用于质谱诊断地中海贫血症的特征蛋白标记组合物及其诊断产品
阅读说明：本技术 用于质谱诊断地中海贫血症的特征蛋白标记组合物及其诊断产品 (Characteristic protein marker composition for mass spectrometric diagnosis of thalassemia and diagnostic product thereof ) 是由 何昆 马庆伟 常亮 向华 梁丽蕴 吕倩 牛燕燕 于 2019-10-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种检测地中海贫血症的特征蛋白片段组合物以及评价地中海贫血药物疗效或治疗方法效果评价的质谱模型。其中所述特征蛋白片段组合物的序列分别如SEQ ID No.1-3所示。本发明的特征蛋白片段组合物或质谱模型,可用于地中海贫血症的诊断和筛查以及地中海贫血症的治疗方法和药物疗效评价,方法简单易于操作,准确性高,为地中海贫血症的诊断和筛查、治疗方法、药物疗效评价提供了新的方法和思路。(The invention provides a characteristic protein fragment composition for detecting thalassemia and a mass spectrum model for evaluating the curative effect of a thalassemia drug or the curative method. Wherein the sequences of the characteristic protein fragment compositions are respectively shown as SEQ ID No. 1-3. The characteristic protein fragment composition or the mass spectrum model can be used for diagnosing and screening the thalassemia and evaluating the curative effect of the thalassemia treatment method and the curative effect of the mediterranean anemia, the method is simple and easy to operate, the accuracy is high, and a new method and a new thought are provided for the thalassemia diagnosis and screening, the mediterranean anemia treatment method and the curative effect evaluation of the mediterranean anemia.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测地中海贫血症的特征血红蛋白的组合物或质谱模型，以及使用组合物或该模型，对血红蛋白异常可以进行快速鉴定以及对特征蛋白、尤其是血红蛋白片段相关疾病治疗方法或药物的疗效评价。同时，本发明还提供涉及该组合物或模型的诊断产品和用途。
背景技术
血红蛋白又称血色素，由2个β基因球蛋白与2个α基因球蛋白结合的杂四聚体复合物，是红细胞的主要组成部分，能与氧结合，运输氧和二氧化碳。血红蛋白含量能很好地反映贫血程度。血红蛋白病是世界上最大的一组遗传人单基因病，同时是地中海贫血与异常血红蛋白病的统称，其中地中海贫血对人类危害较大，且在中国南方较为常见，高发于广东、广西、海南等地[1]。最根本的特点是珠蛋白基因缺陷导致的血红蛋白中的珠蛋白肽链(即α-、β-、γ-、δ-中的任何一种珠蛋白链)有一种或者几种难以合成或者不能合成，最终致使血红蛋白其中的成分发生改变，甚至出现异常杂和纯四聚体Hb配对的聚合体。
重患者主要以慢性进行性溶血性贫血为主，轻者没有特别明显的临床症状[2]。依据珠蛋白链合成受抑制的不同，可分为α-地中海贫血、β-地中海贫血、γ-地中海贫血、δ-地中海贫血等四种，其中α-和β-地中海贫血最为普遍。仍目前地中海贫血患者治疗上来看，并无效果十分显著的手段，因此对该种疾病进行准确、科学的筛查以及诊断十分重要。
α型地中海贫血的发病原因为α链的合成缺失，β型地中海贫血的发病原因为β链的合成缺失。在α地中海贫血中，分为静止型、轻型、中间型、重型。静止型：红细胞形态正常，出生时脐带血中Hb Bart's含量为0.01～0.02，但3个月后即消失。轻型：红细胞形态有轻度改变，如大小不等、中央浅染、异形等；红纽胞渗透脆性降低；变性珠蛋白小体阳性；HbA2和HbF含量正常或稍低。患儿脐血Hb Bart's含量为0.034～0.140，于生后6个月时完全消失。中间型：外周血象和骨髓象的改变类似重型β地贫；红细胞渗透脆性减低；变性珠蛋白小体阳性；HbA2及HbF含量正常。出生时血液中含有约0.25Hb Bart's及少量HbH；随年龄增长，HbH逐渐取代HbBart's，其含量为0.024～0.44。包涵体生成试验阳性。重型：外周血成熟红细胞形态改变如重型β地贫，有核红细胞计数和网织红细胞计数明显增高。血红蛋白中几乎全是HbBart's，或同时有少量HbH，无HbA、HbA2和HbF。
β珠蛋白生成障碍性贫血(地中海贫血)分为重型、轻型、中间型。(1)重型：外周血象呈小细胞低色素性贫血，红细胞大小不等，中央浅染区扩大，出现异形、靶形、碎片红细胞和有核红细胞、点彩红细胞、嗜多染性红细胞、豪-周氏小体等；网织红细胞正常或增高。骨髓象呈红细胞系统增生明显活跃，以中、晚幼红细胞占多数，成熟红细胞改变与外周血相同。红细胞渗透脆性明显减低。HbF含量明显增高，大多>0.40，这是诊断重型β地贫的重要依据。颅骨X线片可见颅骨内外板变薄，板障增宽，在骨皮质间出现垂直短发样骨刺。(2)轻型：成熟红细胞有轻度形态改变，红细胞渗透脆胜正常或减低，血红蛋白电泳显示HbA2含量增高(0.035～0.060)，这是本型的特点。HbF含量正常。(3)中间型：外周血象和骨髓象的改变如重型，红细胞渗透脆性减低，HbF含量为0.40～0.80,HbA2含量正常或增高。
由于目前对地中海贫血尚无有效的治疗方法，而夫妇携带的异常α、b珠蛋白基因可以遗传给子代，根据遗传情况，如果夫妇双方均为α地贫基因携带者，将会有25％的危险娩出一个重型α地贫儿，并会导致胎儿宫内水肿及死胎。目前，临床仅能通过产前筛查避免患儿的出生，而对α-地中海贫血纯合子胎儿则无有效的治疗措施。因此，进行产前诊断的目的就是要杜绝纯合子胎儿的出生，减少杂合子胎儿的出生。
