阅读说明：本技术 一种测定多花梾木耐盐能力的方法 (Method for determining salt tolerance of cornus floribunda ) 是由 孙杰 周余华 王莹 张文煊 王红梅 张虎 钱银震 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速测定多花梾木耐盐能力的方法,包括：选择植株高度、生长势一致的二年生多花梾木实生苗；选择通风、透光、没有遮挡的高燥处作为测量场地；测量前一天给植株浇充足的水,使苗木基质处于饱和状态后加入5个梯度的盐分；测量时间选在12-14时；采样：采用单因子完全随机设计方法对多花梾木叶片进行采样；测量：分别进行含水量的测定、叶片色差测定、光谱测定、植物效率测定、渗透调节物质和丙二醛含量测定；对测定结果进行数据统计分析,获得各指标与多花梾木耐盐能力之间的关系。该方法测量准确性高；可以准确获得不同盐分给植物带来的不同状态；对植物在盐碱状态下,能将植株器官的变化与植物生理的变化有效结合。(The invention discloses a method for rapidly determining salt tolerance of cornus floribunda, which comprises the following steps of: selecting biennial flowering dogwood seedlings with consistent plant height and growth vigor; selecting a ventilated, light-transmitting and unshielded high-dryness part as a measurement field; watering sufficient water to the plants one day before measurement, and adding 5 gradient salts after the seedling matrix is in a saturated state; the measurement time is 12-14 hours; sampling: sampling the cornus floridulus leaves by adopting a single-factor completely random design method; measurement: respectively carrying out determination of water content, determination of leaf color difference, spectral determination, determination of plant efficiency and determination of contents of osmosis regulating substances and malonaldehyde; and performing data statistical analysis on the measurement result to obtain the relation between each index and the salt tolerance of the cornus floribunda. The method has high measurement accuracy; different states brought by different salts to the plants can be accurately obtained; the change of plant organs and the change of plant physiology can be effectively combined under the saline-alkaline state of plants.)

一种测定多花梾木耐盐能力的方法

技术领域

本发明涉及多花梾木种植技术领域，特别涉及一种测定多花梾木耐盐能力的方法。

背景技术

目前，国内多花梾木的盐胁迫研究较少，其他植物盐胁迫研究较多。徐晨等的研究表明，盐胁迫下水稻地上与根系的干鲜质量均呈下降趋势[徐晨；凌风楼；徐克章等.盐胁迫对不同水稻品种光合特性和生理生化特性的影响[J].中国水稻科学，2013，v.27；No.124，61-67]。冯帆等的西伯利亚白刺耐盐实验发现，西伯利亚白刺叶片内有机物在盐胁迫下会提供给植物较高的逆境抵抗力[冯帆；杨秀清；闫海冰.基于代谢组学的西伯利亚白刺耐盐机理研究[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2019，94-100]。章华婷等的夏腊梅盐胁迫实验中，结果表明盐胁迫下，夏腊梅幼苗各部位的生长量均抑制，程度随盐浓度的增加而增加[章华婷；金则新；赵喆等.盐胁迫对濒危植物夏蜡梅生长及光合生理特性的影响[J].江苏农业科学，2019，1-5]。

多花梾木属于新引进物种，还没有多少实验研究过，对其生理特性以及适应环境属于探索阶段。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种测量准确性高、操作简便的测定多花梾木耐盐能力的方法。

技术方案：本发明提供一种测定多花梾木耐盐能力的方法，包括如下步骤：

(1)选择材料：选择植株高度、生长势一致的二年生多花梾木实生苗；

(2)选择场地：选择通风、透光、没有遮挡的高燥处作为测量场地；

(3)测量前处理：测量前一天浇足水，使苗木基质处于饱和水状态，实生苗5-10株为一组，共5个梯度：0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％，3个重复进行盐胁迫试验；

