一种mbmp2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种mbmp2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用 (MBMP2 protein composite hydrogel and preparation method and application thereof ) 是由 彭松林 陈欣 谭宝玉 唐榕泽 杨大志 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用,所述MBMP2蛋白复合水凝胶的制备原料包括明胶、琼脂糖-MBMP2复合微球和TG酶,所述制备方法包括以下步骤：(1)将明胶溶于水中,并调节pH,得到明胶溶液；(2)将步骤(1)得到的明胶溶液与琼脂糖-MBMP2复合微球混合,之后与TG酶溶液混合,孵育得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。本发明提供的MBMP2蛋白复合水凝胶稳定性好,制备工艺简单,生物安全性高,成本低,易于临床操作,可实现MBMP2长期缓释的效果。(The invention provides an MBMP2 protein composite hydrogel and a preparation method and application thereof, wherein the preparation raw materials of the MBMP2 protein composite hydrogel comprise gelatin, agarose-MBMP 2 composite microspheres and TG enzyme, and the preparation method comprises the following steps: (1) dissolving gelatin in water, and adjusting pH to obtain gelatin solution; (2) and (2) mixing the gelatin solution obtained in the step (1) with agarose-MBMP 2 composite microspheres, then mixing with a TG enzyme solution, and incubating to obtain the MBMP2 protein composite hydrogel. The MBMP2 protein composite hydrogel provided by the invention has the advantages of good stability, simple preparation process, high biological safety, low cost and easy clinical operation, and can realize the effect of long-term slow release of MBMP 2.)
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种MBMP2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用，尤其涉及一种稳定性高的MBMP2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
骨缺损的修复及骨再生仍是临床医学面临的重要难题，目前临床上对于大段骨缺损的患者主要通过自体骨移植、异体骨移植和组织工程材料移植等手段来修复和愈合。近年来，组织工程材料备受关注，可避免产生免疫排斥反应以及供体来源不足的问题，但也普遍存在生物活性低、成骨诱导能力差的弊端。因此，有效的骨组织工程需要支架材料和生物活性因子的有效结合，实现一种具有高成骨活性的微创治疗方法。
目前使用最多的生物活性因子为重组骨形态形成蛋白(BMP-2)，然而BMP-2在临床应用上存在以下问题：1)BMP-2蛋白半衰期短，容易被酶解或被体液迅速稀释；2)载体生物材料操作困难，植入时需外科手术，且无法很好地填充缺损部位，影响骨的愈合和再生；3)载体价格昂贵，生物亲和性有限，且降解过快，使BMP-2快速流失。因此，寻求经济方便且有效装载和缓释BMP-2的骨修复生物材料具有重要的临床意义。
CN109692344A公开了一种含rH-BMP2骨修复材料，包含改性的明胶以及rH-BMP2。该材料可用于骨损伤的修复。本发明的第一个目的是提供一种含rH-BMP2骨修复材料，该骨修复材料按质量百分比计由以下的成分构成：rH-BMP2 1％-5％、改性明胶60％-86％、羟基磷灰石5％-20％、氯化钙8％-15％。该含rH-BMP2骨修复材料提高了力学性能并且作为缓释载体在降解/释药时间上实现了巨大的进步，显著降低了过敏性。在体外释放实验和动物实验中均取得了显著优于壳聚糖和现有类似材料的效果。细胞毒性实验也初步证明了其安全性。但其无法做到对rH-BMP2的缓释，治疗效果快速流逝。