地中海贫血的非基因检测技术很多，如血红蛋白电泳、血常规，红细胞渗透脆性试验等。目前，适当的产前筛查方法是通过血液分析仪查平均红细胞容量(MCV)和平均红细胞血红蛋白量(MCH)。由于红细胞储存于室温时可能会膨胀，MCH比MCV更为可靠。以MCH<27pg或MCV<80fl为标准，基本可以完全筛查出携带者。当MCH或MCV小于该标准后，应进行血红蛋白电泳，若HbA2<2.5％，则高度怀疑为α地贫基因携带者。如果发现了HbH包涵体，则可诊断为中间型α-地贫。同时还应注意全血铁蛋白测定，以排除缺铁性贫血。此类方法操作要求低，费用低廉，但敏感性差，特异性不高，而近来广泛应用的血红蛋白电泳法也存在着准确性和重复性不佳的缺点。且部分患者MCV及红细胞渗透脆性试验可以正常，是造成β―地中海贫血基因携带者漏诊的主要原因，漏诊率达到13.23％。
随着产前筛查及影像技术的发展，越来越多的中、晚期妊娠孕妇要求进行产前诊断。其中，超声诊断是孕中期检测Bart’s水肿胎儿的简便可行方法之一。在孕12周以后，超声检测胎儿心胸比值和胎盘厚度、羊水量亦可分辨出Bart’s水肿胎儿。国内外有应用超声多普勒检测胎儿大脑中动脉血流速度诊断不同类型胎儿贫血的报道，使有贫血风险的胎儿减少70％以上的侵入性操作，认为可能是诊断胎儿贫血的最佳方法。由于其无创伤性，简便、快速，目前更易为患者所接受。
绒毛活检适用于妊娠早期，一般在孕8～10周进行，由于自然流产率达2％～3％，目前很少用于要求继续妊娠的孕妇。
羊水及脐血管穿刺取血检查羊水穿刺是目前最常用的胎儿染色体病的产前诊断方法，穿刺流产率仅为0.15％～0.2％，羊膜腔穿刺限于妊娠16～23周，脐血管穿刺是20世纪80年代以后发展起来的一项具有突破性的产前诊断技术，大大提高了产前诊断成功率、准确性及产前诊断范围。
基因芯片诊断技术地贫诊断基因芯片(ThalachipTM)是一种基于DNA芯片技术识别中国地区已知地贫基因型的新技术，基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上，采用荧光标记及引物延伸的方法，可提高检测结果的敏感性和特异性，由于基因芯片高通量特点，可将α、β地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成，适用于大面积普查。我国对地贫的基因诊断始于20世纪80年代初，先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析、寡核苷酸(ASO)探针杂交和PCR体外基因扩增等5个发展阶段，基因检测能够大大提高地贫检测的准确性，减少地贫的漏检率，因此基因检测又被称之为是诊断地贫的金标准。并成为目前临床上最普遍的地贫基因诊断方法。
然而，上述方法或是因为需要进行活检取样检测，会对孕妇身体造成伤害，或是存在敏感性差，特异性不高的缺点，或是存在测试反应时间过长、需要昂贵的PCR试剂等，因此目前需要新的分析方法来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。
基质辅助激光解吸电离离子源和飞行时间质量分析器。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。
中国专利申请201810001598.4、发明名称“一种糖化血红蛋白的检测方法”公开了使用飞行时间质谱仪检测糖化血红蛋白的方法，其可获得待测样品在3000-20000Da范围的质谱图，得到糖化血红蛋白质谱峰面积A和相应的非糖化血红蛋白质谱峰面积B；通过公式A/(A+B)*100％得糖化血红蛋白的占比。虽然本该方法采用MALDI-TOF-MS检测，但其目的是用于检测血红蛋白和血糖的结合产物，并且通过糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白的质荷比的不同进行精准的定量分析，不能实现针对不同构型的珠蛋白链的监测。
综上，目前国内急需一种采用MALDI-TOF-MS技术获得检测地中海贫血症的特征蛋白的质谱模型及其相关诊断技术。
发明内容
本发明目的是为了克服检测地中海贫血症的异常血红蛋白的技术的不足之处，提出一种用于检测地中海贫血症特征血红蛋白和治疗方法以及药物疗效评价的质谱模型及其制备方法。本发明原理在于利用MALDI-TOF-MS质谱仪测定和比较地中海贫血症患者和健康人血液样本的血红蛋白谱图，并筛选出相应的血红蛋白片段标志物。
因此，本发明第一个发明目的是提供一种用于诊断地中海贫血的特征蛋白标记组合物，该组合物由3条特征蛋白片段组成，其中所述特征蛋白片段的序列分别如SEQ IDNo.1-3所示：
SEQ ID No.1：
MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR
SEQ ID No.2：
MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH
SEQ ID No.3：
MGHFTEEDKATITSLWGKVNVEDAGGETLGRLLVVYPWTQRFFDSFGNLSSASAIMGNPKVKAHGKKVLTSLGDAIKHLDDLKGTFAQLSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSRYH，
其中，三种特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)的三个蛋白峰，并且m/z偏差允许范围±0.15％。其中，特征蛋白序列SEQ ID NO:1均存在于在胎儿、儿童及成年人血液中；特征蛋白序列SEQ ID NO:2在胎儿期含量极低，几乎不可检出，出生后含量逐渐升高至可检出；特征蛋白序列SEQ ID NO:3主要存在于胎儿及2岁以内的婴幼儿血液中，在健康成年人中含量极低，几乎不可检出。
由于在地中海贫血患者(包括胎儿、儿童及成年)和健康人群(包括胎儿、儿童及成年)的全血样本中，此三种蛋白的质合比以及相对含量存在差异，并且m/z偏差允许范围±0.15％。其中，胎儿出生后γ蛋白的生理作用逐渐被β蛋白取代。因此健康成人中γ蛋白峰强度极低。但在部分β地贫患者中会出现γ代偿峰。因此γ峰的异常上调以及上述特征蛋白的m/z的出现或变化可以作为检测地贫的指征。在一个实施方案中，所述健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)，其中本发明涉及到的m/z偏差允许范围±0.15％。其中，15120m/z峰用于确定15859m/z或15989m/z的上调或下调的变化强度。参见正常人图谱(图1)。
在一个优选实施方案中，健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15119m/z(α珠蛋白片段)、15867m/z(β珠蛋白片段)。
