阅读说明：本技术 一种以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法 (Method for producing butanol by adding sodium thiosulfate into straw as raw material and fermenting ) 是由 赵海 靳艳玲 方扬 何开泽 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法,在丁醇发酵过程中向秸秆水解液中添加硫代硫酸钠即可克服发酵抑制物对丁醇发酵的不利影响,而不需要进行专门的秸秆水解液脱毒处理,并且硫代硫酸钠廉价易得,解决了现有以秸秆纤维素原料水解物为底物发酵需要进行脱毒处理去除发酵抑制物带来的工艺复杂、成本高的问题,在简化工艺,降低了成本的同时,有效提高了丁醇产率,有利于利用秸秆发酵生产丁醇的产业化发展。(The invention provides a method for producing butanol by adding sodium thiosulfate into straws as a raw material for fermentation, which can overcome the adverse effect of fermentation inhibitors on butanol fermentation by adding sodium thiosulfate into straw hydrolysate in the butanol fermentation process without carrying out special straw hydrolysate detoxification treatment, has low price and easy obtainment of sodium thiosulfate, solves the problems of complex process and high cost caused by the fact that the fermentation inhibitors need to be removed by detoxification treatment in the existing fermentation process by taking straw cellulose raw material hydrolysate as a substrate, simplifies the process, reduces the cost, effectively improves the butanol yield and is beneficial to the industrial development of butanol production by straw fermentation.)

一种以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法

技术领域

本发明属于丁醇生产领域，涉及一种以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法。

背景技术

丁醇是国际能源署认定的第二代生物燃料，作为车用燃油具有以下突出的优势：①丁醇热值比乙醇高25％，与汽油相当；②丁醇的燃点高于乙醇，使用更安全；③与乙醇相比，丁醇更易溶于汽油和柴油，而不易溶于水；④丁醇腐蚀性小，易于管道运输，可直接应用于汽车而不必改造现有发动机。鉴于以上优势，美国杜邦公司和英国石油公司已经联合投资开展了对于生物丁醇的研发工作。

鉴于粮食安全问题，以农林废弃物等木质纤维素为原料的第二代生物质液体燃料生产技术成为了目前研究的热点。丁醇生产菌不能直接利用纤维素，必须先通过预处理将纤维素原料水解成单糖等可发酵性糖。现有技术获得的纤维素水解液中总糖的浓度一般在50g/L～90g/L之间，如果直接用于生产燃料乙醇，则产物乙醇浓度过低，蒸馏成本过高，如果用浓缩的水解液生产燃料乙醇，则能量投入过高，投入产出不平衡。而这样的糖浓度正是丁醇发酵适宜的底物浓度，丁醇生产菌可以直接利用未经浓缩的纤维素水解液发酵。另外，丁醇生产菌可以代谢纤维素水解液中的五碳糖和六碳糖，与乙醇发酵酵母只能代谢纤维素水解液中的六碳糖相比，大大提高了纤维素的利用效率。综上所述，丁醇发酵特点和底物范围决定了以价廉、易得的纤维素生产丁醇具有巨大潜力。

现有利用秸秆生产丁醇的方法还存在一些较为关键而未能解决的难题。秸秆类生物质在发酵前需要进行预处理、水解，生成葡萄糖、木糖等可发酵性糖，但现有预处理、水解方法都不可避免地使木质纤维素发生部分降解，从而产生大量盐类、酸类、醛类、酚类等发酵抑制物，使发酵难以正常进行，或使发酵所得丁醇产率很低。因此，以秸秆等纤维素原料水解物为底物发酵前需要进行复杂脱毒处理，或选育、改造出抑制物耐受菌株。目前常用的脱毒方法有物理法、化学法和生物法。实际应用中单一方法常难以满足发酵需求，通常是各种方法综合利用，这样不但使生产工艺复杂化，而且明显增加了生产成本。而针对单一原料和水解工艺来源的抑制物获得的耐受菌株，对不同原料、不同预处理工艺产生的抑制物的耐受性及重组菌株的稳定性还有待评估。这些问题都限制了利用秸秆生产丁醇的产业化发展。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法，解决现有以秸秆水解物为底物发酵生产丁醇需要进行复杂的脱毒处理的问题，简化丁醇生产工艺，降低丁醇生产成本，同时提高丁醇的产率。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明通过将廉价易得的添加物硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)加入秸秆水解液来进行丁醇发酵，能简单、快速和高产率地生成丁醇，避免了复杂、高成本的秸秆水解液脱毒流程。