(4)测量时间：测量时间选在12-14时；

(5)采样：采用单因子随机设计方法对多花梾木叶片进行采样；

(6)测量：分别进行含水量的测定、叶片色差测定、光谱测定、植物效率测定、渗透调节物质和丙二醛含量测定；

(7)对步骤(6)的测定结果进行数据统计分析，获得含水量、叶片色差、植物效率、光谱、渗透调节物质和丙二醛含量与多花梾木耐盐能力之间的关系。

进一步地，所述步骤(6)中含水量的测定的方法为：测定三个指标：叶片的鲜重、叶片浸泡6小时后的饱和重和使用烘箱烘烤12小时后的干重，计算出叶片在不同盐分下的含水量变化。

进一步地，所述步骤(6)中叶片色差测定的方法为：使用分光测色仪测定植株中部叶片的叶色。

进一步地，所述步骤(6)中光谱测定的方法为：从测量开始直到植株叶片掉落无法采样为止，期间每5天进行一次测量，在12-14时进行叶绿素含量的测量，并分析叶绿素含量的变化。

进一步地，所述步骤(6)植物效率测定的方法为：在每盆多花梾木实生苗中部选取叶片，做好标记作为每次测定的样品，夹上叶夹，闭合金属片无光封闭20min进行暗处理，处理完毕后用仪器的探头连接叶夹测定叶片，数据保存至荧光仪后，导入电脑中用荧光仪分析软件Pea Plus进行数据处理。

进一步地，所述步骤(6)中渗透调节物质为脯氨酸或可溶性总糖。

进一步地，所述步骤(6)中采用硫代巴比妥酸法来测定可溶性总糖。

进一步地，所述步骤(6)中测量时对叶片进行拍照，记录叶片的形态和颜色变化，并记录测定时的天气状况。

本发明设计的盐浓度梯度跨度略大。多花梾木在1％盐浓度梯度以上无法生存的情况说明本实验不能准确说明不同梯度下盐碱给植物带来的状态，亟待设计适宜盐浓度梯度继续探索实验，本发明将盐的浓度设计为0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％，最终通过测量和分析获得不同梯度的盐分给植物带来的状态。

有益效果：本发明的测量准确性高；可以准确通过测量和分析获得不同梯度的盐分给植物带来的状态；对各项指标的的测定较简单，也准确；对植物在盐胁迫的状态下，能将植株器官的变化与植物生理的变化有效结合。

附图说明

图1为本发明温度的变化图；

图2为本发明盐胁迫下水分的变化图；

图3为本发明盐胁迫下叶片的形色变化图；

图4为本发明盐胁迫下0.1％盐浓度色差变化图；

图5为本发明盐胁迫下0.5％盐浓度色差变化图；

图6为本发明盐胁迫下1％盐浓度色差变化图；

图7为本发明盐胁迫下1.5％盐浓度色差变化图；

图8为本发明盐胁迫下2％盐浓度色差变化图；

图9为本发明盐胁迫下ΔE*ab的变化图；

图10为本发明盐胁迫下初始荧光的变化图；

图11为本发明盐胁迫下最大荧光的变化图；

图12为本发明盐胁迫下Fv/Fm的变化图；

图13为本发明盐胁迫下Fv/F0的变化图；

图14为本发明盐胁迫下R800/R700、R800/R640的变化图；

图15为本发明盐胁迫下MDA含量的变化图；

图16为本发明盐胁迫下可溶性总糖含量的变化图；

图17为本发明盐胁迫下可溶性蛋白的变化图。

具体实施方式

本实施例的一种测定多花梾木耐盐能力的方法，包括如下步骤：

(1)选择材料：选择植株高度、生长势一致的二年生多花梾木实生苗；

(2)选择场地：选择通风、透光、没有遮挡的高燥处作为测量场地；

(3)测量前处理：测量前一天浇足水，使苗木基质处于饱和水状态，实生苗5株为一组，共5个梯度：0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％，3个重复进行盐胁迫试验；

(4)测量时间：测量时间选在12-14时；

(5)采样：采用单因子随机设计方法对多花梾木叶片进行采样；

(6)测量：分别进行含水量的测定、叶片色差测定、植物效率测定、光谱测定、渗透调节物质和丙二醛含量测定；

其中，

含水量的测定：

将刚采集的多花梾木叶片立即至于无菌水中浸泡5h到6h，浸泡结束后擦干叶片表面的水，放入蒸发皿中。打开烘箱预热，待温度到达100℃时，放入蒸发皿，杀青半h后将温度调至80℃，烘12h。取出称重并及时记录。

