阅读说明：本技术 一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法及其应用 (Method for improving production conversion efficiency of erythritol and application of method ) 是由 李丽 聂在建 程保华 李德春 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法及其应用,所述方法为：以葡萄糖为原料,以酵母为发酵转化菌株,在发酵转化过程中添加蔗糖合酶和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶,从而提高从葡萄糖到赤藓糖醇的转化率。该方法操作简单,成本低,转化率的提高显著。(The invention relates to a method for improving the production conversion efficiency of erythritol and application thereof, wherein the method comprises the following steps: the method is characterized in that glucose is used as a raw material, yeast is used as a fermentation transformation strain, and sucrose synthase and cyclomaltodextrin-glucanotransferase are added in the fermentation transformation process, so that the conversion rate from glucose to erythritol is improved. The method has the advantages of simple operation, low cost and remarkable improvement of the conversion rate.)

一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种制备赤藓糖醇的方法及其应用，尤其涉及一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法及其应用。

背景技术

赤藓糖醇(也称丁四醇)是一种四元多元醇，分子量122.1Da，在很多水果蔬菜以及酿造食品中均存在(如梨、葡糖等水果以及酒类)，但含量很少。由于赤藓糖醇具有零热量、无剂量限制以及纯生物发酵制备的优点，使得赤藓糖醇在食品中的应用更加广泛，已经在糖果、烘焙食品、无糖饮料等食品中广泛使用。比如：申请号为200710014055.8的发明专利公开了一种含赤藓糖醇的夹心巧克力的制作方法；申请号为201110420379.8的发明专利公开了一种含赤藓糖醇的复合无糖饮料及其制备方法；申请号为201180012533.6的发明专利公开了一种含赤藓糖醇的糖果产品及其制备方法；申请号为201010569981.3的发明专利公开了一种含赤藓糖醇的护肝健胃保健饮料及其制造方法。

另外赤藓糖醇还可以和其它功能糖或功能糖醇搭配应用在食品中。比如：申请号为200610168838.7的发明专利公开了一种含木糖醇与赤藓糖醇的无冷却效应的无糖甜点；美国发明专利US7754268B2公开了含木糖醇与/或赤藓糖醇的烘焙食品的制作方法；申请号为201010289677.3与201010289668.4的发明专利以及美国发明专利US7579032B2都公开了一种含赤藓糖醇与塔格糖的零热量或低热量的饮料及其在食品中的用途；欧洲发明专利EP1057414B1公开了一种含赤藓糖醇与山梨醇的无糖糖果的方法。

此外，赤藓糖醇还应用在牙膏、漱口水以及化妆品领域(详见美国发明专利US8287842B2、世界发明专利WO2001074323A1、美国发明专利US20060067902A1以及美国发明专利US20060062752A1。

目前很多国家已经批准赤藓糖醇在食品上的使用。我国2008年将赤藓糖醇列为食品添加剂新品种，并于2011年制定了赤藓糖醇的国家标准(GB26404-2011)，并增加了一种合成赤藓糖醇的酵母菌株Candidalipolytica(解脂假丝酵母)，该酵母国际上现在命名为Yarrowia lipolytica(耶氏解脂酵母或亚罗威亚解脂酵母)。这一国家标准中规定的三种产赤藓糖醇的酵母分别是解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、丛梗孢酵母(Monillielapollinis)以及类丝孢酵母(Trichosporonoides megachiliensis)。

中国发明专利200610163644.8公开了生产赤藓糖醇的酵母菌株，该菌株与Moniliella acetobuten最接近，由葡萄糖转化为赤藓糖醇的效率大于30％。该菌株不符合我国制定的国家标准，不能在我国得到使用。中国发明专利ZL200510102929(授权公告号CN100506972C)公开了一种解脂假丝酵母及其生产赤藓糖醇的方法，所使用的酵母虽然为我国国家标准规定的菌株(Candida lipolytica)且已经在我国相关企业得到使用推广，但由葡萄糖合成赤藓糖醇的转化率偏低(47％)。欧洲发明专利EP0770683A1公开了一种采用Yarrowia lipolytica由葡萄糖合成赤藓糖醇的方法，但得到的最高转化率只有32.9％，转化率较低。美国发明专利US6110715公开了一种采用Trichosporonoides megachiliensis酵母能发酵葡萄糖合成赤藓糖醇，虽然该菌株符合我国国家标准，但报道的最高转化率只有35.1％，同样转化率较低而无实际使用价值。

因此，开发出一种转化率高且操作简单易行的制备赤藓糖醇的方法是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备赤藓糖醇的方法及其应用，尤其提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法为：以葡萄糖为原料，以酵母为发酵转化菌株，在发酵转化过程中添加蔗糖合酶和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶，从而提高从葡萄糖到赤藓糖醇的转化率。

本发明人意外地发现向发酵体系中添加蔗糖合酶(EC2.4.1.13)和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶(EC2.4.1.19)能够对赤藓糖醇的转化率有明显提高的效果，转化率可提高至51％及以上。且蔗糖合酶(EC2.4.1.13)和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶(EC2.4.1.19)需要同时添加。