本发明提供的以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法，包括以下步骤：

(1)采用纤维素酶和木聚糖酶对预处理后的秸秆进行酶水解，过滤除去固态物质，得到秸秆水解液；

(2)向秸秆水解液中加入CH₃COO(NH₄)、MgSO₄、KH₂PO₄，调节pH值为7.0，过滤去沉淀，向所得清液中加入豆粕，在氮气气氛下灭菌，得到发酵培养基；

(3)在无菌条件下向发酵培养基中接入微生物种子液和混合维生素液，在37℃静止发酵66～72h即得含丁醇的发酵液，在静止发酵期间加入Na₂S₂O₃；所述微生物种子液中的菌种为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum CICC 8012)，保存于中国典型培养物中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2010148。

进一步地，在上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法的步骤(3)中，按照每1L发酵培养基中加入0.1～0.3g的比例加入Na₂S₂O₃。

更进一步地，在上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法的步骤(3)中，在静止发酵至12～15h时加入Na₂S₂O₃。

进一步地，在上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法的步骤(3)中，所述的微生物种子液的制备方法如下：按照玉米粉与水的质量比为4％～6％的比例将玉米粉与水混匀，然后煮至微沸并保持30min，补足蒸发的水分后，在氮气气氛下灭菌，得到种子培养基；向种子培养基中加入种子培养基体积5％～10％的菌种孢子液，混匀，于沸水浴中热击60s～75s，再在37℃下静止培养18～24h，即得。

进一步地，在上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法的步骤(3)中，所述的混合维生素液是将肌醇、维生素B1、维生素B6、烟酸和生物素溶解于蒸馏水中并过滤除菌得到，混合维生素液中各组分的浓度为：肌醇200mg/L，维生素B1 80mg/L，维生素B6 80mg/L，烟酸80mg/L，生物素1mg/L。

更进一步地，在上述微生物种子液的制备方法和上述维生素混合液的组成和制备方法的基础上，步骤(3)中，微生物种子液和混合维生素液的接入量分别优选为发酵培养基体积的10％和1％。

进一步地，在上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法的步骤(2)中，CH₃COO(NH₄)、MgSO₄、KH₂PO₄在秸秆水解液中的加入量依次优选为1L秸秆水解液中1g、0.2g、0.6g，豆粕在清液中的加入量优选为每1L清液中2.5g～3.5g。

进一步地，上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法中，对秸秆进行预处理的方法为：将新鲜秸秆晒干、粉碎、过筛得到秸秆粉，按照每1g秸秆粉中加入5～10mL稀硫酸的比例加入稀硫酸，在121℃静置60min，调节pH值为4.8；所述稀硫酸的体积浓度为0.5％。更进一步地，将新鲜秸秆晒干、粉碎、过50目筛得到秸秆粉。

进一步地，上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法的步骤(1)中，优先按0.2％～0.4％的体积浓度向预处理后的秸秆中加入纤维素酶，优选按0.1％～0.3％的体积浓度向预处理后的秸秆中入木聚糖酶，混匀后在55℃搅拌48～72h，过滤，即得秸秆水解液。所述的纤维素酶可以采用酶活为75±5mg protein/mL的纤维素酶(GC220)，该纤维素酶可从杰能科(中国)生物工程有限公司购买；所述的木聚糖酶可采用酶活为500FXU/mL的木聚糖酶(Shearzyme 500L)，该木聚糖酶可从诺维信(中国)生物技术有限公司购买，FXU是诺维信公司木聚糖酶酶活单位，定义为在40℃,pH＝6.0,30min的条件下，从被RemazolBrilliant Blue R染色的底物中释放出的染料的量。

进一步地，上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法的步骤(3)中，在静止发酵至9～48h期间进行间歇放气。

进一步地，上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法中所涉及的调节pH值的过程，均采用Ca(OH)₂调节pH。

进一步地，上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法中，在制备发酵培养基和制备微生物种子液过程中所涉及的灭菌操作均为高压灭菌，例如在115℃灭菌20min。

进一步地，上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法中，还可以包括从步骤(3)所得含丁醇的发酵液中分离出丁醇的步骤，采用现有的常规方法分离出发酵液中的丁醇即可。

进一步地，上述以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法中，所述的秸秆包括小麦秸秆、青稞秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆中的一种或多种的混合物。