由于目前骨缺损的修复及骨再生仍是临床医学面临的重要难题，而目前BMP-2在临床上的应用也存在着价格高、稳定性低的问题。因此，如何提供一种稳定性高的BMP-2骨修复生物材料，成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种MBMP2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用，尤其提供一种稳定性高的MBMP2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明提供的MBMP2蛋白复合水凝胶稳定性好，制备工艺简单，生物安全性高，成本低，易于临床操作，可实现MBMP2长期缓释的效果。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶，所述MBMP2蛋白复合水凝胶的制备原料包括明胶、琼脂糖-MBMP2复合微球和TG酶。
本发明提供的MBMP2蛋白复合水凝胶可在生理条件下操作即可实现凝胶化，凝胶时间短，易于临床操作；利用琼脂糖微球和水凝胶双重释放载体，在保持其蛋白活性的同时，可实现MBMP2长期缓释的目的；制得的MBMP2蛋白复合水凝胶具有可控的三维网状结构，其孔洞致密、均匀，具有良好的粘附性能和较强的力学强度，能够实现对缺损组织的粘附和高效保留，适用于各种不规则形状的缺损填充，可高效促进材料性能的发挥，实现对缺损组织的修复。
优选地，所述琼脂糖-MBMP2复合微球由包括以下步骤的制备方法制备得到：将琼脂糖微球溶液和重组蛋白MBMP2混合，得到所述琼脂糖-MBMP2复合微球。
优选地，所述重组蛋白MBMP2由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1”)将T4L-BMP2的DNA片段扩增，之后亚克隆到载体中，得到重组质粒；
(2”)将重组质粒导入感受态细胞中，之后培养、破菌、离心、重悬、挂柱、纯化，得到所述重组蛋白MBMP2。
优选地，所述载体为pET28a表达载体。
优选地，所述感受态细胞为BL21(DE3)的感受态细胞。
优选地，所述亚克隆的位点为NdeI和BamHI位点。
所述T4L-BMP2的蛋白序列如下：
HHHHMNIFEMLRIDEGLRLKIYKDTEGYYTIGIGHLLTKSPSLNAAKSELDKAIGRNTNGVITKDEAEKLFNQDVDAAVRGILRNAKLKPVYDSLDAVRRAALINMVFOMGETGVAGFTNSLRMLQQKRWDEAAVNLAKSRWYNQTPNRAKRVITTFRTGTWDAYGGSGGSGGSGGQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVOTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR。
上述重组蛋白MBMP2通过基因工程技术设计和构建，将溶解度好且性质稳定的T4溶菌酶蛋白添加到BMP-2的氮末端，一方面增强了BMP-2蛋白自身的溶解度和稳定性，另一方面可以使得重组蛋白MBMP2通过氮端的T4溶菌酶共价连接到生物材料中以达到生长因子在长时间段的缓慢释放的效果。
优选地，所述琼脂糖微球的交联度为3-5％；
优选地，所述琼脂糖微球溶液的浓度为10-50mg/mL；
优选地，所述重组蛋白MBMP2在琼脂糖微球溶液中的浓度为2-15mg/mL；
优选地，所述将琼脂糖微球溶液和重组蛋白MBMP2混合的温度为4-8℃，时间为4-12h。
其中，交联度可以是3％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％或5％等，琼脂糖微球溶液的浓度可以是10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL等，重组蛋白MBMP2在琼脂糖微球溶液中的浓度可以是2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL或15mg/mL等，琼脂糖微球溶液和重组蛋白MBMP2混合的温度可以是4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等，时间可以是4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
上述特定琼脂糖微球生物相容性良好，粒径分布均匀，可高效结合重组蛋白BMP2C，实现缓释；同时与水凝胶协同，双重释放重组蛋白BMP2C载体，在保持其蛋白活性的同时，可实现BMP2C长期缓释的目的。
第二方面，本发明提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将明胶溶于水中，并调节pH，得到明胶溶液；
(2)将步骤(1)得到的明胶溶液与琼脂糖-MBMP2复合微球混合，之后与TG酶(转谷氨酰胺酶)溶液混合，孵育得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。
上述制备方法制备工艺简单，无需引入任何其他化学交联剂，具有良好的生物安全性，成本低。
优选地，步骤(1)所述明胶包括A型明胶。
优选地，所述明胶溶液中明胶的质量分数为10-20％。
优选地，所述明胶溶液的pH为7.5-8.5。
