阅读说明：本技术 酶法制备大米淀粉的工艺 (Process for preparing rice starch by enzyme method ) 是由 李梦露 于 2018-06-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了淀粉制备技术领域内的酶法制备大米淀粉的工艺,包括以下步骤,(1)大米粉的制备:将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h,打浆后离心,干燥,过200目筛；(2)大米粉中直链淀粉含量的测定：采用直链淀粉分析试剂盒,根据Con A法进行测定；(3)大米淀粉的酶法制备；(4)蛋白酶水解大米蛋白水解度的测定；(5)反应条件的确定；(6)进一步纯化大米淀粉：纤维素酶的处理、超声波处理；(7)Alcalase和protease N共同水解分离大米淀粉和蛋白质；本发明反应时间快,成本低。(The invention provides a process for preparing rice starch by an enzyme method in the technical field of starch preparation, which comprises the following steps of (1) preparing rice flour, namely cleaning 30g of rice, soaking the rice in 150mL of distilled water for 18h, pulping, centrifuging, drying, and sieving by a 200-mesh sieve; (2) determination of amylose content in rice flour: determining by using an amylose analysis kit according to a Con A method; (3) preparing rice starch by an enzyme method; (4) measuring the proteolysis degree of the protease hydrolyzed rice; (5) determining reaction conditions; (6) further purification of the rice starch: treating cellulase and performing ultrasonic treatment; (7) hydrolyzing Alcalase and protease N together to separate rice starch and protein; the invention has the advantages of fast reaction time and low cost.)

酶法制备大米淀粉的工艺

技术领域

本发明属于淀粉制备技术领域，特别涉及酶法制备大米淀粉的工艺。

背景技术

淀粉分离的方法因原料不同而异，玉米及小麦淀粉加工中的关键步骤为面筋蛋白的分离，木薯淀粉加工则主要采用筛分的方法。与玉米和小麦淀粉相比，大米淀粉的分离比较困难，主要是因为大米胚乳中的淀粉于蛋白质组分结合紧密，并且微小的颗粒使得大米淀粉很难沉淀于水中，增加了分离和纯化的困难。但是，要充分发挥大米淀粉颗粒粒径小，色泽白等优异的特性，必须将淀粉与其它组分进行有效的分离，其中首先要实现的就是与蛋白质的分离。

目前，大米淀粉的工业户生产主要采用碱水解蛋白质结合离心分离的工艺，但碱处理过程中会引入大量的盐分和碱性废液，增加了废水处理及排放的成本。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于克服上述现有技术中的不足之处，提供酶法制备大米淀粉的工艺，本发明不会引入大量盐分，不会增加废水处理的负担。

本发明的目的是这样实现的：酶法制备大米淀粉的工艺，包括以下步骤，

（1）大米粉的制备:将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后离心，干燥，过200目筛；

（2）大米粉中直链淀粉含量的测定：采用直链淀粉分析试剂盒，根据Con A法进行测定；

（3）大米淀粉的碱法制备：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后进行酶水解反应，水解过程中采用Ph-Stat方法满载每种蛋白酶的最适pH和最适温度下进行，每毫升反应液中加入500U蛋白酶，反应时间4h，待反应结束后将反应液进行离心分离，弃去上层清液并刮去沉淀表面的黄色物质，将沉淀反复用蒸馏水清洗若干次，直至水洗液的pH值为中性后将沉淀进行干燥，将干燥后的样品过200目筛即得大米淀粉；

（4）蛋白酶水解大米蛋白水解度的测定：根据蛋白酶水解大米蛋白过程中碱的消耗量可直接算出水解度（DH）的值：

；

式中，B为水解过程中所消耗的氢氧化钠溶液量（mL）；

N_b为溶液的当量浓度；

α为α-氨基解离度；

MP为底物蛋白质的总量；

h_tot为每克蛋白质中肽键的克当量数（取为8.13mmol）；

（5）反应条件的确定：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后分别与筛选的两种蛋白酶Alcalase和protease N进行酶水解反应，水解反应的温度均保持在两种蛋白酶的最适作用温度50℃；

（6）进一步纯化大米淀粉：纤维素酶的处理、超声波处理；

（7）Alcalase和protease N共同水解分离大米淀粉和蛋白质：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后进行酶水解反应，水解反应的温度保持在50℃，调整反应体系的pH值分别为9.5、10、10.5，Alcalase的加入量分别为70、100或120 U/mL（以反应液的体积记），当水解液的pH降到接近protease N的最适pH值时加入protease N，加入量取70、100或120 U/mL（以反应液的体积记），反应时间为4h，以反应起始pH值，Alcalase和protease N用量为因素，制备所得淀粉中残余蛋白的含量为指标设计L₉（3³）正交实验。

