高弹水稳定型蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架及其制备方法
阅读说明：本技术 高弹水稳定型蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架及其制备方法 (High-elastic water-stable protein-based/epoxy composite superfine fiber tissue engineering scaffold and preparation method thereof ) 是由 蒋秋冉 刘璐 李冉 刘飞 江建财 杨圆 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高弹水稳定型蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架的制备方法,其特征在于,配置纺丝液,其中,纺丝液的组分包括蛋白质、环氧化合物及分散剂,依据需求还包括扩链剂；将纺丝液进行静电纺丝成支架,然后将支架依次经稳定增强后处理、封端后处理,得到高弹水稳定性蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架。所述支架包括微纳米纤维及由微纳米纤维杂乱堆砌而成的孔隙结构,孔隙率为50～70％,平均孔径为1～5μm。本发明赋予蛋白超细纤维液相的形态稳定性、弹性及弹性回复性,并有效提升蛋白超细纤维机械性能。本发明拓宽了蛋白基材料超细纤维材料的应用领域,促进复合功能型组织修复材料的开发,并可连续化生产。(The invention discloses a preparation method of a high-elasticity water-stable protein-based/epoxy composite superfine fiber tissue engineering scaffold, which is characterized by preparing a spinning solution, wherein the components of the spinning solution comprise protein, epoxy compound and a dispersing agent, and further comprise a chain extender according to requirements; and (3) performing electrostatic spinning on the spinning solution to form a bracket, and then performing stable reinforcing post-treatment and end-sealing post-treatment on the bracket in sequence to obtain the high-elasticity water-stability protein-based/epoxy composite superfine fiber tissue engineering bracket. The support comprises micro-nano fibers and a pore structure formed by randomly stacking the micro-nano fibers, the porosity is 50-70%, and the average pore diameter is 1-5 microns. The invention endows the liquid phase of the protein superfine fiber with form stability, elasticity and elastic resilience, and effectively improves the mechanical property of the protein superfine fiber. The invention widens the application field of the protein-based material superfine fiber material, promotes the development of the composite functional tissue repair material, and can realize continuous production.)
技术领域
本发明属于生物医用纺织材料及制备领域，具体说涉及一种组织工程生物材料及制备，特别是一种高弹水稳定型蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架及其制备方法。
背景技术
静电纺技术可快速、稳定地制备尺寸介于数十纳米至数微米的超细纤维，对原材料的选择范围也较广。所制备的超细纤维体系具有超高的特异性比表面积和孔隙率，该结构与天然细胞外基质(ECMs)中的三维(3D)纤维网络相似，可促进细胞的附着、迁移、增殖、分化等细胞行为，还具有高效药物吸附和运载功能。结构中相互连接的孔隙结构，有助于氧气、营养物质、细胞代谢物的转运。因此静电纺超细纤维材料在生物医用领域得到青睐。
蛋白基生物材料具有与ECMs中天然蛋白质成分相似的大分子结构，生物相容性良好，可生物降解，降解产物可代谢。蛋白质具有复杂的多级结构，在不同pH值环境下，电荷可调节，且具有亲水疏水两相性，因此表现出广泛的吸附性，可作为多种材料的载体。然而，蛋白材料的亲水特性使其在水相中的形态稳定性较低，易发生溶胀、收缩甚至溶解。静电纺制备的蛋白质超细纤维体系，在水相中的敏感度更高，相较体状、片状、海绵状、凝胶状、常规尺度纤维等形态，超细纤维结构支架的形态变形程度更大，常规稳定性处理也较难维持其形态稳定性，极大地限制了其生物医学领域的应用。