其中，明胶的质量分数可以是10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％等，pH可以是7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(1)所述得到明胶溶液后还包括步骤(1’)：将步骤(1)得到的明胶溶液与单宁酸混合，搅拌，得到单宁酸掺杂的明胶溶液。
优选地，步骤(1’)所述单宁酸掺杂的明胶溶液中单宁酸的质量分数为0-4％，但不包括0。
优选地，步骤(1’)所述搅拌的温度为45-55℃。
优选地，步骤(1’)所述搅拌的时间为4-10h。
其中，单宁酸的质量分数可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％等，温度可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃等，时间可以是4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(2)所述琼脂糖-MBMP2复合微球在明胶溶液中的浓度为0.5-2mg/mL。
优选地，步骤(2)所述明胶溶液与TG酶溶液的体积比为5:1-8:1。
优选地，所述孵育的温度为35-60℃，时间为0.5-5min。
其中，琼脂糖-MBMP2复合微球在单宁酸掺杂的明胶溶液中的浓度可以是0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL或2mg/mL等，明胶溶液与TG酶溶液的体积比可以是5:1、6:1、7:1或8:1等，孵育的温度可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃等，时间可以是0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min或5min等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
上述采用TG酶代替化学交联剂简化了制备工艺步骤，同时使得所述MBMP2蛋白复合水凝胶具有良好的生物安全性；同时特定条件制得的水凝胶能够与琼脂糖微球协同，双重释放重组蛋白BMP2C载体，在保持其蛋白活性的同时，可实现BMP2C长期缓释的目的。
优选地，步骤(2)所述TG酶溶液中TG酶的浓度为0.5-1mg/mL，例如0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将明胶溶于水中，并调节pH为7.5-8.5，得到质量分数10-20％的明胶溶液；
(2)将步骤(1)得到的明胶溶液与单宁酸混合，45-55℃下搅拌4-10h，得到单宁酸掺杂的明胶溶液；
(3)将步骤(2)得到的单宁酸掺杂的明胶溶液与琼脂糖-MBMP2复合微球混合，之后与TG酶溶液混合，35-60℃下孵育0.5-5min得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。
第三方面，本发明还提供了所述的MBMP2蛋白复合水凝胶在制备组织工程材料中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶，其制备方法制备工艺简单，无需引入任何其他化学交联剂，具有良好的生物安全性，成本低；制备得到的MBMP2蛋白复合水凝胶可在生理条件下操作即可实现凝胶化，凝胶时间短，易于临床操作；利用琼脂糖微球和水凝胶双重释放载体，在保持其蛋白活性的同时，可实现MBMP2长期缓释的目的；制得的MBMP2蛋白复合水凝胶具有可控的三维网状结构，其孔洞致密、均匀，具有良好的粘附性能和较强的力学强度，能够实现对缺损组织的粘附和高效保留，适用于各种不规则形状的缺损填充，可高效促进材料性能的发挥，实现对缺损组织的修复；
(2)重组蛋白MBMP2通过基因工程技术设计和构建，将溶解度好且性质稳定的T4溶菌酶蛋白添加到BMP-2的氮末端，一方面增强了BMP-2蛋白自身的溶解度和稳定性，另一方面可以使得重组蛋白MBMP2通过氮端的T4溶菌酶共价连接到生物材料中以达到生长因子在长时间段的缓慢释放的效果；
(3)采用TG酶代替化学交联剂简化了制备工艺步骤，同时使得所述MBMP2蛋白复合水凝胶具有良好的生物安全性；同时特定条件制得的水凝胶能够与琼脂糖微球协同，双重释放重组蛋白BMP2C载体，在保持其蛋白活性的同时，可实现BMP2C长期缓释的目的；
(4)采用特定琼脂糖微球，其生物相容性良好，粒径分布均匀，可高效结合重组蛋白BMP2C，实现缓释。
附图说明
图1是制备例1提供的琼脂糖-MBMP2复合微球的SEM扫描电镜照片；
图2是制备例1提供的琼脂糖-MBMP2复合微球的EDS能谱图；
图3是实施例1提供的MBMP2蛋白复合水凝胶内部微观孔洞结构的SEM扫描电镜照片；
图4是实施例1提供的MBMP2蛋白复合水凝胶的缓释效果测试结果图；
图5是对比例1提供的BMP-2蛋白复合水凝胶的缓释效果测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下制备例、实施例、对比例和效果测试中，T4L-BMP2的DNA片段由金斯瑞合成；
BMP-2、T4溶菌酶蛋白、琼脂糖微球、A型猪皮明胶、ELISA试剂盒购自于sigma。
pET28a表达载体购自于GE Healthcare；
BL21(DE3)购自于GE Healthcare。
制备例1
本制备例提供了一种琼脂糖-MBMP2复合微球，制备方法如下：