在另一实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)的三个蛋白峰，并且m/z偏差允许范围±0.15％。。其中，在被检测样本中，当表征β珠蛋白片段峰的15859m/z下调表达或2岁以上人群中表征ν珠蛋白片段峰的15989m/z上调表达，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者；地中海贫血患者治疗后，当表征ν珠蛋白片段峰的15989m/z相对于原表达量而上调表达时，预示被检测人的药物疗效效果比较好，可以继续使用该药物进行治疗。其中，15120m/z峰用于确定15859m/z或15989m/z的上调或下调的变化强度。参见地贫患者图谱(图2)。
在一个优选实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15112m/z(α珠蛋白片段)、15853m/z(β珠蛋白片段)。
在上述任一的实施方案中，所述特征蛋白标记组合物除了包含所述3条特征蛋白片段，还包含用于进行相对定量的1-3种内标蛋白标准品，优选是脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，该内标蛋白标准品接近特征蛋白检测范围，通过比较内标蛋白的峰值强度，可直接换算出特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值。在一个优选实施方案中，其中所述标准品是脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，m/z为16952。
本发明的第二个发明目的是提供一种用于诊断地中海贫血的特征蛋白的质谱模型，该质谱模型包括但不局限于上述多肽标记组合物，其中该标记组合物由3条特征蛋白片段组成，其中所述特征蛋白片段的序列分别如SEQ ID No.1-3所示，并且m/z偏差允许范围±0.15％。
在一个实施方案中，当待检样本中15859m/z下调表达或2岁以上人群15989m/z上调表达时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者；当地中海贫血患者治疗后，当15989m/z(γ珠蛋白片段)相对上调表达时，预示被检测人的药物疗效效果比较好，可以继续使用该药物进行治疗。
在一个优选实施方案中，健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15119m/z(α珠蛋白片段)、15867m/z(β珠蛋白片段)。
在另一个优选实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15112m/z(α珠蛋白片段)、15853m/z(β珠蛋白片段)。
在上述任一一个实施方案中，将15120m/z峰强度作为标准强度，并定义为1。将15859m/z峰强度的临界值设定为0.5。当15859m/z表达低于0.5时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者。在疗效追踪过程中，当15989m/z相对于原表达量的上调表达超过0.1时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者当前采用的治疗方法或是药物疗效较好。
在上述任一的实施方案中，所述特征蛋白标记组合物除了包含所述3条特征蛋白片段，还包含用于进行相对定量的1-3种内标蛋白标准品，优选脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，该内标蛋白标准品接近特征蛋白检测范围，通过比较内标蛋白的峰值强度，可直接换算出特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值。在一个优选实施方案中，其中所述标准品是脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，m/z为16952。
本发明的第三个发明目的是提供一种用于诊断地中海贫血症的诊断产品，其包含上述标记组合物，或包含上述的质谱模型。
在一个实施方案中，所述诊断产品选自诊断试剂盒，该试剂盒由全血质控品、缓冲液、基质溶液组成，基于飞行时间质谱的地中海贫血检测软件、地中海贫血质谱检测专用靶板。该试剂盒可用于待测样品进行质谱时提供标准数据或曲线的比对，以判断待测样品中是否是地中海贫血患者或是药物及治疗方法是否有效。
在另一个实施方案中，该试剂盒可含有上述3条特征蛋白多肽的标准数据库的软件或芯片，可用于待测样品进行质谱时提供标准数据或曲线的比对，以判断待测样品中是否是地中海贫血患者或是药物及治疗方法是否有效。
在上述任一的实施方案中，所述特征蛋白标记组合物除了包含所述3条特征蛋白片段，还包含用于进行相对定量的的1-3种内标蛋白标准品，优选脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，该内标蛋白标准品接近特征蛋白检测范围，通过比较内标蛋白的峰值强度，可直接换算出特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值。在一个优选实施方案中，其中所述标准品是脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，m/z为16952。
本发明的第四个发明目的是提供所述多肽标记组合物，或所述的质谱模型，在制备诊断地中海贫血症的产品中的用途。
在一个实施方案中，所述产品包括：诊断试剂、检测专用靶板、芯片、载体、试剂盒等。
本发明的第五个发明目的是提供一种制备所述质谱模型的构建方法，包括：
1)收集多例临床确诊的患者全血和正常对照人员的全血作为两组全血标本，进行低温冷冻备用；
2)对全血蛋白多肽进行质谱前预处理，并在样本中添加标准品脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)；
3)对预处理过的两组全血多肽进行质谱检测读取，获得两组全血多肽的指纹图谱；
4)对所有的癌患者和正常人全血多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；
5)对所得数据进实验质控处理，共有以下质谱峰(m/z)：5042，5809，5933，6986，7562，7667，7932，8085，8475，8580，15120，15329，15859，15989
6)从步骤5)中筛选出具有下述质荷比的3个地中海贫血症特征多肽峰：15120m/z，15859m/z，15989m/z的三个蛋白峰，并根据所述蛋白多肽标记和质荷比峰的变化建立用于诊断地中海贫血症的质谱模型，其中，所述3个地中海贫血症特征蛋白的多肽序列均为正常对照蛋白，序列分别如SEQ ID No.1-3所示。
