阅读说明：本技术 一种d型肉毒毒素的微囊化制备方法 (Method for preparing D-type botulinum toxin through microencapsulation ) 是由 李志宁 陆艳 高岩 赵晓军 范玉霞 李生庆 张同作 邵峰 钟伟 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物农药技术领域,具体涉及一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法。该方法包括以下步骤：S1,每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1～5g的海藻糖,搅拌交联；S2,S1所得溶液中加入0.1～0.2g聚乙烯吡咯烷酮和明胶,静置8～18h后500～1000r/min搅拌45～90min；S3,S2所得溶液加入1～2g磷酸二氢钠,400～800r/min,搅拌15～45min；S4,S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90～100℃、出口温度60～80℃条件下喷雾干燥,干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊。本发明的优点：(1)提高了D型肉毒毒素对外界环境的耐受性,降低了毒素的包装、储存和冷链运输的要求。(2)制备工艺简单,无复杂和极端条件,易于推广。(3)自然条件储存,时间长,毒力损失小。(4)本发明制备的D型肉毒毒素微囊更稳定。(The invention belongs to the technical field of biological pesticides, and particularly relates to a microencapsulation preparation method of D-type botulinum toxin. The method comprises the following steps: s1, adding 1-5 g of trehalose into each 100mL of the botulinum toxin D solution, and stirring for crosslinking; s2, adding 0.1-0.2 g of polyvinylpyrrolidone and gelatin into the solution obtained in S1, standing for 8-18 h, and stirring at a speed of 500-1000 r/min for 45-90 min; s3, adding 1-2 g of sodium dihydrogen phosphate into the solution obtained in the S2 at a speed of 400-800 r/min, and stirring for 15-45 min; and S4, spray-drying the mixed solution prepared by the S3 under the conditions that the vacuum degree is 0.025mPa, the air inlet temperature is 90-100 ℃, and the outlet temperature is 60-80 ℃, and obtaining the dried powder, namely the D-type botulinum toxin microcapsule. The invention has the advantages that: (1) improves the tolerance of the botulinum toxin D to the external environment, and reduces the requirements of the toxin on packaging, storage and cold chain transportation. (2) The preparation process is simple, has no complex and extreme conditions, and is easy to popularize. (3) Natural storage, long storage time and low toxicity loss. (4) The botulinum toxin D microcapsule prepared by the invention is more stable.)

一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法。

背景技术

D型肉毒毒素是D型肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)在厌氧条件下发酵产生的蛋白质类神经毒素，因为鼠类对其敏感，作为一种生物灭鼠剂用于草地鼠害治理，作为是一种安全、高效、经济的生物灭鼠剂，其优点具有易降解、无残留、不污染环境、不伤害鼠类天敌。作为生物灭鼠剂，灭鼠效果在90％以上，在草原鼠害防治和生态环境保护中发挥着不可替代的作用。

由于D型肉毒毒素的大分子蛋白神经毒素，在常温条件下，D肉毒毒素的生物活性与其空间形态结构相关，特别是在外界不利环境下，很容易发生肉毒毒素变性。其易受温度、光照、pH值、紫外线照射及动物胃肠道环境等因素的影响，致使具有灭鼠效果的毒性成分降解，甚至失去毒性。因此对储运条件的要求较高，需低温冷冻保存及运输，无形中增加了毒素的生产成本，限制了毒素的使用季节和使用地域。

现已报到的D型肉毒毒素灭鼠剂主要有水剂、冻干剂和颗粒剂，其中水剂需要常年在-16℃的低温冷库中保存，冻干剂虽然具有常温保存的特点，但是其制作过程相当繁琐，且需要具备大型的冻干设备才能完成，耗时耗力。颗粒剂本身在加工制作工程中就存在大量的D型肉毒毒素由于产热而损失的弊端，毒素使用量是常规量的10倍，室温保存期2个月。

CN107540732A公开了一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，加工方法包括用甲基纤维素溶液、羧甲基纤维素钠溶液、含蔗糖的明胶溶液的混合物对D型肉毒毒素蛋白进行保护，得到的D型肉毒毒素核液经海藻酸钙保护壳膜包被，最后经精蛋白/氧化硅杂化壳壁包被，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒。该方法辅料使用多，工艺复杂，制备的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒虽然较水剂提升了D型肉毒毒素对温度的耐受性，降低了D型肉毒毒素储藏要求，经仿生矿化后的D型肉毒毒素矿化颗粒在室温下放置3个月毒力不变，半衰期5-6个月。