叶片色差测定：

打开分光测色仪，状态设置，零校正、白板校正，最后确认人工校正开始测量，仪器通光控抵住叶片不能漏光，按下测量键，保存数据。

光谱测定：

从测量开始直到植株叶片掉落无法采样为止，期间每5天进行一次测量，在12-14时进行叶绿素含量的测量，并分析叶绿素含量的变化。

连接好设备通光管并开机，夹好白板调试设备至测定阶段后取下白板，注意不能漏光，在做好标记的多花梾木实生苗中部进行测定，夹住叶片注意不能夹到叶脉，测定结束后保存数据至SD卡内，最后保存至电脑。

试验开始后，分别于0d、5d、10d、15d等，直到植株叶片掉落无法采样为止。用PPSYSTEMS Unispec-SC光谱分析仪(型号)测定植株中部叶片光合速率和蒸腾速率，同时采集新鲜叶片样品供各项生理指标测定。

植物效率测定：

在每盆多花梾木实生苗中部选取叶片，做好标记作为每次测定的样品。使用荧光仪Handy PEA来测定植物效率，使用时先用叶夹夹住中部选好的叶片，注意不能夹到叶脉，闭合金属片无光封闭20min，打开荧光仪接口嵌入叶片夹，打开金属片测定数据，数据保存至荧光仪后，导入电脑中用荧光仪分析软件Pea Plus进行数据处理。

渗透调节物质和丙二醛(MDA)含量测定：

丙二醛(MDA)含量和可溶性糖含量用硫代巴比妥酸法测定，按公式计算丙二醛含量和可溶性糖含量；可溶性蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定，在标准曲线上查得可溶性蛋白含量。

(7)对步骤(6)的测定结果进行数据统计分析，获得含水量、叶片色差、光谱、植物效率、渗透调节物质和丙二醛含量与多花梾木耐盐能力之间的关系。

结果分析：

1、盐胁迫对叶片含水量的影响

由图2可看出，因盐浓度原因，第一梯度剩余叶片较多，第二、三、四、五梯度叶片实验前中期近乎脱落光，无法达到测量条件。第一梯度叶片相对含水量波动在66％～95％之间，幅度略大。11月03日达到最低点，可能因为气温高，叶片蒸腾速率加快。到了11月09日有小幅度上升，可能是多花梾木提高有机物含量为抵抗盐胁迫。第三、四、五梯度从80％多直线下降到40％，下降了自身含水量的1/2，表明盐浓度过高，多花梾木叶片生理活性被破坏，导致失水。实验每5d一次，保持每天湿度一样，土壤湿润，盆内不积水。总的来说，叶片相对含水量正常，因天气、光照原因有所波动。

2、盐胁迫对叶片色差的影响

从实验第一天起，选取一盆多花梾木实生苗中部叶片，拍下叶片形态。此后每次实验都拍该叶片形态，直到叶片自然脱落。不同色素会呈现出不同颜色：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色。从图3可以看出，随着多花梾木盐胁迫实验时间的延长，叶片在盐分的侵害下由绿色逐渐变枯黄，最后变红褐色，生理机能遭到破坏，不能进行光合作用、呼吸作用及合成有机物，叶片形态逐渐萎缩褶皱，直至掉落。可见过量盐分使植物生理和形态失水，致使植物生长不良或死亡。

L，a，b色可以测量出任何植物的颜色，本试验利用ΔL，Δa，Δb以及ΔE*ab的数值来对比色差值。

ΔE*ab表示总色差，色差随着数值增加而变大。ΔL正负值分别表示测试样比标准样的颜色白或黑；Δa正值则表示叶片红的程度，负值表示绿的程度；Δb正值表示叶片黄的程度，负值表示叶片蓝的程度。