在一个实施方案中，所述三个蛋白峰的m/z偏差允许范围±0.15％，因此，所述健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)，患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)。
在一个优选实施方案中，健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15119m/z(α珠蛋白片段)、15867m/z(β珠蛋白片段)。
在另一个优选实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15112m/z(α珠蛋白片段)、15853m/z(β珠蛋白片段)。
在上述任一一个实施方案中，将15120m/z峰强度作为标准强度，并定义为1。将15859m/z峰强度的临界值设定为0.5。当15859m/z表达低于0.5时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者。在疗效追踪过程中，当15989m/z相对于原表达量的上调表达超过0.1时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者当前采用的治疗方法或是药物疗效较好。
在上述任一实施方案中，其中步骤2)样本处理过程中，预先加入接近特征蛋白检测范围的1-3种内标蛋白标准品，优选脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)的标准品进行相对定量，能更加准确地对血红蛋白进行相对定量，即通过比较内标的峰值强度，可直接换算出特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值。在一个优选实施方案中，其中所述标准品是脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，m/z为16952。
本发明第六个发明目的是提供一种利用表征地中海贫血症的特征蛋白组合物或质谱模型来用于筛选地中海贫血症的药物的用途或评价对地中海贫血的治疗方法的用途。
在一个实施方案中，所述特征蛋白标记组合物，该组合物由3条特征蛋白片段组成，其中所述特征蛋白片段的序列分别如SEQ ID No.1-3所示。
在一个具体实施方案中，所述健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)，其中本发明涉及到的m/z偏差允许范围±0.15％。其中，15120m/z峰用于确定15859m/z或15989m/z的上调或下调的变化强度。参见正常人图谱(图1)。
在另一个优选实施方案中，健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15119m/z(α珠蛋白片段)、15867m/z(β珠蛋白片段)。
在其他优选实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)的三个蛋白峰，并且m/z偏差允许范围±0.15％。。其中，在被检测样本中，当15859m/z下调表达或2岁以上人群15989m/z上调表达，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者；地中海贫血患者治疗后，当15989m/z(γ珠蛋白片段)相对于原表达量而上调表达时，预示被检测人的药物疗效效果比较好，可以继续使用该药物进行治疗。其中，15120m/z峰用于确定15859m/z或15989m/z的上调或下调的变化强度。参见地贫患者图谱(图2)。
在一个优选实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15112m/z(α珠蛋白片段)、15853m/z(β珠蛋白片段)。
在一个实施方案中，所述质谱模型的构建方法，包括：
1)收集多例临床确诊的患者全血和正常对照人员的全血作为两组全血标本，进行低温冷冻备用；
2)对全血蛋白多肽进行质谱前预处理，并在样本中添加标准品脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，其蛋白质谱峰值m/z为16952；
3)对预处理过的两组全血多肽进行质谱检测读取，获得两组全血多肽的指纹图谱；
4)对所有的癌患者和正常人全血多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；
5)对所得数据进实验质控处理，共有以下质谱峰(m/z)：5042，5809，5933，6986，7562，7667，7932，8085，8475，8580，15120，15329，15859，15989
6)从步骤5)中筛选出具有下述质荷比的3个地中海贫血症特征多肽峰：15120m/z，15859m/z，15989m/z的三个蛋白峰，并根据所述蛋白多肽标记和质荷比峰的变化建立用于诊断地中海贫血症的质谱模型，其中，所述3个地中海贫血症特征蛋白的多肽序列均为正常对照蛋白，序列分别如SEQ ID No.1-3所示。
在一个实施方案中，所述三个蛋白峰的m/z偏差允许范围±0.15％，因此，所述健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)，患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)。
在一个优选实施方案中，健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15119m/z(α珠蛋白片段)、15867m/z(β珠蛋白片段)。
在另一个优选实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15112m/z(α珠蛋白片段)、15853m/z(β珠蛋白片段)。
在上述任一一个实施方案中，将15120m/z峰强度作为标准强度，并定义为1。将15859m/z峰强度的临界值设定为0.5。当15859m/z表达低于0.5时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者。在疗效追踪过程中，当15989m/z相对于原表达量的上调表达超过0.1时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者当前采用的治疗方法或是药物疗效较好。