优选地，所述酵母包括解脂假丝酵母、丛梗孢酵母或类丝孢酵母，优选解脂假丝酵母。

优选地，所述蔗糖合酶的添加浓度为100-500000U，例如100U、200U、500U、800U、1000U、5000U、8000U、10000U、50000U、100000U、200000U、300000U或500000U等。

优选地，所述环麦芽糊精-葡聚糖转移酶的添加浓度为1000-500000U，例如1000U、5000U、8000U、10000U、50000U、100000U、200000U、300000U或500000U等。

本发明对所述蔗糖合酶和所述环麦芽糊精-葡聚糖转移酶的添加浓度不做特别限定，但出于对制造成本的考虑，优选蔗糖合酶的添加浓度为100-500000U，环麦芽糊精-葡聚糖转移酶的添加浓度为1000-500000U。

优选地，所述提高赤藓糖醇生产转化效率的方法包括如下步骤：

(1)将酵母菌接种于发酵培养基中进行培养发酵；

(2)再转入生产发酵培养基中进行赤藓糖醇的转化。

优选地，步骤(1)所述接种前将发酵培养基在80-90℃(例如80℃、82℃、83℃、84℃、86℃、88℃或90℃等)的温度下处理20-40min(例如20min、22min、25min、30min、35min或40min等)，冷却后再接入酵母菌进行发酵培养。

优选地，步骤(1)所述发酵培养基包括碳源100-400g/L、氮源2-35g/L、无机盐0-2.5g/L和水。

所述碳源的浓度可以为100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L或400g/L等。

所述氮源的浓度可以为2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L或35g/L等。

所述无机盐的浓度可以为0g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L或2.5g/L等。

优选地，步骤(1)所述发酵培养基包括淀粉水解液、磷酸氢二铵、酵母粉、玉米浆干粉、硫酸镁、硫酸锰、氯化锰、硫酸铜、氯化铜、硫酸锌和氯化锌。其中，淀粉水解液为碳源，磷酸氢二铵、酵母粉和玉米浆干粉为氮源，硫酸镁、硫酸锰、氯化锰、硫酸铜、氯化铜、硫酸锌和氯化锌为无机盐成分。

优选地，步骤(1)所述培养发酵的初始温度为25-35℃，例如25℃、27℃、29℃、30℃、32℃、34℃或35℃等。

优选地，步骤(1)所述培养发酵的初始pH值为5.0-7.0(例如pH＝5.0、pH＝5.5、pH＝6.0或pH＝7.0等)，待发酵至细胞密度OD600值为20及以上时，调节pH值为3.1-4.0(例如pH＝3.1、pH＝3.5、pH＝3.8或pH＝4.0等)。

优选地，步骤(1)所述培养发酵包括一级培养和二级扩大培养。

所述一级培养可以在摇瓶中进行，二级培养在小型发酵罐(体积250L或以下体积)中进行。

优选地，步骤(2)所述生产发酵培养基包括碳源100-400g/L、氮源2-35g/L、无机盐0-2.5g/L和水。

所述碳源的浓度可以为100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L或400g/L等。

所述氮源的浓度可以为2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L或35g/L等。

所述无机盐的浓度可以为0g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L或2.5g/L等。

优选地，步骤(2)所述生产发酵培养基包括淀粉水解液、磷酸氢二铵、酵母粉、玉米浆干粉、硫酸镁、硫酸锰、氯化锰、硫酸铜、氯化铜、硫酸锌和氯化锌。

优选地，步骤(2)所述转化过程中向生产发酵培养基中加入葡萄糖、蔗糖合酶和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶。

优选地，所述葡萄糖的浓度为500-600g/L。

所述发酵培养基和生产发酵培养基的主体成分相同，区别仅在于生产发酵培养基中补入了高糖培养基组分即葡萄糖和提高转化率组分即蔗糖合酶和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶。

更优选地，步骤(2)所述转化结束后对赤藓糖醇进行提纯，得到赤藓糖醇晶体。

优选地，所述提纯包括过滤除菌、浓缩和结晶。

所述过滤除菌具体为：发酵结束后通过离心或者陶瓷膜过滤的方法将酵母细胞与发酵液分离，再通过纳滤膜分离去除所述发酵液中的分子量大于1000Da的大分子粘性物质，得清澈透明的发酵液。

所述浓缩具体为：将所述清澈的发酵液在蒸发器中浓缩到固形物含量为50-80％(质量体积百分比)，得富含赤藓糖醇的糖浆。

所述结晶具体为：将所述富含赤藓糖醇的糖浆以1-5℃/h的速率冷却至10℃以下，赤藓糖醇开始结晶，离心分离，即得赤藓糖醇粗制晶体。

作为本发明的优选技术方案，所述提高赤藓糖醇生产转化效率的方法包括如下步骤：

(1)将发酵培养基在80-90℃的温度下处理20-40min，冷却后将酵母菌接种于发酵培养基中进行培养，初始温度为25-35℃，初始pH值为5.0-7.0，待发酵至细胞密度OD600值为20及以上时，调节pH值为3.1-4.0；