图4可以看出，0.1％梯度中ΔL的值从10月07日至11月19日呈上升趋势，上升了30，在10月23日至10月29日、11月14日至11月19日上升幅度较大，分别上升了66.6％、63.1％，可能当天日照强度较高，叶片显示较亮。Δa与Δb从10月07日至10月12日分别上升了40％和75％，说明多花梾木叶片在盐胁迫下逐渐变枯黄，甚至红褐色。但在10月12日至11月19日，Δa与Δb呈平缓下降趋势，说明多花梾木为抵抗盐害自我调节，慢慢适应了0.1％盐浓度。

由图5可以看出，0.5％梯度中ΔL与Δa呈直线上升趋势，分别上升了300％、366％，表明多花梾木叶片正由绿逐渐变红；Δb呈缓慢下降趋势，下降了25％，说明叶色稍微变蓝。1％、1.5％、2％因为盐浓度过高，叶片脱落无法实验。

图9可以看出，第二、三、四、五梯度，ΔE*ab的值为正，多花梾木实生苗叶片在盐害的侵袭下植物叶片颜色差距变大。第一梯度在10月07日至10月12日虽呈下降趋势，下降了16.43，但值仍然是正数，10月12日以后呈波动上升趋势，上升了27.65，结果表明多花梾木叶片在盐胁迫下色差随时间变化而变大，叶片色差逐渐增大，盐害下植物叶片会失活，干枯直至脱落。

3、盐胁迫胁迫对荧光参数的影响

F0：固定荧光，初始荧光，也称基础荧光，它与叶片叶绿素浓度有关，是光系统II(PSII)反应中心处于完全开放时的荧光产量。从图10中可以明显的看出，第一梯度从10月02日到10月29日上下波动，幅度在400至700之间，应该是受到了光照的影响；从10月29日往后便平稳下来，只有小幅度下降，表明多花梾木在盐胁迫下叶色的变化导致了Fo的降低。其余四个梯度大多前3次实验Fo便呈下降趋势，从12日往后则因盐胁迫叶片枯黄脱落，无法测量。

Fm：最大荧光产量，是PS II反应中心处于彻底关闭时的荧光产量，暗处理20min可得。图11可以清晰看出5个梯度从10月02日至10月7日Fm呈大幅度下降趋势，下降了83.3％。第一次实验是5个梯度中Fm最大的一次，结果表明盐胁迫会抑制多花梾木的生长。10月12日至10月29日呈下凹的趋势，表明多花梾木在盐胁迫下自身调节，抵抗盐害。自11月29日往后便呈平缓下降趋势，大概每次实验下降13.3％，表明植物机理已抵挡不住盐害。

Fv/Fm是PS II最大光化学量子产量，叶片暗处理20min后测得。正常植物的Fv/Fm值为0.7-0.8左右，具体数值因植物品种而言。该值越高，说明植物遭到的胁迫状态越低，健康状态越好；该值越低，说明植物的光合作用受到影响，处于较强的胁迫下，健康状况越差。Fv/Fo代表PS II的潜在活性，光抑制条件下Fv的降低主要是由于Fm的降低，不是Fo增加的结果。

图12明显看出，第二、三、四、五梯度呈下降趋势，降低了近100％，表明盐胁迫对多花梾木的生长有很大抑制作用，同时破坏了多花梾木的光合机能，阻碍光合作用。第一梯度从10月02日至10月17日上下波动，幅度不大；10月23日至11月03日呈上升趋势，上升了64.9％，可能是多花梾木为抵抗盐害做出的防卫机制，使光能转化率提升，从而进行光合作用维持生理平衡；自11月03日以后便呈下降趋势，到11月19日下降了51.2％，这种情况应该是多花梾木生理机能已被盐胁迫完全破坏，多花梾木正逐渐死亡。

由图13可知，第二、三、四、五梯度同Fv/Fm同步，都处于下降趋势，下降了近100％。而第一梯度全程波动很小，在0.71至2.04间；从10月07日至10月23日，从11月03日至11月19日均呈下降趋势，期间11月23日至11月03日有中幅度回升，上升了65％，可能与当天日照强度有关，日照强烈，Fv/Fo便回升。