环氧化合物已被报道用于生物瓣膜的固定、制备多孔丝素支架材料等，是一种可以接受的生物改性电荷的极化和环材料。环氧化合物是指分子中含有单个、双个或多个环氧基的一类化合物，由于环氧基中氧环张力的存在，使得环氧基具有极高的反应活性，它能与蛋白质中的胺基、羧基等发生单点、双点或多点结合,产生化学修饰与交联作用。
现有的专利《一种蛋白质交联剂及其交联方法》(CN1524800)涉及环氧化合物对药用蛋白质的修饰，通过对异源蛋白的化学修饰使其避免在体内引起抗原反应，从而有效发挥治疗作用。刘侠等用乙二醇二缩水甘油醚(Ethylene Glycol Diglycidyl Ether，EGDE)处理牦牛心包，较之戊二醛固定的心包，胶原纤维的走向更富弹性，抗张强度和断裂伸长率增加，浆膜层脱落程度小，更为光滑。体内植入实验表明，撕裂程度明显较低，力学性能明显优于戊二醛改性的心包(见刘侠，乐以伦，黄嘉，石应康，程述森，安琪环氧改性与戊二醛处理的牦牛心包的扫描电镜形态比较[J].生物医学工程学杂志,1996(03):200-203+215.)。Sung等用EGDE改性猪胸动脉，得到强度为393.8±61.5g.mm-2的改性产物。经其改性的胶原变性温度、抗酶降解能力、机械强度均有提高(见Sung H-W,Hsu C-S,Wang S-P,etal.Degradation potential of biological tissues fixed with various fixatives:An in vitro study[J].Journal of Biomedical Materials Research,1997,35(2):147-55.)。以上技术有效的提高了蛋白质材料的机械性能，但均未涉及超细纤维领域，更未涉及超细纤维的形态稳定性。闵思佳等研究发现，在60℃下，环氧化合物能够与丝素蛋白发生交联反应，形成具有更高稳定性的三维网络结构(见闵思佳，田莉环氧化合物制备丝素多孔支架材料的结构性能和细胞相容性研究[D]；浙江大学,2006)。但由于所形成的凝胶交联结构较为稳定，在细胞培养中反应的环氧化合物不易浸出，使得支架材料呈现出一定的毒性。
为满足蛋白超细纤维较高的水稳定要求同时兼顾可纺性和生物相适性，本发明将高反应活性的环氧化合物体系引入富含活泼氢基团的蛋白质体系中，配合使用分散剂体系、扩链剂体系，通过静电纺丝技术和封端技术获得具有高弹性和高水稳定性的生物相容超细纤维支架。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种具有高弹性高水稳定性的生物相容蛋白超细纤维支架的制备技术，克服现有改性技术效率低、毒性大的缺陷，实现支架的高弹性、水稳定性、高机械性能、生物相适性。
为了解决上述问题，本发明提供了一种高弹水稳定型蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：配置纺丝液，其中，纺丝液的组分包括蛋白质、环氧化合物及分散剂，依据需求还包括扩链剂；
步骤2)：将纺丝液进行静电纺丝成支架，然后将支架依次经稳定增强后处理、封端后处理，得到高弹水稳定性蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架。
优选地，所述步骤1)中的蛋白质为天然蛋白质材料和合成蛋白质材料中的任意一种或几种，其分子量高于15kDa；所述环氧化合物其能与蛋白质在溶剂体系中互溶；环氧化合物与蛋白质的质量比为(1～5):10；分散剂的加入量为蛋白质质量的0.5～5％；扩链剂的加入量为蛋白质质量的0.5～5％。
更优选地，所述蛋白质为玉米醇溶蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、胶原蛋白、丝素蛋白和明胶中的任意一种或几种；环氧化合物为乙二醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚和1,4-丁二醇二缩水甘油醚中的任意一种或几种；分散剂为二乙醇胺、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和十二烷基磺酸钠中的任意一种或几种；扩链剂为甘油、1,6-己二醇、三羟甲基丙烷和二甘醇中的任意一种或几种。
优选地，所述步骤1)中的配置方法采用直接混合法，即将蛋白质、环氧化合物、分散剂和扩链剂加入到溶剂中，搅拌震荡后静置24～48h；其中，蛋白质与环氧化合物在体系中的总质量浓度为10～40％，分散剂和扩链剂的加入量均为蛋白质质量的0.5～5％。
优选地，所述步骤2)中静电纺丝的工艺参数为：静电纺电压15～20kV，湿度20～50％RH，温度15～30℃，纤维接收装置与喷丝装置的间隔距离保持10～20cm。
优选地，所述步骤2)中稳定增强后处理的温度为30～120℃，处理时间为1～6h。
优选地，所述步骤2)中封端后处理是将未反应的环氧基团与封端剂相结合而去掉反应活性的步骤，以提高复合支架的生物相容性，其中，封端剂含有活泼氢基团分子，具体为：将封端剂配置成凝固浴，浓度为25～100mg/mL，将稳定增强处理后的支架置于凝固浴中，浴比为1:40，pH值为6.5～11，将凝固浴放入恒温水浴摇床中以100r/min的速率振荡，20～75℃下处理1～4h；随后将支架置于蒸馏水中浸洗1～3次，最后将其冷冻干燥即可。
更优选地，所述封端剂为氨基酸、多肽、蛋白质、单糖、多糖、糖蛋白和类固醇中的任意一种或几种。