在上述任一实施方案中，其中步骤2)样本处理过程中，预先加入接近特征蛋白检测范围的1-3种内标蛋白标准品，优选脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)的标准品进行相对定量，能更加准确地对血红蛋白进行相对定量。在一个优选实施方案中，其中所述标准品是脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，m/z为16952。
在上述任一实施方案中，所述筛选药物的方法包括通过用于诊断地中海贫血症的质谱模型来判断药物是否对相关蛋白产生了影响，从而判断是否属于具有抗地中海贫血症的活性的期望药物。
在上述任一实施方案中，所述治疗方法包括造血干细胞移植法和基因编辑法。在一个优选的实施方案中，所述造血干细胞移植法是对2-6岁儿童进行移植造血干细胞来治疗地中海贫血症的方法。在另一优选的实施方案中，所述基因编辑法是对地中海贫血的新生儿的脐带血进行了基因编辑，进行质谱检测，并通过地中海贫血症诊断的质谱模型做判断，即可筛选该编辑是否有效。在一个更加优选的实施方案中，所述治疗方法中证明治疗有效的组合物，可判断为被筛选的属于具有抗地中海贫血症的活性的期望药物，其中所述组合物可以是基因编辑法中导入人体的治疗性组合物，或造血干细胞移植法中所导入的造血干细胞。
在一个实施方案中，所述三个蛋白峰的m/z偏差允许范围±0.15％，因此，所述健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)，患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-3)峰的表征质荷比分别为：15120m/z(α珠蛋白片段)、15859m/z(β珠蛋白片段)、15989m/z(ν珠蛋白片段)。
在一个优选实施方案中，健康人群特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15119m/z(α珠蛋白片段)、15867m/z(β珠蛋白片段)。
在另一个优选实施方案中，所述地中海贫血患者特征蛋白(SEQ ID NO:1-2)峰的表征质荷比分别为：15112m/z(α珠蛋白片段)、15853m/z(β珠蛋白片段)。
在上述任一一个实施方案中，将15120m/z峰强度作为标准强度，并定义为1。将15859m/z峰强度的临界值设定为0.5。当15859m/z表达低于0.5时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者。在疗效追踪过程中，当15989m/z相对于原表达量的上调表达超过0.1时，预示被检测人为地中海贫血患者或潜在患者当前采用的治疗方法或是药物疗效较好。
在上述任一的实施方案中，所述特征蛋白标记组合物除了包含所述3条特征蛋白片段，还包含用于进行相对定量的的1-3种内标蛋白标准品，优选脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，该内标蛋白标准品接近特征蛋白检测范围，通过比较内标蛋白的峰值强度，可直接换算出特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值。在一个优选实施方案中，其中所述标准品是脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，m/z为16952。
本发明结合生物信息学方法筛选出相应的地中海贫血症标记并建立检测模型进行分析检测，所述的生物信息学方法包括对多肽指纹图谱进行标准化处理、对所得数据进实验质控处理、筛选所期望的地中海贫血症患者的全血特征多肽，并建立质谱模型，以及可选择地包括使用遗传算法结合最近邻算法建立并验证质谱模型等。本发明中，变异系数优选为6％。
技术效果
本发明用质谱检测地中海贫血症患者全血中的特征多肽，可用于建立全血特征多肽质谱模型以及应用于在地中海贫血症的筛查和诊断，本发明的质谱模型，可用于地中海贫血症的筛查和诊断。
本发明与其它地中海贫血症的检测方法比较，具有以下优点：
第一，本发明采用地中海贫血症患者与正常人具有显著差异的多个特征多肽组合进行对地中海贫血症全血的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到地中海贫血症患者和健康人全血多肽质指纹图谱检测模型，并且所发现的一系列多肽质质荷比峰为寻找新的更理想的地中海贫血症标记提供了基础和资源。
第二，与以往的全血学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选抗地中海贫血症的药物中。
第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供地中海贫血症的临床治愈率提供了新的筛查方法，同时也为探索地中海贫血症发生发展的机制提供了新的思路。
第四，利用本发明分析了300份全血样品，其中训练组200例(其中，地贫患者100例，健康人群100例)，测试组100例(其中，地贫患者50例，健康人群50例)。验证结果显示，地贫49例判断正确，检出率达98％。正常组检出率100％。因此本发明可对地中海贫血症作出早期的诊断，并可以对治疗方法和药物进行疗效评价，有助于为患者提供优良药物和治疗方法。
第五，本发明可以使用的接近特征蛋白检测范围，利于在MALDI质谱检出1-3种内标蛋白标准品，所述内标蛋白可以具有不同分子量范围，使得不同分子量大小的待检蛋白样品均能被相应的接近分子量范围的内标蛋白进行校正，从而通过比较内标蛋白的峰值强度，可直接换算出特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值。其中，所述内标蛋白优选是脱辅基肌红蛋白。
附图说明
以下实验图谱均为MALDI-TOF-MS图谱。
图1为部分健康人全血的蛋白多肽图谱，其中1-A、1-B、1-C为3例健康人全血蛋白多肽图谱。
图2为地中海贫血症患者全血蛋白多肽图谱。
图3为新生儿脐带血样本全血蛋白多肽图谱。
图4为健康成人和健康新生儿指纹图谱对照图谱。
图5为健康人群和地贫患者指纹图谱对照图谱。
图6为2位地贫患者全血加入内标后的指纹图谱。
图7为加入内标后确定诊断灵敏度的AUC曲线图。
图8为通过指纹质谱模型检测对地贫患者给药后的疗效的评价指纹图谱。
图9为本发明对体外基因编辑后的血细胞进行检测β珠蛋白、γ-珠蛋白的表达量差异对比图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一、地中海贫血症全血多肽的质谱检测和地中海贫血症筛选模型的建立
1.样本和仪器：
选自300例全血样本，其中150例来自地中海贫血症患者，另外150例来自健康人群，除此之外10例新生儿脐带血样本。地中海贫血症患者均经术后病理报告确定。所有的全血样本均在清晨空腹下抽取(新生儿为脐带血)，分离全血后储存在-80℃低温冰箱中。
基质辅助激光解析飞行时间质谱Clin-TOF由北京毅新博创生物科技有限公司研制。使用公司研发的DP数据分析软件做数据的处理。