4、盐胁迫对叶绿素含量的影响

叶绿素是高等植物和其他所有能进行光合作用的生物体含有的一类绿色色素，光合作用中各个反应与叶绿素有着紧密的联系。由图14可看出绝大部分实验R800/R640、R800/R700变化平缓，11月14日R800/R640的值呈上升趋势，上升了24％；11月14日后下降幅度较大，可能是盐胁迫下多花梾木光合结构被破坏。R800/R640、R800/R700的值与叶绿素含量为正相关。实验结果表明，盐胁迫下多花梾木叶绿素会少量增加，但随着实验时间的增长，最终会抑制多花梾木的生长，叶绿素含量会减少。实验表明，盐胁迫能明显降低植物的光合速率，抑制光合作用的进行。

5、盐胁迫对渗透调节物质和丙二醛含量的影响

MDA是细胞膜脂过氧化的产物，其含量的高低可表示植物受胁迫伤害的程度。在多花梾木盐胁迫中，测定生理因子会更直观研究植物。图15清晰的显示，随着实验时间延长，多花梾木盐胁迫下叶片MDA含量呈上升趋势，上升了近4.4倍。t5至t6呈上升趋势，t6至t7呈下降趋势，幅度分别为65％和22％，可能因为多花梾木在盐胁迫下产生有机物抵抗，减小了受害程度。t7后便抵抗不住，随时间延长受害程度逐渐增加。

可溶性糖是一种重要的渗透调节物质，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖等，植物在逆境胁迫下会产生，以此来抵抗，减小受害程度。图16表明，盐胁迫下叶片总体呈下降趋势，在t2至t3、t7至t8出有小段上升趋势，分别上升了17.1％、9.7％，结果表明在这两段期间，多花梾木叶片在盐胁迫下，产生较多可溶性糖来抵抗盐害，减轻受害程度。

盐胁迫下，植物细胞内蛋白质合成代谢增强，耐盐性强的植物随盐浓度的提高，可溶性蛋白的含量也随之增加。可溶性蛋白亲水性较强，其含量越高，说明胁迫对植物造成伤害越小，反之越大。从图17可明显看出，t1至t2、t4至t5呈下降趋势，分别下降了20.9％、56.2％，t4至t5下降的略大，其余阶段都处在上升趋势。表明多花梾木叶片在盐胁迫下增加了可溶性蛋白的含量，以此减少伤害，抵抗盐害。

6、综上所述

本研究发现，随着盐胁迫实验时间的延长，多花梾木的叶片由绿色变枯黄直至红褐色，表明盐胁迫对其叶片的生理结构造成了影响。叶片Fo、Fm的值也在呈平缓下降趋势，同样Fv/Fm、Fv/Fm的值也在下降，表明盐胁迫下多花梾木叶片的生理机能被破坏，光合作用被抑制。盐抑制了植物的生长，Fv/Fm、PS II降低，耐盐性与非光化学猝灭过程相关。MDA、可溶性糖、可溶性蛋白的含量均升高，说明盐胁迫下多花梾木的叶片为抵抗盐害自我调节，增加有机物含量，减少伤害。

本实验进行了49d，盐胁迫对多花梾木生理的影响是一个十分复杂的过程，本实验只分析了其中5个指标。研究表明，随着NaCl浓度的提高，多花梾木实生苗生理受到的抑制呈上升趋势，存活率呈降低趋势，结果表明随着时间的延长，盐胁迫下多花梾木实生苗受到的伤害程度逐渐增大，最终直至叶片全部萎蔫、枯黄、脱落。实验表明，作为新引进的树种，多花梾木具有一定的抗盐性，能够适应短时间低浓度的盐胁迫，然而长期高浓度盐胁迫会对其造成严重伤害。在0.5％及以上的盐浓度，对多花梾木的植物机理伤害程度愈来愈大，较小盐浓度0.1％时，多花梾木可抵挡盐胁迫带来的伤害并适应。

在上述试验中，多花梾木的各项生理指标变化表明，在持续盐胁迫下，多花梾木叶片不断受到伤害。其中RWC(叶片相对含水量)、F_m、F_v/F₀以及F_v/F_m在不断下降，而F₀、可溶性糖和Pro以及丙二醛含量呈上升趋势。