本发明还提供了一种上述制备方法制备的高弹水稳定型蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架，其特征在于，包括微纳米纤维及由微纳米纤维杂乱堆砌而成的孔隙结构，孔隙率为50～70％，平均孔径为1～5μm。
优选地，所述支架的湿态断裂伸长率为100～300％，弹性回复率为70～100％，收缩/溶胀率低于2％。
上述制备方法可应用到高弹水稳定型蛋白基/环氧复合超细纤维体系中。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明将环氧体系引入蛋白超细纤维体系中，该复合体系结合了环氧的活泼氢激励反应特性和蛋白基材料富含活泼氢的结构特性，从而易实现蛋白/环氧复合三维网络交联结构，构建兼具水稳定性和超高弹性回复性的蛋白超细纤维结构；
(2)本发明得到的蛋白基/环氧复合超细纤维体系具有高水稳定性和机械性能。所得的超细纤维膜湿态断裂伸长率为100～300％，弹性恢复率为70～100％，收缩/溶胀率仅为1～2％左右，是现有处理效果最佳的柠檬酸交联处理的1/3左右；
(3)本发明得到的蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架生物相容性好，并且可生物降解吸收；细胞毒性测试表明，细胞在该支架中生长良好，无毒副作用，细胞增殖是现有处理效果最佳的柠檬酸交联处理的1～2倍左右；
(4)本发明所涉及的后处理过程简单、高效；
(5)本发明制备的组织工程支架可用于关节、肌腱、肩袖、软骨等人工组织的构建，且成本低、方法简便、易重复，具有较广泛的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的制备方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
一种蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架的制备方法：
将玉米醇溶蛋白和乙二醇二缩水甘油醚以10:3的比例边搅拌边添加入75％的乙醇中，玉米醇溶蛋白和乙二醇二缩水甘油醚总质量浓度在30％。将聚乙烯吡咯烷酮加入纺丝液中，比例为玉米醇溶蛋白质量的5％，随后500rpm室温下搅拌30min至全部溶解,室温下静置24h得到玉米醇溶蛋白/乙二醇二缩水甘油醚溶液。
将纺丝液置于单针头静电纺丝装置溶液腔中，纺丝环境控制在25℃，40％RH，纤维接收装置为滚筒型接收器，转速为300r/min。距离喷丝口18cm，纺丝过程中确定了溶液注射速度为3.0mL/h，电压保持在15kV。纤维收集后，在120℃下处理1h，形成稳定的三维网络交联结构。随后进行封端处理，将超细纤维膜浸没于浓度为50mg/mL的赖氨酸的水溶液中，浴比为1:40，调节pH值到10，随后置于60℃水浴摇床中以100r/min的速率震荡1h，得到湿态断裂伸长率为260％、弹性回复率为100％、溶胀率为1.3％的玉米醇溶蛋白/乙二醇二缩水甘油醚复合超细纤维组织工程支架。
细胞实验表明该复合超细纤维组织工程支架对小鼠成纤(L929)细胞具有良好的粘附、扩散和增殖作用，可用于关节、肌腱、肩袖、软骨等人工组织的构建。
实施例2
一种蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架的制备方法：
将小麦蛋白和二甘醇二缩水甘油醚以10:3的比例边搅拌边添加入75％的乙酸中，小麦蛋白和二甘醇二缩水甘油醚总质量浓度在20％。将十二烷基磺酸钠和三羟甲基丙烷加入纺丝液中，比例分别为小麦蛋白质量的5％和1％，随后500rpm室温下搅拌30min至全部溶解,室温下静置24h得到小麦蛋白/二甘醇二缩水甘油醚溶液。
将纺丝液置于单针头静电纺丝装置溶液腔中，纺丝环境控制在25℃，50％RH，纤维接收装置为滚筒型接收器，转速为300r/min。距离喷丝口16cm，纺丝过程中确定了溶液注射速度为3.0mL/h，电压保持在15kV。纤维收集后，在90℃下处理2h，形成稳定的三维网络交联结构。随后进行封端处理，将超细纤维膜浸没于浓度75mg/mL的葡萄糖的水溶液中，浴比是1:40，调节pH值到8.5，随后置于60℃水浴摇床中以100r/min的速率震荡1h，得到湿态断裂伸长率为200％、弹性回复率为80％、溶胀率为1.6％的小麦蛋白/二甘醇二缩水甘油醚复合超细纤维组织工程支架。
细胞实验表明该复合超细纤维组织工程支架对小鼠成纤(L929)细胞具有良好的粘附、扩散和增殖作用，可用于关节、肌腱、肩袖、软骨等人工组织的构建。
实施例3
一种蛋白基/环氧复合超细纤维组织工程支架的制备方法：
将胶原蛋白和1，4-丁二醇二缩水甘油醚以10:2的比例边搅拌边添加入75％的乙醇中，胶原蛋白和1，4-丁二醇二缩水甘油醚总质量浓度在25％。将聚乙烯吡咯烷酮和甘油加入纺丝液中，比例分别为胶原蛋白质量的5％和1％，随后500rpm室温下搅拌30min至全部溶解,室温下静置32h得到胶原蛋白/1，4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。
将纺丝液置于单针头静电纺丝装置溶液腔中，纺丝环境控制在25℃，50％RH，纤维接收装置为滚筒型接收器，转速为300r/min。距离喷丝口16cm，纺丝过程中确定了溶液注射速度为3.0mL/h，电压保持在16kV。纤维收集后，在30℃下处理6h，形成稳定的三维网络交联结构。随后进行封端处理，将超细纤维膜浸没于浓度为75mg/mL的水溶性维生素C中，浴比是1:40，调节pH值到6.5，随后置于37℃水浴摇床中以100r/min的速率震荡2h，得到湿态断裂伸长率为150％、弹性回复率为100％、收缩率为1.2％的胶原蛋白/1，4-丁二醇二缩水甘油醚复合超细纤维组织工程支架。
细胞实验表明该复合超细纤维组织工程支架对小鼠成纤(L929)细胞具有良好的粘附、扩散和增殖作用，可用于关节、肌腱、肩袖、软骨等人工组织的构建。