与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：

1.本发明提供的方法在向预处理和酶水解所得秸秆水解液中添加Na₂S₂O₃基础上直接进行丁醇发酵，无需专门的脱毒步骤，解决了现有以秸秆水解物为底物发酵生产丁醇需要进行复杂的脱毒处理的问题，简化了丁醇生产工艺，降低了丁醇生产成本，同时提高了丁醇的产率。

2.本发明通过实验证实，与不添加Na₂S₂O₃的方式相比，本发明在添加Na₂S₂O₃的基础上进行丁醇发酵，可以使发酵液中丁醇的浓度提升1倍以上；与传统的树脂脱毒方式相比，本发明在添加Na₂S₂O₃的基础上进行丁醇发酵，可以得到更高的丁醇产率。说明本发明提供的方法在简化工艺，降低成本的同时，大大提高了丁醇产率。

3.本发明提供的方法适用于多种植物秸秆，针对同一来源的秸秆水解液的微生物种子液可对多种秸秆水解液成功进行丁醇发酵，无需针对特定来源或特定预处理和水解条件得到的水解液专门培育抑制物耐受菌株，大大简化了工艺，降低了成本，提高菌种的普适性，有利于利用秸秆生产丁醇的产业化发展。

4.本发明提供的方法利用秸秆进行微生物丁醇转化，在生产丁醇的同时，解决秸秆不能被合理利用而对环境造成的不利影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明提供的以秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇的方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。

下述各实施例和对比例中采用的纤维素酶是酶活为75±5mg protein/mL的纤维素酶(GC220)，购自杰能科(中国)生物工程有限公司；采用的木聚糖酶是酶活为500FXU/mL的木聚糖酶(Shearzyme 500L)，购自诺维信(中国)生物技术有限公司，FXU是诺维信公司木聚糖酶酶活单位，定义为在40℃,pH＝6.0,30min的条件下，从被Remazol Brilliant BlueR染色的底物中释放出的染料的量。

下述各实施例和对比例中采用的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicumCICC 8012)，保存于中国典型培养物中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2010148。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum CICC 8012)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，在中国工业微生物菌种保藏管理中心的保藏编号是CICC 8012。

下述各实施例和对比例中，所得发酵液中丁醇含量采用气相色谱法测定，色谱条件如下：

FID检测器，色谱柱为GDX-103，柱箱温度180℃，检测器温度200℃，进样器210℃，载气为N₂，流速30mL/min，以异丁醇为内标物，进样量1μL。

实施例1：以小麦秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵

本实施例中，采用本发明提供的方法，以小麦秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇，步骤如下：

(1)秸秆的预处理：将新鲜秸秆晒干、粉碎、过50目筛，得到秸秆粉，取30g秸秆粉放入1L三角瓶中，加入270mL体积浓度为0.5％的稀硫酸，混合均匀，在121℃下静置60min，然后用Ca(OH)₂调节pH至为4.8。

(2)预处理秸秆的酶水解：向经过步骤(1)处理的三角瓶中加入1mL纤维素酶和0.6mL木聚糖酶，混匀后在55℃、150rpm的磁力搅拌下处理72h，用中速滤纸过滤除去固态物质，得到秸秆水解液。

(3)发酵培养基的配制：取秸秆水解液200mL，加入0.2g CH₃COO(NH₄)、0.12gKH₂PO₄和0.04g MgSO₄，混匀，并用Ca(OH)₂调节pH值为7.0，过滤除去沉淀，将所得清液加入100mL厌氧瓶中，每个厌氧瓶中加入50mL过滤所得清液，向各厌氧瓶中加入0.15g豆粕粉作为发酵氮源，向厌氧瓶中充氮气去除氧气，盖好内外塞，于115℃下灭菌20min，备用。

(4)制备微生物种子液：按照玉米粉与水的质量比为5％的比例将玉米粉与水混匀，然后煮至微沸并保持30min，补足蒸发的水分后，装入厌氧管，向厌氧管中充入氮气去除氧气，盖好内外塞，于115℃灭菌20min，得到种子培养基；向种子培养基中加入种子培养基体积8％的菌种孢子液(菌种为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum CICC 8012)，保存于中国典型培养物中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2010148)，混匀，于沸水浴中热击70s，再在37℃下静止培养24h，静止培养期间已形成菌盖的培养物用做微生物种子液。