发明内容

本发明成功的克服了现有技术的缺陷，提供了一种即克服D型肉毒毒素冷冻储存的缺陷，又提高毒素对外界环境的耐受性和产品的稳定性，延长室温储运有效期的方法，实现了D型肉毒毒素室温保存2年，毒素毒力下降＜10％。

本发明采用的技术方案为：

一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，包括以下步骤：

S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1～5g的海藻糖，搅拌交联；

S2，S1所得溶液中加入0.1～0.2g聚乙烯吡咯烷酮和明胶，静置8～18h后500～1000r/min搅拌45～90min；

S3，S2所得溶液加入1～2g磷酸二氢钠，400～800r/min，搅拌15～45min；

S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90～100℃、出口温度60～80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊。

进一步的，所述的S1步骤中D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。

进一步的，所述的S2步骤中聚乙烯吡咯烷酮和明胶的比例为1:1。

进一步的，所述的S4步骤中，喷雾干燥进液量3～5mL/min。

进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。

进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊粒径1～15μm。

进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降≤10％。

本发明提供D型肉毒毒素的微囊化制备方法,对毒素蛋白毒理保护研究具有借鉴性。

本发明还提供D型肉毒毒素的微囊化制备方法生产的D型肉毒毒素微囊在灭鼠剂加工中的应用。

本发明提供的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，使用壁材成分简单，微囊化工艺简单，只需按步骤将D型肉毒毒素、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和磷酸二氢钠，通过交联混合均匀后，喷雾干燥即可；工艺中无复杂和极端条件，易于推广。

利用本发明提供的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法制备的D型肉毒毒素微囊，不仅实现了D型肉毒毒素由液态转变成为固态，同时在室温条件下贮存2年，毒力损失不超过10％，为D型肉毒毒素灭鼠剂的室温存储和运输提供了技术保障。

现有技术的微囊，通常是将芯材(功效组分、有效组分)用壁材物理包裹，隔绝芯材与外界环境的接触从而实现对芯材的保护。本发明提供的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，不同于传统微囊化技术，将本质为蛋白质的D型肉毒毒素(芯材)与海藻糖通过官能团取代而交联，海藻糖可替代水分子与蛋白质表面形成氢键维持其结构稳定，以维持毒素蛋白的活性。在干燥过程中海藻糖替代了蛋白质周围原来由水构成的氢键，彼此产生直接的作用。海藻糖不直接与蛋白质空间结构相互作用，而是优先与蛋白质表面的水分子结合，使蛋白质的溶剂化层半径减小，分子结构更紧密，构象更稳定，有利于抵御外界极端环境的影响。

因此，本发明采用以化学键链接交联和喷雾法，制备的D型肉毒毒素微囊更稳定，对芯材的保护也更有效。

本发明中添加聚乙烯吡咯烷(PVP)可以提高体系的玻璃化温度，在体系中发挥分散剂及热敏药物的稳定剂作用。明胶是亲水胶体，具备成膜性，而且也易溶于水，作为胶囊壁材使用。

本发明的D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其制作工艺简单、高效，相比冷冻干燥技术，无需要大型的冻干设备，省时、省力、节能。与传统的颗粒加工技术相比较，不仅极大地降低了加工过程中毒素的损失，毒素的投入和产出比为4:1，且毒素在室温下的保存期有了明显的延长。

与现有技术相比，本发明提供的D型肉毒毒素的微囊化制备方法的优点：

(1)明显提高了D型肉毒毒素对外界环境的耐受性，降低了D型肉毒毒素储藏避光、低温的要求，极大的降低了毒素的包装、储存和冷链运输的要求。

(2)制备工艺简单，无复杂和极端条件，易于推广。

(3)自然条件储存，时间长，毒力损失小。

(4)本发明制备的D型肉毒毒素微囊更稳定。

附图说明

图1是本发明提供的D型肉毒毒素微囊外观图。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。

一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，包括以下步骤：

S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1～5g的海藻糖交联；

S2，S1所得溶液中加入0.1～0.2g聚乙烯吡咯烷酮和明胶，静置8～18h后500～1000r/min搅拌45～90min；

S3，S2所得溶液加入1～2g磷酸二氢钠，400～800r/min，搅拌15～45min；

S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90～100℃、出口温度60～80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊。

进一步的，所述的S1步骤中D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。

进一步的，所述的S2步骤中聚乙烯吡咯烷酮和明胶的比例为1:1。

进一步的，所述的S4步骤中，喷雾干燥进液量3～5mL/min。

进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊的毒价为2000万MLD/100mg。

进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊粒径1～15μm。

进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降≤10％。

将上述制备的D型肉毒毒素微囊应用于产毒素蛋白毒理研究或者加工。

将上述制备的D型肉毒毒素微囊应用于灭鼠剂加工。

实施例1

S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1g的海藻糖交联；D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。