2.技术路线：
全血的采集：收集血样在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结一小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1.400-2.000g离心SST管(真空采血管，BD公司)十分钟。吸取全血(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的0.5ml离心管，同一全血样品50ul一管，分装多管。立即冻存全血样品于-80℃。由于反复冻融全血样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存全血分为永久保存和待分装的。全血分装后可在-80℃保存多年。
全血样品的处理：在进行多肽提取实验前，从低温冰箱提取分装的全血样品各1管，放于湿冰上。化冻60－90分钟。吸取2μL全血样本加入1ml样本处理液中，4档位涡旋混合器混合30s，得到全血处理液。
吸取5μL全血处理液与10μL SA基质混合均匀(移液器吹吸15次/样本)；吸取1μL基质样本混合液点靶板；然后进行MALDI-TOF-MS检测；最后通过地中海贫血鉴定软件判断检测结果。
另外，选用适量(例如5、10或20nmol)的脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin)，在适量(例如600、800或1000μl)稀释液中完全溶解，得到蛋白内标标准品。然后按照以上方法，平行进行MALDI-TOF-MS检测：即，吸取5μL全血(地贫患者)处理液、5μL蛋白内标标准品与10μLSA基质混合均匀(移液器吹吸15次/样本)；吸取1μL基质样本混合液点靶板；然后进行MALDI-TOF-MS检测；最后通过地中海贫血鉴定软件判断检测结果。
3.生物信息学方法
(一)质谱数据采集
应用Clin-TOF质谱仪。激光能量60％时，10shots去杂，36％时50shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率：30Hz。数据收集范围：4-18KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正，平均分子量偏差小于200ppm。
实验质控：(1)对于每一张采集到的原始图谱，我们设定S/N>＝5的峰数量做为评判图谱质量的一个标准；(2)针对整个实验操作，峰列表如表1所示，采用Sigma全血的组内变异系数保证实验的一致性，本实例方法的变异系数为6％，满足一致性允许范围，说明实验一致性良好。
表1 地中海贫血质谱峰列表
(二)原始数据预处理
原始数据经北京毅新博创生物科技有限公司数据DP分析软件处理，做归一化处理。
(三)地中海贫血症特征多肽的选择
每个质荷比多肽峰对各类样本的区分的相对重要性都不同，这里综合运用了T检验P值和出峰频率的方法来评价每个多肽峰的相对重要性。
(四)逻辑回归算法
回归分析是确定两种或两种以上变量间相互依赖的定量关系的一种统计分析方法。运用十分广泛，回归分析按照涉及的变量的多少，分为一元回归和多元回归分析；按照自变量的多少，可分为简单回归分析和多重回归分析；按照自变量和因变量之间的关系类型，可分为线性回归分析和非线性回归分析。如果在回归分析中，只包括一个自变量和一个因变量，且二者的关系可用一条直线近似表示，这种回归分析称为一元线性回归分析。如果回归分析中包括两个或两个以上的自变量，且自变量之间存在线性相关，则称为多重线性回归分析。在大数据分析中，回归分析是一种预测性的建模技术，它研究的是因变量(目标)和自变量(预测器)之间的关系。这种技术通常用于预测分析，时间序列模型以及发现变量之间的因果关系。本发明方法采用逻辑回归方法，分类函数采用线性分类算法。
在逻辑回归算法集合线性分类算法分类的过程中引入了交叉验证的过程，在全部样本中，本发明随机选择一半的患者及正常样本来建立模型，余下的样品作为验证。它可以监督训练过程，避免建立的模型出现对建模样本表现好，对预测样本表现差的“过学习”现象。
在利用逻辑回归算法集合线性分类算法对训练样本建立质谱数据分类模型后，利用验证样本来检验所建立模型的分类能力。
最终，得到图1-图6，其中：
图1-A、1-B、1-C为3个健康人全血蛋白多肽图谱。蛋白多肽峰在所有建模型样品中的展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为15120m/z、15859的地中海贫血症特征多肽峰；其中所测α珠蛋白峰的m/z分别是15119m/z、15122m/z、15119m/z，β珠蛋白峰的m/z分别是15867m/z、15869m/z、15865m/z，均落在允许偏差±0.15％的范围内；
图2为地中海贫血症患者全血蛋白多肽图谱，其中2-A、2-B、2-C为3个地中海贫血患者的全血蛋白多肽图谱，如图所示，所测α珠蛋白峰和β珠蛋白峰的m/z均落在允许偏差±0.15％的范围内；
图3为新生儿脐带血样本全血蛋白多肽图谱，其中3-A、3-B、3-C为3个新生儿脐带血的全血蛋白多肽图谱。在胎儿和新生儿人群中，α蛋白和γ蛋白承担主要的生理作用，β蛋白含量极少；其中所测α珠蛋白峰的m/z分别是15120m/z、15122m/z、15119m/z，β珠蛋白峰的m/z分别是15859m/z、15869m/z、15858m/z，γ珠蛋白的m/z分别是15989m/z、15988m/z、15987m/z，均落在允许偏差±0.15％的范围内；
图4为健康成人和健康新生儿指纹图谱对照图谱。胎儿出生后γ蛋白的生理作用逐渐被β蛋白取代。因此健康成人中γ蛋白峰强度极低。但在部分β地贫患者中会出现γ代偿峰。因此γ峰的异常上调可以作为地贫的指征之一；
图5为健康人群和地贫患者指纹图谱对照图谱，其中二者的β珠蛋白的表达强度呈现明显差异。
基于MALDI质谱平台，地贫患者组和正常组的β峰与α峰的比值是有明显差异的，100例正常人的β峰与α峰的比值的均值为0.88。但是其中严重的α地贫患者会被误判为正常人，需进行进一步判读。由此，在检测样品中加入内标，可以发挥关键性的作用。例如，图6为2位地贫患者全血加入内标后的指纹图谱。其中，内标蛋白标准的m/z稳定显示为16952m/z，该内标蛋白标准品接近特征蛋白检测范围，但又与三种特征蛋白具有明显的区分度。其中，通过比较内标蛋白的峰值强度，可直接换算出特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值，这说明该内标蛋白既能验证系统实验误差，同时还能对特征蛋白的峰值绝对强度及其上调或下调的变化值进行准确定量，从而完成对于地贫症或经过治疗后是否产生疗效的诊断。
实施例二、特征蛋白的鉴定
磁珠富集法