为了实现大米粉中直链淀粉含量的测定，所述步骤（2）具体包括以下步骤：

（201）准确称取20mg大米粉于具塞试管中，加入1mL DMSO于涡流混匀机混匀，加入2mL95%的乙醇振荡混匀，之后再加入4mL乙醇，混匀后静置15min，2000g，离心5min；

（202）取沉淀加入DMSO 0.2mL，沸水浴加热15min后加入2mL Con A容积，混匀后用ConA定容至5mL（此为溶液A）；

（203）取溶液A 1.0mL于2.0mL离心管中，加入0.50mL Con A溶液，多次混匀后，静置1h；

（204）取溶液A 0.5mL，加入4mL 100mmol/L pH4.5醋酸钠缓冲液，0.1mL淀粉葡萄糖苷酶、α-淀粉酶溶液，40℃下保温10min后取1.0mL，加入4mL GOPOD，40℃保温20min后于510nm测定吸光度。

为了实现大米淀粉颗粒破损率的测定，所述步骤（5）中，反应条件的确定还包括反应起始pH值的确定、加酶量的确定、反应时间的确定；

其中，反应起始pH值的确定包括以下步骤：将大米浆料的pH值用1.0mol/L的NaOH溶液调至10.0、10.5和11.0，加入Alcalase 100 U/mL，反应4h后林欣，反应结束后的处理方法同步骤（3），以大米淀粉中的蛋白含量为指标确定反应的最佳起始pH值，对于protease N，则将起始pH值调至8.5，其余反应条件和Alcalase相同；

反应时间的确定包括以下步骤：将大米浆料的pH值用1.0mol/L的NaOH溶液调至10.5，加入100 U/mL的Alcalase蛋白酶，分别保温2/4和6h后离心，反应结束后的处理和步骤（3）相同，以大米淀粉中蛋白含量为指标确定反应的最佳时间，对于protease N，将起始pH值调至8.5，其余反应条件和Alcalase相同。

为了处理纤维素酶，所述步骤（5）中，纤维素酶的处理包括以下步骤：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后将大米浆液的pH值调至5.0，加入60 U/mL的纤维素酶反应2h，调整反应体系的pH值至10.5或8.5，加入Alcalase或protease N 100 U/mL继续反应4h，之后的处理与步骤（3）相同。

作为本发明的进一步改进，所述步骤（5）中，超声波处理具体的为，在大米浆料中加入Alcalase或protease N之前先用超声波处理，采用50%的振幅，5s脉冲，总的作用时间为15min，之后加入Alcalase或protease N 100 U/mL反应4h后离心，处理与步骤（3）中相同。

具体实施方式

一种酶法制备大米淀粉的工艺，包括以下步骤，（1）大米粉的制备:将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后离心，干燥，过200目筛；

（2）大米粉中直链淀粉含量的测定：采用直链淀粉分析试剂盒，根据Con A法进行测定；

（3）大米淀粉的碱法制备：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后进行酶水解反应，水解过程中采用Ph-Stat方法满载每种蛋白酶的最适pH和最适温度下进行，每毫升反应液中加入500U蛋白酶，反应时间4h，待反应结束后将反应液进行离心分离，弃去上层清液并刮去沉淀表面的黄色物质，将沉淀反复用蒸馏水清洗若干次，直至水洗液的pH值为中性后将沉淀进行干燥，将干燥后的样品过200目筛即得大米淀粉；

（4）蛋白酶水解大米蛋白水解度的测定：根据蛋白酶水解大米蛋白过程中碱的消耗量可直接算出水解度（DH）的值：

；

式中，B为水解过程中所消耗的氢氧化钠溶液量（mL）；

N_b为溶液的当量浓度；

α为α-氨基解离度；

MP为底物蛋白质的总量；

h_tot为每克蛋白质中肽键的克当量数（取为8.13mmol）；

（5）反应条件的确定：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后分别与筛选的两种蛋白酶Alcalase和protease N进行酶水解反应，水解反应的温度均保持在两种蛋白酶的最适作用温度50℃；

（6）进一步纯化大米淀粉：纤维素酶的处理、超声波处理, 其中，纤维素酶的处理包括以下步骤：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后将大米浆液的pH值调至5.0，加入60 U/mL的纤维素酶反应2h，调整反应体系的pH值至10.5或8.5，加入Alcalase或protease N 100 U/mL继续反应4h，之后的处理与步骤（3）相同；超声波处理具体的为，在大米浆料中加入Alcalase或protease N之前先用超声波处理，采用50%的振幅，5s脉冲，总的作用时间为15min，之后加入Alcalase或protease N 100 U/mL反应4h后离心，处理与步骤（3）中相同；

