阅读说明：本技术 一种以角蛋白1作为预测和检测人体组织炎症的生物标志物的方法及其应用 (Method for predicting and detecting human tissue inflammation by using keratin 1 and application thereof ) 是由 殷卫海 张铭超 李雨嘉 于 2018-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于检测皮肤角蛋白1的变化,从而预测或检测人体组织炎症的方法。本发明以角蛋白1作为预测和检测人体组织炎症的生物标志物的方法,包括以下步骤：(1)检测受试者的皮肤组织中的角蛋白1的含量、结构中的至少一种；(2)检测健康人群皮肤组织中的角蛋白1的含量、结构中的至少一种；(3)将步骤(1)和步骤(2)中获得的角蛋白1的含量、结构相对比,计算相应的变化率；(4)根据所述变化率,诊断或预测所述受试者的组织炎症严重程度。皮肤在受到因为外界刺激而造成的炎症反应后,其角蛋白1结构或含量会发生变化,这种变化与组织炎症的严重程度呈正相关。(The invention provides a method for predicting or detecting human tissue inflammation based on detecting changes in skin keratin 1. The invention relates to a method for predicting and detecting human tissue inflammation biomarker by using keratin 1, which comprises the following steps: (1) detecting at least one of keratin 1 content, structure in skin tissue of a subject; (2) detecting at least one of the content and the structure of keratin 1 in skin tissues of healthy people; (3) comparing the content and the structure of the keratin 1 obtained in the step (1) with those obtained in the step (2), and calculating the corresponding change rate; (4) diagnosing or predicting the severity of tissue inflammation in the subject based on the rate of change. After the skin is subjected to inflammatory reaction caused by external stimulation, the keratin 1 structure or content of the skin can be changed, and the change is in positive correlation with the severity of tissue inflammation.)

一种以角蛋白1作为预测和检测人体组织炎症的生物标志物 的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测皮肤组织组织炎症的生物标志物，具体是以角蛋白1作为预测和检测组织炎症的检测方法及其应用。

背景技术

目前检测组织炎症的方法普遍通过验血。这种方法的准确性以及对于不同组织炎症的区分程度有限。所以寻找一种实时无创快速检测组织炎症的生物学指标变得非常重要，而且也具有重大的社会经济意义以及临床意义。

发明内容

本发明人发现，可以使用皮肤组织的角蛋白1作为检测和预测组织炎症检测方法的新型生物标志物。从而提出一种可以用于基于角蛋白1 的检测组织炎症的方法。

本发明提供了一种诊断和预测组织炎症的方法，包括以下步骤：

(1)当皮肤组织受到组织炎症后，检测受试者的皮肤组织中的角蛋白1的含量、结构中的至少一种；

(2)检测所述受试者未受到组织炎症下的皮肤组织中的角蛋白1的含量、结构中的至少一种；

(3)将步骤(1)和步骤(2)中获得的角蛋白1的含量、结构相对比，计算相应的变化率；

(4)根据所述变化率，诊断或预测所述受试者的组织炎症程度。

在一个实施例中，在所述检测组织炎症中，检测皮肤组织中的角蛋白1的时间点时，皮肤组织可以通过临床常见方法判断为损伤。

在一个实施例中，在所述预测组织炎症的方法中，检测皮肤组织中的角蛋白1的时间点时，皮肤组织还不能观察到炎症反应或使用临床常见方法判断为炎症。

在一个实施例中，组织炎症模型包括但不仅仅局限于以下疾病：病毒性脑炎、肝炎、肺炎、心肌炎以及肾炎。

在一个实施例中各组织炎症都具有其独特的角蛋白1的浓度、分布以及左右对称性。本发明根据角蛋白1的浓度、分布以及左右对称性等性质，我们可以无创快速地判断患者患有组织炎症的种类以及位置。

本发明还提供了一种非诊断治疗目的检测组织炎症的方法，包括以下步骤：

(1)在皮肤组织受到包含一定剂量的组织炎症诱导剂处理后，检测所述实验对象经过组织炎症诱导剂处理后的皮肤组织中角蛋白1的含量、结构中的至少一种；

(2)检测所述实验对象在未受到组织炎症下的皮肤组织中的角蛋白1的含量、结构中的至少一种；

(3)将步骤(1)和步骤(2)中获得的角蛋白1的含量、结构相对比，计算相应的变化率；

(4)根据所述变化率，计算或预测所述实验对象的组织炎症严重程度。

在一个具体的实施例中，检测实验对象的时间点为皮肤组织受到一定组织炎症条件处理或影响下的0-30天内检测实验对象，优选7天内，更优选3天内。

在本发明中，所述组织炎症诱导剂可以提高组织中的炎症因子的含量，增加组织炎症水平，所述组织炎症诱导剂包括脂多糖。

在一个实施例中，所述角蛋白1包括基因水平、蛋白质水平、蛋白质结构中的一种或多种。其中，角蛋白1包括但不限于全长的角蛋白1，或角蛋白1缺失部分氨基酸序列的角蛋白1片段，或该片段蛋白和全长角蛋白1的混合，检测上述蛋白不限于蛋白质水平，还可以是基因水平，包括磷酸化、乙酰化等修饰水平。

在一个实施例中，所述角蛋白1还包括蛋白结构变化，其中，所述蛋白结构包括角蛋白1与其他蛋白例如角蛋白10所形成的二聚体结构，其中角蛋白1包括其缺失部分氨基酸序列的角蛋白1片段，即所述蛋白结构包括缺失部分氨基酸序列的角蛋白1片段和其他蛋白例如角蛋白10所形成的二聚体结构。