1.据分析确定待鉴定峰后，反查前期处理样本中待鉴定峰值强度最高的样品。
2.查明前期实验所用磁珠。把此样平行处理20份。富集为一管。
3.离心1300rmp，5min。磁架上取上清。避免留有磁珠影响后期实验。
4.把液体旋干，标记。
采用Waters公司Nano Aquity UPLC液相系统：参数如下设置，捕集柱：C18,5μm,180μm×20mm,nanoAcquityTMColumn；分析柱：
梯度洗脱程序设置：
采用ThermoFisher公司LTQ Obitrap XL(Thermo)质谱系统，Nano电喷雾离子源(Michrom)，喷雾电压1.4kV；质谱扫描时间60min；实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion)，每个母离子进行2次MS/MS后排除60秒；扫描范围400-2000m/z；一级扫描(MS)使用Obitrap，分辨率设定为1000009(m/z 400处)；CID及二级扫描使用LTQ；在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除，不作为母离子)。使用数据分析软件BioworksBrowser 3.3.1SP1进行SequestTM检索，检索数据库为IPI Human(版本3.45，71983条目)，为降低假阳性在数据库末端附加其反库。母离子误差设定为50ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切。检索结果参数设定为deltacn>＝0.10，两电荷Xcorr2.0,三电荷Xcorr 2.5,三电荷以上Xcorr3.0，peptideprobability<＝1e-003。此参数条件下显示的肽段以及多肽结果准确度较高，按照文献和国际多肽质组规定来设定。
对实施例1中的健康人及地中海贫血症患者的样本进行数据分析，筛选出具有下述质荷比的3个地中海贫血症特征多肽峰：15120m/z，15859m/z，15989m/z的三个蛋白峰，参见表2。
表2 健康人和地贫症患者比较的三个用于建模的多肽峰的比较
对所有在正常组和地贫症组表现差异的多肽，应用磁珠富集法进行多肽鉴定。结果见表3。
表3 特征多肽序列鉴定结果
质荷比(m/z)
多肽序列
15120
SEQ ID NO:1
15859
SEQ ID NO:2
15989
SEQ ID NO:3
其中，SEQ ID No.1：
MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR
SEQ ID No.2：
MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH
SEQ ID No.3：
MGHFTEEDKATITSLWGKVNVEDAGGETLGRLLVVYPWTQRFFDSFGNLSSASAIMGNPKVKAHGKKVLTSLGDAIKHLDDLKGTFAQLSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSRYH
实施例三、地中海贫血症筛选模型的盲选测试
选择300例全血样本(150例来自地中海贫血症患者，另外150例来自健康人群)中的200例(其中，地贫患者100例，健康人群100例)作为训练样本，用于建立模型。地中海贫血症患者均经基因检测确定。所有的全血样本均在清晨空腹下抽取，分离全血后储存在-80℃低温冰箱中。
另选剩余样本100例作为测试样本，用于盲选测试，其中已知50例来自地中海贫血症患者，另外50例来自健康人群。处理方式同上。
用实施例1-2筛选出的地中海贫血症特征多肽峰建立地中海贫血症多肽的质谱模型。该模型定为采用3个输入变量，分别是：15120m/z、15859m/z、16952m/z。
模型训练识别率为100％。并采用随机选择方法进行交叉验证，验证结果为99％。模型具有很好的预测能力。
表4 模型训练结果
样本
例数
预测地贫组
预测正常组
预测率％
地贫组
100
100
0
100
正常组
100
0
100
100
总计
200
100
100
从表4中可以看出对训练样本的结果为：100例正常组中的100例判断正确，特异性100％；100例地中海贫血症中的100例判断正确，敏感性为100％。
模型训练完成后，接着用这个模型对100个验证样本来盲选预测，并判断出样本的类别，方法如实施例1所述，并加入内标蛋白样品，一同进行检测。
结果表明，50例地中海贫血症患者中的49例被准确预测，50例正常组中的50例被准确预测，详见表5。
表5 验证样本预测结果
样本
例数
预测地贫组
预测正常组
预测率％
地贫组
50
49
1
98
正常组
50
0
50
100
从表5中可以看出验证样本的结果为：50例正常组中的50例判断正确，特异性100％；50例地中海贫血症组中的49例判断正确，敏感性为98％。
从表5中可以看出：本发明对于地中海贫血症组的盲选检测准确率基本相同于模型训练，但对于正常组的预测结果达到100％，说明在模型训练后的结果上，实验人员通过细微优化，即可充分有效排除假阳性结果，这说明其对于阳性结果的诊断结果真实可信，最大程度上避免了漏诊，因此具有积极意义。
作为进一步证明，同时评价本发明对于阳性和阴性测定结果的区分度，以假阳性概率为横轴，真阳性(即灵敏度)为纵轴，将不同阈值计算得到的灵敏度和假阴性率的交叉点连接成曲线图，从而绘制ROC曲线图。
ROC曲线图判断灵敏度的评价方法：ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。
结果如图7所示，本发明AOC曲线图最左上角的点为最佳诊断临界值点，其横坐标不到0.2，通过计算AUC>0.9，说明本发明具有很高的灵敏度和特异性，即说明通过细化优化可有效的排除假阳性结果。
实施例四、利用质谱模型筛选地中海贫血症的药物或治疗方法
征集10例地中海贫血症成人患者作为志愿者，按体重给药达贝泊汀α(Darbepoetin，DAR)4.0ug/kg，每周2次给药，共治疗8周。
另分别在清晨空腹下抽取抽取治疗前和治疗后的全血样本，分离全血后储存在-80℃低温冰箱中。
按照实施例1的方法和实施例2的质谱模型，对上述两例患者的血样，进行检测治疗前和治疗后的地中海贫血症的特征蛋白的质谱，结果如图8所示。
图8-1-A和8-1-B是患者1的治疗前后的特征蛋白质谱的对照图。其中8-A显示，β-珠蛋白的表达量有所下调，但出现了明显的γ-珠蛋白的表达代偿峰，说明该患者为较为严重的地中海贫血症患者。1-B显示β-珠蛋白的表达量持续下调，但γ-珠蛋白的表达代偿峰相比于初始的γ-珠蛋白的表达代偿峰，其相对表达上调量已经超过了0.1(相比于标准强度的15120m/z峰值)，这说明对患者1的给药达贝泊汀α，已经有效缓解了贫血症状。