S2，S1所得溶液中加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮和明胶，静置8h后500r/min搅拌45min；聚乙烯吡咯烷酮和明胶的比例为1:1。

S3，S2所得溶液加入1g磷酸二氢钠，400r/min，搅拌15min；

S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90℃、出口温度60℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊；喷雾干燥进液量3mL/min。。

制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。

制备的D型肉毒毒素微囊粒径1μm。

制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降10％。

实施例2

S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入5g的海藻糖交联；D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。

S2，S1所得溶液中加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮和明胶，静置18h后1000r/min搅拌90min；所述的S2步骤中聚乙烯吡咯烷酮和明胶的比例为1:1。

S3，S2所得溶液加入2g磷酸二氢钠，800r/min，搅拌45min；

S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度100℃、出口温度80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊；喷雾干燥进液量5mL/min。。

制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。

制备的D型肉毒毒素微囊粒径15μm。

制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降8％。

实施例3

S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入3g的海藻糖交联；D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。

S2，S1所得溶液中加入0.15g聚乙烯吡咯烷酮和明胶，静置12h后800r/min搅拌60min；聚乙烯吡咯烷酮和明胶的比例为1:1。

S3，S2所得溶液加入1.5g磷酸二氢钠，600r/min，搅拌30min；

S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度95℃、出口温度70℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊；喷雾干燥进液量4mL/min。。

制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。

制备的D型肉毒毒素微囊粒径8μm。

制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降10％。

实施例4

微囊化D型肉毒毒素灭鼠粉剂毒力测定。

微囊化D型肉毒毒素灭鼠粉剂的稀释方法：取样品0.1g加入到10mL1％蛋白胨稀释液中，待完全溶解后，按10倍梯度稀释，至1000万倍的样品测试液。

微囊化D型肉毒毒素灭鼠粉剂毒力测定方法

小鼠腹腔测定法被公认为检测肉毒毒素最经典和灵敏的“金标准”。试验动物选用体重18～20g的昆明系小白鼠，将不同稀释度的毒素，每只小白鼠腹腔注射0.5mL，每个剂量组2只小白鼠。注射后，正常饲喂，观察4d。初步确定毒素的毒力范围。然后，在已确定的毒力范围内，统计小白鼠的死亡情况。分别腹腔注射小鼠各2只，每只0.5mL，观察和记录96h(4天)小鼠的发病和死亡情况。计算样品的最低致死量,评估样品中肉毒毒素毒力，等于小鼠全部死亡的最高样品试验液倍数乘以2，以该稀释度为基础稀释液，分级稀释，每个稀释梯度腹腔注射2只小白鼠，每只0.5mL。以小鼠全部死亡组的总稀释倍数×2，确定毒素的准确含量。(例如，在规定的观察时间内，腹腔注射100万倍稀释测试液组的小鼠全部死亡，而1000万倍稀释液测试组存活，则该样品的毒力为200万MLD/100mg以上)，说明样品的毒力在200万至2000万之间。然后再以100万倍稀释度的测试液为基础测试液，按(基础测试液:1％蛋白胨稀释液)分别以1:1(2倍)、1:2(3倍)、1:3(4倍)、1：4(5倍)、1:5(6倍)、1:6(7倍)、1:7(8倍)、1:8(9倍)、1:9(10倍)的比例分级稀释。各稀释度腹腔注射小鼠2只，每只0.5mL，观察和记录96h(4d)小鼠死亡情况。再以该稀释度乘以新的稀释倍数，然后再乘以2，即为样品在稀释前样品中的毒素含量，(例如，在规定的观察时间内，腹腔注射的小鼠在1:7稀释度全部死亡，而1:8稀释度的小鼠全部存活，则样品的毒力为：100万倍×8×2＝1600万MLD/100mg)。

室温留样试验

该试验是考察药物制剂稳定性的最可靠方法，也是必须考察的项目。首先用通过加速试验确定的配方，生产3个批次，将样品配制成相同浓度的样品，密封放置在自然室温存放条件下，分别观测0，1，2，3，6，12，18，24个月，定期测定毒力的变化，结果见表1。

室温留样测定毒力变化统计表

单位：万MLD/100mg

	微囊化粉剂	水剂
			0个月	2000	2000
3个月	2000	1500
			6个月	2000	1000
9个月	2000	600
			12个月	2000	400
18个月	1900	200
			24个月	1900	/

由试验结果可见：水剂在室温保存保存6个月毒力下降50％，微囊粉剂在室温条件下，毒力下降缓慢，保存2年毒力下降小于10％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。