（7）Alcalase和protease N共同水解分离大米淀粉和蛋白质：将30g大米清洗后在150mL蒸馏水中浸泡18h，打浆后进行酶水解反应，水解反应的温度保持在50℃，调整反应体系的pH值分别为9.5、10、10.5，Alcalase的加入量分别为70、100或120 U/mL（以反应液的体积记），当水解液的pH降到接近protease N的最适pH值时加入protease N，加入量取70、100或120 U/mL（以反应液的体积记），反应时间为4h，以反应起始pH值，Alcalase和protease N用量为因素，制备所得淀粉中残余蛋白的含量为指标设计L₉（3³）正交实验。

为了实现大米粉中直链淀粉含量的测定，所述步骤（2）具体包括以下步骤：

（201）准确称取20mg大米粉于具塞试管中，加入1mL DMSO于涡流混匀机混匀，加入2mL95%的乙醇振荡混匀，之后再加入4mL乙醇，混匀后静置15min，2000g，离心5min；

（202）取沉淀加入DMSO 0.2mL，沸水浴加热15min后加入2mL Con A容积，混匀后用ConA定容至5mL（此为溶液A）；

（203）取溶液A 1.0mL于2.0mL离心管中，加入0.50mL Con A溶液，多次混匀后，静置1h；

（204）取溶液A 0.5mL，加入4mL 100mmol/L pH4.5醋酸钠缓冲液，0.1mL淀粉葡萄糖苷酶、α-淀粉酶溶液，40℃下保温10min后取1.0mL，加入4mL GOPOD，40℃保温20min后于510nm测定吸光度。

其中，反应起始pH值的确定包括以下步骤：将大米浆料的pH值用1.0mol/L的NaOH溶液调至10.0、10.5和11.0，加入Alcalase 100 U/mL，反应4h后林欣，反应结束后的处理方法同步骤（3），以大米淀粉中的蛋白含量为指标确定反应的最佳起始pH值，对于proteaseN，则将起始pH值调至8.5，其余反应条件和Alcalase相同；

反应时间的确定包括以下步骤：将大米浆料的pH值用1.0mol/L的NaOH溶液调至10.5，加入100 U/mL的Alcalase蛋白酶，分别保温2/4和6h后离心，反应结束后的处理和步骤（3）相同，以大米淀粉中蛋白含量为指标确定反应的最佳时间，对于protease N，将起始pH值调至8.5，其余反应条件和Alcalase相同。

表1 不同的反应起始pH值对大米淀粉中残余蛋白量的影响

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从表1中可以看出，在起始pH10.5时，反应4h得到的大米淀粉中蛋白质的含量已降低至0.69%，与pH-Stst法的0.93%相比有所降低，蛋白酶用量从500 U/mL降低到100 U/mL，由于大米蛋白的主要蛋白组分-谷蛋白为碱溶性蛋白，因此高的pH值条件下能更有助于蛋白的溶出和水解，在保持加酶量和反应时间不变的条件下进一步提高反应的起始pH值至11.0，结果蛋白含量反而增加到0.76%，起始pH值太高，使蛋白酶一直在高于其最适pH范围内作用，效果较弱，因此，选择Alcalase自然水解的起始pH为10.5效果最好。

酶的用量直接影响其与底物结合的程度，本实验固定反应时间为4h，反应起始pH值为10.5，改变Alcalase的加入量，每毫升反应液中分别加入60、100、200或300U的酶活量，见表2；可以看出，当加酶量由60 U/mL提高到100 U/mL时，残留蛋白含量显著降低，继续提高加酶量则对残余蛋白含量的影响不大，从生产成本考虑，实验要在尽可能少的加酶量下实现最佳的水解效果，因此加酶量为100 U/mL最为适宜。

表2 不同Alcalase用来对大米淀粉中残余蛋白含量的影响

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反应时间对蛋白酶水解程度也会产生影响，一般来说，反应时间越长，得到的大米淀粉中的蛋白质含量会越低，但是反应时间长会增加成本，因此还应该确定适中的反应时间，实验分别选取2h、4h和6h作为酶解反应的时间，结果见表3，可以看出，反应时间取h最为合适，进一步延长反应时间蛋白含量的降低并不明显。

表3 不同反应时间对大米淀粉中残余蛋白含量的影响

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本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明保护范围内。