外基质，实现角膜基质细胞与神经元共培养；
将至少三层垒叠，所述层叠结构的上、下表面分别接种角膜上皮细胞和角膜内皮细胞，得到所述的组织工程角膜。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供的组织工程角膜采用静电纺丝、静电直写或者光固化3D打印制备的纤维支架和胶原/脱细胞基质/丝素蛋白形成的复合层堆叠至少三层，叠加构成胶合板结构，形成模拟角膜基质的多层纤维薄板结构，通不同层的纤维堆叠，可以任意角度排列或规则排列，如对齐或呈正交排列，且层间的角膜基质细胞分泌排列高度规则的细胞外基质，形成类似于角膜基质的组织结构，同时在层间引入神经元，实现角膜细胞与神经元的共培养，能够更好地模拟在人体环境内的角膜。同时，本发明中基于纤维支架形成的复合层叠加结构具有很好的力学性能，大大提高了组织工程角膜的厚度和机械韧性。
本发明的组织工程角膜能很好地模拟角膜的结构，制备简单，生物相容性好，并且易于与组织融合，所述组织工程角膜可应用于角膜组织发育研究，角膜药物研究的替代治疗，同时，还能够降低角膜移植术后排斥反应发生的几率，提高移植成功率。
附图说明
图1为本发明实施例的组织工程角膜的整体示意图,其中1a、1b、1c分别为组织工程角膜的立体结构、左视结构和俯视结构；
图2为本发明实施例的组织工程角膜的四种纤维支架接种角膜基质细胞和神经元之前和之后的示意图，其中2a、2b为静电直写纤维支架，2c、2d为有序静电纺丝纤维支架，2e、2f为有序仿神经结构纤维支架，2g、2h为无序仿神经结构纤维支架；
图3为本发明一种实施例的组织工程角膜的制备方法示意图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
参阅图1至图3，在一种实施例中，一种组织工程角膜1a、1b、1c，包括至少三层的层叠结构，其中每一层11、12为静电纺丝或静电直写或光固化3D打印制备的纤维支架2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g、2h与胶原、脱细胞基质、丝素蛋白中的一种或多种固化复合形成的复合层，相邻两层之间接种有角膜基质细胞21、23、25、27和神经元22、24、26、28，所述角膜基质细胞21、23、25、27和所述神经元22、24、26、28可沿着支架的纤维的方向生长，相邻两层之间的角膜基质细胞分泌细胞外基质，形成类似于人的角膜基质的组织结构，所述层叠结构的上、下表面分别接种角膜上皮细胞和角膜内皮细胞。所述纤维支架可以为静电直写或静电纺丝纤维支架，也可以为有序或无序仿角膜基质板层结构或仿神经结构支架。
本发明实施例的组织工程角膜采用静电纺丝、静电直写或者光固化3D打印制备的纤维支架和胶原/脱细胞基质/丝素蛋白形成的复合层堆叠至少三层，叠加构成胶合板结构，形成模拟角膜基质的多层纤维薄板结构，通不同层的纤维堆叠，可以任意角度排列或规则排列，如对齐或呈正交排列，且层间的角膜基质细胞分泌排列高度规则的细胞外基质，形成类似于角膜基质的组织结构，同时在层间引入神经元，实现角膜细胞与神经元的共培养。由此得到的组织工程角膜能够更好地模拟在人体环境内的角膜。同时，本发明中基于纤维支架形成的复合层叠加结构具有很好的力学性能，大大提高了组织工程角膜的厚度和机械韧性。本发明的组织工程角膜可应用于角膜组织发育研究，角膜药物研究的替代治疗，同时，其生物相容性好，并且易于与组织融合，还能够降低角膜移植术后排斥反应发生的几率，提高移植成功率。
本发明的组织工程角膜不仅能很好地模拟角膜的结构，而且其制备简单。
参阅图1至图3，在另一种实施例中，一种所述的组织工程角膜的制备方法，包括如下步骤：
通过静电纺丝、静电直写或者光固化3D打印，制备纤维支架；
将制备好的支架置于模具中，然后倒入配好的胶原溶液、脱细胞基质水凝胶溶液、丝素蛋白溶液中的一种或多种，经过固化成型，其中胶原溶液还经过压缩脱水，最后得到一层；
在所得的层上接种角膜基质细胞和神经元，经过培养，角膜基质细胞分泌出细胞外基质，实现角膜基质细胞与神经元共培养；
将至少三层垒叠，所述层叠结构的上、下表面分别接种角膜上皮细胞和角膜内皮细胞，得到所述的组织工程角膜。
如图1至图2所示，在一些具体实施例中，一种组织工程角膜1a、1b、1c，包括至少三层，其中每一层11、12都由静电直写纤维支架2a、2b，静电纺丝纤维支架2c、2d，有序仿神经结构纤维支架2e、2f，无序仿神经结构纤维支架2g、2h中的一种和胶原/脱细胞基质/丝素蛋白复合制备而成,相邻两层支架纤维可对齐或者任意角度堆放。所述组织工程角膜相邻的两层间种接生长有角膜基质细胞21、23、25、27和神经元22、24、26、28，且角膜基质细胞21、23、25、27和神经元22、24、26、28都能很好地沿着支架纤维的方向生长，两层之间的角膜基质细胞分泌规则排列的细胞外基质，形成类似于角膜基质的组织结构。胶原可以为鼠尾一型胶原/人源化胶原。
在一些实施例中，由静电直写得到的静电直写纤维支架2a、2b，或由静电纺丝得到的所述静电纺丝支架2c、2d，或由光固化3D打印制备的仿神经结构纤维支架2e、2f、2g、2h，可选用单一或者混合材料。通过控制混合材料的比例和交联度可实现一定程度的可控降解。优选地，材料可选自PCL、PLGA、PCL/明胶、甲基丙烯酸酯PDC(mPDC)预聚物、GelMA中的一种或多种。
所述角膜基质细胞由接种于组织工程角膜两层之间的干细胞分化而来，在优选的实施例中，所述干细胞为角膜基质干细胞。
所述神经元接种于组织工程角膜两层之间，优选为大鼠或小鼠海马神经元。
所述组织工程角膜上下表面接种的角膜上皮细胞和角膜内皮细胞来源于原代或者传代培养的角膜上皮细胞和内皮细胞。
如图3所示，一个具体实施例的组织工程角膜的制备方法包括：
通过静电纺丝、静电直写或者光固化3D打印，制备纤维支架；
将制备好的支架置于设计好的模具3a中，然后倒入配好的胶原溶液/脱细胞基质水凝胶溶液/丝素蛋白溶液3c，经过一定的条件固化成型，对于胶原溶液，需要进行压缩脱水，最后可得到其中的一层3e；
接种细胞培养一段时间，角膜基质细胞分泌出细胞外基质，且角膜基质细胞与神经元实现很好的共培养之后，将至少三层垒叠，得到所述的组织工程角膜1a。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。