在本发明中，缺失部分氨基酸序列的角蛋白1片段也称作角蛋白 1降解物，其选自缺失1至644之间任意数个氨基酸的角蛋白1片段，该缺失可以是角蛋白1的N端的缺失，也可以是角蛋白1的C端的缺失，还可以是角蛋白1全序列中任意氨基酸的组合的缺失。例如缺失1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、 144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、 156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、 180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、 204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、 240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、 264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、 276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、 288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、 300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、 312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、 324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、 348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、 360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、 372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、 384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、 396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、 408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、 420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、 432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、 444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、 468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、 480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、 492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、 504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、 516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、 528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、 540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、 552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、 564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、 576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、 600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、 612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、 636、637、638、639、640、641、642、643、644个氨基酸的角蛋白1 片段中的一个或多个。

在本发明中，所述检测角蛋白1或蛋白质1降解物的含量、结构的方法包括免疫印迹、免疫组化、免疫荧光、荧光光谱、拉曼光谱、光学检测、或物理性质检测的一种或多种。

本发明的另一方面，还提供了一种模型，该模型用于组织炎症的抑制或激动药物的筛选，其特征在于，使用本发明所述的前述方法构建该筛选模型。

各组织炎症都具有其独特的角蛋白1的浓度、分布以及左右对称性。本发明根据角蛋白1的浓度、分布以及左右对称性等性质，我们可以无创快速地判断患者患有组织炎症的种类。

本发明进一步提供了所述模型在制备用于治疗组织炎症的药物中的应用。

附图说明

图1.脂多糖诱导小鼠皮肤炎症模型。角蛋白1含量随时间的上升，角蛋白1含量上升。

具体实施方式

下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。

除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

如本文所用，“角蛋白1”、“keratin 1”、“KRT1”可互换，其是包括能够使用角蛋白1抗体识别检测的角蛋白，其可以是单一物质，也可以是混合物；在本发明中，角蛋白1包括其缺失部分氨基酸序列的角蛋白1片段，所述缺失部分氨基酸序列的角蛋白1片段为角蛋白1的N 端或C端缺失1至644个氨基酸中任一种的角蛋白1片段或其组合。

如本文所用，“缺失部分氨基酸序列的角蛋白1片段”、“角蛋白 1降解物”可互换，其是指角蛋白1的N端或C端缺失1至644个氨基酸中任一种的角蛋白1片段或其组合。

如本文所用，“组织炎症”，其包括但不仅仅局限于以下疾病：病毒性脑炎、肝炎、肺炎、心肌炎以及肾炎。

实施例1：动物实验

根据本发明，使用雄性C57小鼠，脂多糖处理前的小鼠重量在 15-25g范围之间。脂多糖处理完成后，小鼠在动物房中进行饲养，条件为22-24℃，12小时的明/暗循环，并可自由进食取水。

每24小时，使用激光共聚焦显微镜对紫外线照射的皮肤进行无创成像，如图为3天和7天检测的代表图(图1)。小鼠的皮肤组织用激光共聚焦显微镜成像，其中激光共聚焦显微镜的激发波长为440-600nm。

3天、7天内，检测小鼠的心脏组织，肾脏组织，肺组织，脑组织中的炎症因子水平，发现炎症因子的表达量显著上升。

3天、7天内，收集脂多糖处理过的细胞蛋白，利用免疫印迹法，检测角蛋白1以及角蛋白1相关蛋白的含量。

实验的结果如下所述：

由以上实验可以得出，皮肤或者皮肤细胞经过脂多糖后，角蛋白1 以及角蛋白1相关蛋白的结构和含量发生变化，且该变化与组织炎症呈正相关。而且，在相同条件下，角蛋白5和角蛋白10的结构和含量没有显著变化。因此，表皮角蛋白1以及角蛋白1相关蛋白能够作为预测和检测组织炎症皮肤损伤的标志物。

角蛋白1或其片段与其他蛋白会形成二聚体或多聚体结构，其中约 125kD位置为角蛋白1与其他蛋白所形成的二聚体或多聚体。因此检测含有角蛋白1的结构例如二聚体、多聚体等均在本发明的保护范围之内。

实施例2用紫外光诱导皮肤炎症模型

根据本发明，使用雄性C57小鼠，一定剂量紫外光处理前的小鼠重量在15-25g范围之间。紫外光处理完成后，小鼠在动物房中进行饲养，条件为22-24℃，12小时的明/暗循环，并可自由进食取水。

1天，3天，7天内，使用光谱仪检测皮肤中角蛋白1的光谱，发现光谱强度上升，光谱分布没有变化。

实施例3角蛋白1降解物的纯化和鉴定

在细胞中，过表达角蛋白1，经过组织炎症(LPS处理)后，收集细胞后裂解，过分离纯化柱，纯化角蛋白1降解物，并通过蛋白质组学分析发现这些降解物的长度均小于全长角蛋白1的大小。

实施例4动物实验

将活体C57小鼠的皮肤组织一半经过脂多糖处理，而另一半皮肤作为空白对照后，收集皮肤组织，使用免疫印迹法检测角蛋白1的含量，结果显示经过脂多糖处理的小鼠皮肤组织中，角蛋白1呈现显著降低。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。