(1)质粒构建：将T4L-BMP2的DNA片段通过NdeI和BamHI位点亚克隆到pET28a表达载体中，得到MBMP2重组质粒；
(2)转化：使用BL21(DE3)的感受态细胞，并将MBMP2重组质粒导入其中，然后菌液在LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)上37℃培养过夜，转化成功的单克隆平板备用；
(3)扩大培养：在LB平板上挑出边缘整齐、半透明、表面光滑的小凸起状菌并转到5mL LB液体培养基中，37℃小摇床震荡培养4小时，然后换到800mL LB液体培养基中继续培养5小时左右，当菌液的OD600到达0.4-0.6之间时，降低培养温度至16℃并加入0.4mM的IPTG诱导剂以诱导表达目的蛋白；
(4)收菌：次日将800mL培养菌液转入收菌瓶中，15分钟5500rpm离心，弃去上清废液，收集菌体；
(5)破菌：用蛋白缓冲液20mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，0.6mM蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲基磺酰氟)悬浮菌液，通过超声细胞破碎仪将菌液超声破碎，超声破碎3个循环，整个过程将菌液放置冰上；
(6)高速离心：将超声破碎的菌液分装置离心管中，20000rpm高速离心机4℃条件下离心50分钟，收集不溶沉淀；
(7)重悬：将不溶沉淀部分重悬在缓冲液(20mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，30mM咪唑，2M尿素，0.6mM蛋白酶抑制剂PMSF)中并孵育过夜；
(8)挂柱：以20000rpm再次离心50分钟后，使用Ni-NTA柱从上清液中纯化MBMP2。将上清液加载到Ni-NTA柱上，并用40mL缓冲液(20mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，30mM咪唑，2M尿素)洗涤；
(9)纯化：在4℃下，混合蛋白上清液及Ni纯化介质，重复3遍将菌液挂在Ni柱上。然后线性折叠6-0M尿素梯度，开始用上述洗涤缓冲液洗涤，并在缓冲液B(20mM HEPES，pH7.5，500mM NaCl，30mM咪唑)处完成。使用另一种线性梯度洗脱蛋白质，起始于缓冲液B，结束于包含500mM咪唑的相同缓冲液；
(10)分子筛进一步纯化：合并含有目的蛋白的成分，浓缩后用Superdex 200体积排阻色谱柱进行进一步纯化。将纯化的MBMP2冻干并保存在-80℃下以备后用；
(11)将琼脂糖微球和MBMP2混合，琼脂糖微球的浓度为10mg/mL，MBMP2的浓度为2mg/mL，得到所述琼脂糖-MBMP2复合微球，混合温度4℃，混合时间为12h。其SEM扫描电镜照片如图1所示，EDS能谱图如图2所示。
制备例2
本制备例提供了一种琼脂糖-MBMP2复合微球，制备方法如下：
步骤(1)-(10)与制备例1一致；
(11)将琼脂糖微球和MBMP2混合，琼脂糖微球的浓度为50mg/mL，MBMP2的浓度为2mg/mL，得到所述琼脂糖-MBMP2复合微球，混合温度4℃，混合时间为4h。
制备例3
本制备例提供了一种琼脂糖-MBMP2复合微球，制备方法如下：
步骤(1)-(10)与制备例1一致；
(11)将琼脂糖微球和MBMP2混合，琼脂糖微球的浓度为50mg/mL，MBMP2的浓度为15mg/mL，得到所述琼脂糖-MBMP2复合微球，混合温度4℃，混合时间为8h。
制备例4
本制备例提供了一种琼脂糖-MBMP2复合微球，制备方法如下：
步骤(1)-(10)与制备例1一致；
(11)将琼脂糖微球和MBMP2混合，琼脂糖微球的浓度为10mg/mL，MBMP2的浓度为15mg/mL，得到所述琼脂糖-MBMP2复合微球，混合温度8℃，混合时间为10h。
对比制备例1
本制备例提供了一种琼脂糖-BMP-2混合物，制备方法如下：
将琼脂糖微球和BMP-2混合，琼脂糖微球的浓度为10mg/mL，BMP-2的浓度为2mg/mL，得到所述琼脂糖-BMP-2混合物，混合温度4℃，混合时间为12h。
实施例1
本实施例提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶，制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为20wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将单宁酸加入到步骤(1)得到的明胶溶液中，单宁酸在明胶溶液中的质量分数为2wt％，在55℃水浴中搅拌4h，制备单宁酸掺杂的明胶溶液。
(3)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为0.5mg/mL。
(4)将步骤(2)得到的单宁酸掺杂的明胶溶液和制备例1得到的琼脂糖-MBMP2复合微球混合，琼脂糖-MBMP2复合微球浓度为2mg/mL，随后加入步骤(3)得到的TG酶溶液，混合，孵育得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。单宁酸掺杂的明胶溶液和TG酶溶液体积比为5:1，孵育时间为1min，孵育温度为35℃。其内部微观孔洞结构的SEM扫描电镜照片如图3所示。
实施例2