图8-2-A和8-2-B是患者2的治疗后与治疗前的特征蛋白质谱的对照图。其中2-B显示，β-珠蛋白的表达量有所下调，但出现了一定的γ-珠蛋白的表达代偿峰，说明该患者为较不严重的地中海贫血症患者。2-A显示β-珠蛋白的表达量持续下调，但γ-珠蛋白的表达代偿峰相比于初始的γ-珠蛋白的表达代偿峰，其相对表达上调量已经超过了0.1(相比于标准强度的15120m/z峰值)，代偿的峰值已经远远了β-珠蛋白的下调值，这说明相比于对患者1给药，对患者2的给药达贝泊汀α，已经对贫血症状更为有效。
作为对照试验，将上述10例血样经血细胞分析检测，结果发现：
患者1的Hb上升提高了2.8g/dl，患者2的Hb上升提高了3.1g/dl，其余6例患者Hb上升也达到2.0-2.5g/dl,疗效与治疗前患者Hb及基础EPO水平相关，并且血红蛋白的增加量(>2.0-2.5g/dl)均超过了临床上药物对地中海贫血症具有疗效的判断标准。由此判定，达贝泊汀α是治疗地中海贫血症的有效药物。
作为进一步证明，选取5例标准地中海贫血症的血细胞进行培养后，通过CRISPR-Cas9系统编辑校正，然后瞬时质谱检测β-珠蛋白和γ-珠蛋白的基因编辑前后的表达量差异。结果如图9所示。
其中，
图9-1表明，通过基因编辑体外细胞后，细胞β-珠蛋白的表达量相对于编辑前有明显升高，γ-珠蛋白的表达量有所下降，说明β-珠蛋白的功能有所恢复；
图9-2表明，通过基因编辑体外细胞后，细胞β-珠蛋白的表达量相对于编辑前有明显升高，γ-珠蛋白的表达量变化不大，说明β-珠蛋白的恢复水平优于图9-1；
图9-3表明，通过基因编辑体外细胞后，细胞β-珠蛋白和γ-珠蛋白的表达量相对于编辑前有明显升高，说明红蛋白的功能恢复功能优于图9-2；
图9-4的结果类似于图9-1，图9-5的结果类似于图9-3。
此外，图9的所有结果中，β峰和γ峰的相对比例有着明显的差异，这进一步说明本发明联合内标蛋白的检测方法具有很高的灵敏度和特异性，通过细化优化可有效的排除假阳性结果。
综上，通过本发明的质谱模型，可以筛选对地中海贫血症产生疗效的药物或治疗方法。
虽然本发明还未进行人体的基因编辑治疗的诊断试验，但无论是现有的造血干细胞移植或服用药物，还是通过基因编辑法治疗地中海贫血症，其判断疗效的标准同样是通过检测血红蛋白的表达增加量。因此，基于相同的原理，本发明的利用所述标记物或质谱模型，也可用于评价对地中海贫血的治疗方法，其中所述治疗方法包括所述造血干细胞移植、基因编辑法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京毅新博创生物科技有限公司
<120> 用于质谱诊断地中海贫血症的特征蛋白标记组合物及其诊断产品
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 142
<212> PRT
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
20 25 30
Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp
35 40 45
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala
50 55 60
Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala
65 70 75 80
Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro
85 90 95
Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala
100 105 110
His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
115 120 125
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135 140
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp
1 5 10 15
Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu
20 25 30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
50 55 60
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
85 90 95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105 110
Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln
115 120 125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
130 135 140
Lys Tyr His
145
<210> 3
<211> 147
<212> PRT
<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Met Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp
1 5 10 15
Gly Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu
20 25 30
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn
35 40 45
Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His
50 55 60
Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ile Lys His Leu Asp
65 70 75 80
Asp Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
85 90 95
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105 110
Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ala Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Ala Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser
130 135 140
Arg Tyr His
145