(2)再转入生产发酵培养基中进行赤藓糖醇的转化，在转化过程中补入葡萄糖、蔗糖合酶和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶。

(3)发酵结束后经过滤除菌、浓缩、结晶，即得赤藓糖醇晶体。

另一方面，本发明提供一种如上所述的提高赤藓糖醇生产转化效率的方法在利用生物法制备赤藓糖醇中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明人意外地发现在以生物法制备赤藓糖醇的过程中，向发酵体系中添加蔗糖合酶(EC2.4.1.13)和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶(EC2.4.1.19)能够对赤藓糖醇的转化率有明显提高的效果，转化率可提高至51％及以上。且蔗糖合酶(EC2.4.1.13)和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶(EC2.4.1.19)需要同时添加。该方法操作简单，成本低，转化率的提高显著。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

下述各实施例中涉及的赤藓糖醇转化率为赤藓糖醇粗制晶体质量与葡萄糖质量之比值。

实施例1

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法如下：

(1)将发酵培养基在80℃的温度下处理40min，冷却后将解脂亚罗酵母菌株接种于发酵培养基中进行培养，初始温度为30℃，初始pH值为6.0，待发酵至细胞密度OD600值为20时，调节pH值为3.7；所述发酵培养基的配方为：淀粉水解液300g/L、磷酸氢二铵5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆干粉15g/L、硫酸镁0.25g/L、硫酸锰0.25g/L、氯化锰0.25g/L、硫酸铜0.25g/L、氯化铜0.25g/L、硫酸锌0.25g/L、氯化锌0.25g/L。

(2)经过二级扩大培养后，再转入生产发酵培养基中进行赤藓糖醇的转化，生产发酵培养基与发酵培养基成分相同，在转化过程中补入葡萄糖500g/L、蔗糖合酶50000U/L和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶50000U/L。

(3)发酵结束后经过滤除菌、浓缩、结晶，得赤藓糖醇晶体306g。赤藓糖醇的转化率为61.2％。

实施例2

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法如下：

(1)将发酵培养基在90℃的温度下处理20min，冷却后将解脂亚罗酵母菌株接种于发酵培养基中进行培养，初始温度为25℃，初始pH值为5.0，待发酵至细胞密度OD600值为20时，调节pH值为3.1；所述发酵培养基的配方为：淀粉水解液200g/L、磷酸氢二铵15g/L、酵母粉2g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸镁0.10g/L、硫酸锰0.5g/L、氯化锰0.10g/L、硫酸铜0.10g/L、氯化铜1.0g/L、硫酸锌0.25g/L、氯化锌0.25g/L。

(2)经过二级扩大培养后，再转入生产发酵培养基中进行赤藓糖醇的转化，生产发酵培养基与发酵培养基成分相同，在转化过程中补入葡萄糖500g/L、蔗糖合酶100U/L和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶1000U/L。

(3)发酵结束后经过滤除菌、浓缩、结晶，得赤藓糖醇晶体255g。赤藓糖醇的转化率为51％。

实施例3

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例2的区别仅在于步骤(2)中环麦芽糊精-葡聚糖转移酶的添加浓度为50000U/L，其他条件保持不变。赤藓糖醇的转化率为61.1％。

实施例4

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例2的区别仅在于步骤(2)中蔗糖合酶的添加浓度为50000U/L，其他条件保持不变。赤藓糖醇的转化率为60.2％。

对比例1

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中不添加蔗糖合酶和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶，其他条件保持不变。赤藓糖醇的转化率为44.8％。

对比例2

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中蔗糖合酶的添加浓度为1000U/L、不添加环麦芽糊精-葡聚糖转移酶，其他条件保持不变。赤藓糖醇的转化率为46.1％。

对比例3

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中蔗糖合酶的添加浓度为10000U/L、不添加环麦芽糊精-葡聚糖转移酶，其他条件保持不变。赤藓糖醇的转化率为45.5％。

对比例4

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中环麦芽糊精-葡聚糖转移酶的添加浓度为1000U/L、不添加蔗糖合酶，其他条件保持不变。赤藓糖醇的转化率为44.4％。

对比例5

本实施例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中环麦芽糊精-葡聚糖转移酶的添加浓度为50000U/L、不添加蔗糖合酶，其他条件保持不变。赤藓糖醇的转化率为46.3％。

由上述实施例和对比例的数据结果可知：本发明利用生物法即以葡萄糖为原料，以酵母为发酵转化菌株，来制备赤藓糖醇，通过在发酵转化过程中同时添加蔗糖合酶和环麦芽糊精-葡聚糖转移酶，能使从葡萄糖到赤藓糖醇的转化率显著提高，且单一添加蔗糖合酶或环麦芽糊精-葡聚糖转移酶不能使转化率提高。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。