本实施例提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶，制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为20wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将单宁酸加入到步骤(1)得到的明胶溶液中，单宁酸在明胶溶液中的质量分数为4wt％，在55℃水浴中搅拌4h，制备单宁酸掺杂的明胶溶液。
(3)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为0.5mg/mL。
(4)将步骤(2)得到的单宁酸掺杂的明胶溶液和制备例2得到的琼脂糖-MBMP2复合微球混合，琼脂糖-MBMP2复合微球浓度为0.5mg/mL，随后加入步骤(3)得到的TG酶溶液，混合，孵育得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。单宁酸掺杂的明胶溶液和TG酶溶液体积比为5:1，孵育时间为0.5min，孵育温度为37℃。
实施例3
本实施例提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶，制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为10wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将单宁酸加入到步骤(1)得到的明胶溶液中，单宁酸在明胶溶液中的质量分数为1wt％，在55℃水浴中搅拌4h，制备单宁酸掺杂的明胶溶液。
(3)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为1mg/mL。
(4)将步骤(2)得到的单宁酸掺杂的明胶溶液和制备例3得到的琼脂糖-MBMP2复合微球混合，琼脂糖-MBMP2复合微球浓度为2mg/mL，随后加入步骤(3)得到的TG酶溶液，混合，孵育得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。单宁酸掺杂的明胶溶液和TG酶溶液体积比为8:1，孵育时间为5min，孵育温度为40℃。
实施例4
本实施例提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶，制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为20wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为1mg/mL。
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和制备例1得到的琼脂糖-MBMP2复合微球混合，琼脂糖-MBMP2复合微球浓度为1mg/mL，随后加入步骤(2)得到的TG酶溶液，混合，孵育得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。明胶溶液和TG酶溶液体积比为5:1，孵育时间为5min，孵育温度为45℃。
实施例5
本实施例提供了一种MBMP2蛋白复合水凝胶，制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为20wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将单宁酸加入到步骤(1)得到的明胶溶液中，单宁酸在明胶溶液中的质量分数为4wt％，在55℃水浴中搅拌10h，制备单宁酸掺杂的明胶溶液。
(3)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为1mg/mL。
(4)将步骤(2)得到的单宁酸掺杂的明胶溶液和制备例4得到的琼脂糖-MBMP2复合微球混合，琼脂糖-MBMP2复合微球浓度为2mg/mL，随后加入步骤(3)得到的TG酶溶液，混合，孵育得到所述MBMP2蛋白复合水凝胶。单宁酸掺杂的明胶溶液和TG酶溶液体积比为5:1，孵育时间为2min，孵育温度为37℃。
对比例1
本对比例提供了一种BMP-2蛋白复合水凝胶，制备方法除将制备例1得到的琼脂糖-MBMP2复合微球替换成等量的对比制备例1得到的琼脂糖-BMP-2混合物外，其余与实施例1一致。
缓释效果测试：
将实施例1提供的MBMP2蛋白复合水凝胶和对比例1提供的BMP-2蛋白复合水凝胶各取1g分别浸泡于2mL的磷酸盐缓冲液中(pH＝7.4)，在固定的时间点取出浸提液于-80℃保存，并用同等量的磷酸盐缓冲液浸泡，时间点分别为1、3、6、11、15、18、22、27和37d，利用ELISA试剂盒测试MBMP2和BMP-2释放随时间变化情况，结果如图4-5所示。
从图中结果可以看出，本发明提供的MBMP2蛋白复合水凝胶具有优秀的MBMP2蛋白缓释效果，说明其对于骨缺损的修复及骨再生具有优秀的效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的MBMP2蛋白复合水凝胶及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
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