(5)丁醇发酵：在无菌条件下向步骤(3)所得发酵培养基中接入5mL步骤(4)制备的微生物种子液和0.5mL混合维生素液，于37℃静止发酵72h即得含丁醇的发酵液。在静止发酵期间，当静止发酵至12h时，按照每1L发酵培养基中加入0.25g的比例加入Na₂S₂O₃，发酵至9～48h期间在厌氧瓶上连接注射器针头，间歇放气。所述的混合维生素液是将肌醇、维生素B1、维生素B6、烟酸和生物素溶解于蒸馏水中并过滤除菌得到，在4℃保存备用；混合维生素液中各组分的浓度为：肌醇200mg/L，维生素B1 80mg/L，维生素B6 80mg/L，烟酸80mg/L，生物素1mg/L。

发酵结束时，测得发酵液中的丁醇含量5.82g/L。

对比例1：以小麦秸秆为原料的传统发酵方式

本对比例中，采用与实施例1相同的小麦秸秆作为原料，采用传统的发酵方式生产丁醇。本对比例的操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于丁醇发酵过程中不添加Na₂S₂O₃。

发酵结束时，测得发酵液中的丁醇含量2.88g/L。

实施例2：以青稞秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵

本实施例中，采用本发明提供的方法，以青稞秸秆为原料添加硫代硫酸钠发酵生产丁醇。本实施例的操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于：

1.秸秆预处理和预处理秸秆的酶水解方式：将新鲜青稞秸秆晒干、粉碎50目筛得到秸秆粉，取30g秸秆粉放入1L三角瓶中，加入300mL体积浓度为0.5％稀硫酸，混合均匀，在121℃静置60min，然后用Ca(OH)₂调节pH值为4.8，然后加入0.7mL纤维素酶和0.5mL木聚糖酶，混匀后在55℃、150rpm的磁力搅拌下处理72h。

2.在丁醇发酵步骤中，当静止发酵至12h时，按照每1L发酵培养基中加入0.2g的比例加入Na₂S₂O₃。

发酵结束时，测得发酵液中的丁醇含量4.91g/L。

对比例2：以青稞秸秆为原料的传统发酵方式

本对比例中，采用与实施例2相同的青稞秸秆作为原料，采用传统的发酵方式生产丁醇。本对比例的操作与实施例2基本相同，不同之处仅在于丁醇发酵过程中不添加Na₂S₂O₃。

发酵结束时，测得发酵液中的丁醇含量2.41g/L。

通过对比例1和实施例1，以及对比例2和实施例2的比较可知：

1.采用本发明所述方法，在丁醇发酵过程中添加Na₂S₂O₃，即可使得丁醇发酵过程顺利进行，无需采用现有技术中复杂繁琐的脱毒处理方式，也无需专门的脱毒步骤。相对于不添加Na₂S₂O₃进行丁醇发酵的方式，采用本发明的方法添加Na₂S₂O₃进行发酵，所得发酵液中丁醇的浓度提升了1倍以上，说明在丁醇发酵过程中添加Na₂S₂O₃能有效克服发酵抑制物对丁醇发酵的不利影响，在简化工艺，降低了成本的同时，大大提高了丁醇产率。

2.本发明所述方法适用于不同的种植物秸秆，同一条件下培养出的微生物种子液均在添加Na₂S₂O₃的条件下可以对不同植物秸秆顺利地进行丁醇发酵，无需针对特定来源或特定预处理及水解条件得到的水解液专门培育抑制物耐受菌株，有效简化了工艺，降低了成本，提高菌种的普适性，有利于利用秸秆生产丁醇的产业化发展。

对比例3：以小麦秸秆为原料采用树脂脱毒的发酵方式

本对比例中，采用与实施例1相同的小麦秸秆作为原料，采用树脂脱毒的脱毒方式发酵生产丁醇。本对比例的操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于：

秸秆水解液在配制发酵培养基之前，采用离子交换树脂XAD-4树脂柱脱毒，脱毒方法为：取活化、平衡后的XAD-4树脂装入直径为25mm的玻璃柱中，将秸秆水解液以6mL/min的速度流过树脂柱。

发酵结束时，测得发酵液中的丁醇含量5.25g/L。

通过比较对比例3和实施例1可知，本发明提供的方法添加Na₂S₂O₃进行丁醇发酵，与采用传统的树脂脱毒方式相比，可以得到更高的丁醇产率，并且，添加Na₂S₂O₃进行丁醇发酵，无需专门的脱毒步骤，相比于采用传统的树脂脱毒方式的操作更简单，工艺流程更短，有利于提高以秸秆为原料发酵生产丁醇的效率和产率，降低丁醇生产成本。