阅读说明：本技术 一种新型的高分子纳米输送体系及其治疗神经损伤的制备方法 (Novel polymer nano delivery system and preparation method thereof for treating nerve injury ) 是由 张鲁中 姚珂 杨宇民 李贵才 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型的高分子纳米输送体系,所述高分子纳米输送体系是由具有树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物组成。其治疗神经损伤的制备方法如下：(1)细胞因子模拟肽的合成；(2)Lys-G4为核的树枝状炔基化聚β-氨基酯的合成；(3)细胞因子模拟肽偶联到树枝状炔基化聚β-氨基酯。本发明通过点击化学反应将细胞因子模拟肽与树枝状聚合物结合开发一种新型的高分子纳米输送体系来治疗神经损伤。可以实现较高的载药量,可控释放且具有靶向性,具有很高的临床应用价值。(The invention discloses a novel macromolecule nano conveying system which is composed of polylysine-polyethylene glycol block copolymer with a dendritic structure. The preparation method for treating nerve injury comprises the following steps: (1) synthesis of cytokine mimetic peptides; (2) synthesizing dendritic alkynyl poly-beta-amino ester taking Lys-G4 as core; (3) cytokine mimetic peptides were coupled to dendritically alkynylated poly- β -amino esters. The invention combines cytokine analogue peptide with dendritic polymer by click chemical reaction to develop a novel macromolecule nano-delivery system for treating nerve injury. Can realize higher drug loading, controllable release and targeting property, and has very high clinical application value.)

一种新型的高分子纳米输送体系及其治疗神经损伤的制备 方法

技术领域

本发明属于高分子纳米领域，具体涉及一种通过点击化学反应载有细胞因子模拟肽来治疗神经损伤的新型高分子纳米输送体系及其制备方法。

背景技术

神经系统是人体最重要系统的一部分。它是大脑信号传递的途径，并发挥重要作用。但是在高等哺乳动物的神经损伤后，再生和恢复的能力非常弱。如何有效准确地修复受损神经，成为研究的热点。

神经生长因子是一类由神经所支配的组织和胶质细胞所产生的，维持生存所必需的基本营养物质之外且对神经细胞起到特殊营养作用的蛋白质和多肽，但是它在体内不稳定、半衰期短、容易被蛋白水解酶水解、组织渗透能力差、免疫原性等缺点限制了其在临床上的应用，而细胞因子模拟肽的氨基酸序列主要来源于细胞因子，其结构清楚，作用机制明确，质量控制上接近小分子化学药物。它们能够与受体的靶点结合而具有细胞因子的生物活性，活性高，相比细胞因子更易于合成和结构改造，无或低抗原性，不易引起免疫反应等优点被广泛用于研究，但是多肽药物也存在着也容易降解，半衰期短，生物利用度差等缺点。因此以聚乙二醇为代表的水溶性聚合物修饰后的多肽能够有效的延长生物半衰期，增强稳定性，提高疗效且无免疫原性。

高分子纳米输送体系中，树枝状聚合物由于其分子尺寸可以精确控制，药动学和药理学性质重现性好，表面有高的官能团密度有利于进行聚合、智能、靶向等功能修饰，被广泛应用于纳米药物输送系统。点击化学反应旨在通过小单元的拼接来快速可靠地完成各色分子的化学组成，可以简单高效的获得分子多样性。

高分子纳米药物输送系统的研究为各种疾病的预防、诊断和治疗提供了新的思路。但是，目前高分子纳米载体还存在很多亟待解决的问题，比如线性高分子组装体难以实现对其尺寸、形貌、稳定性和表面性质的有效控制，给纳米药物输送系统在体内外生物学行为研究造成极大的困难。细胞营养因子作为疾病恢复的重要组成部分,它在体内不稳定、半衰期短、容易被蛋白水解酶水解、组织渗透能力差、免疫原性等缺点限制了其在临床上的应用。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种通过点击化学反应将细胞因子模拟肽与树枝状聚合物相连作为一种新型的高分子纳米输送体系治疗神经损伤。

技术方案：本发明提供了一种新型的高分子纳米输送体系，所述高分子纳米输送体系是由具有树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物组成。

进一步的，载有细胞因子模拟肽的树枝状聚合物为通过将细胞因子模拟肽连上叠氮，将聚乙二醇连上炔基，在铜离子催化下，叠氮和炔基之间的点击化学反应来将细胞因子模拟肽连接上去，其中，细胞因子模拟肽和聚乙二醇的比例为1:4。

一种所述的新型的高分子纳米输送体系治疗神经损伤的制备方法，包括如下步骤：

(1)细胞因子模拟肽的合成

所述的细胞因子模拟肽是通过固相合成技术，以Fmoc化学策略制备含有叠氮基团的细胞因子模拟肽；

(2)Lys-G4为核的树枝状炔基化聚β-氨基酯的合成

聚乙二醇丙烯酸酯与炔丙胺发生Michael加成反应的炔基化的含有聚乙二醇的聚β-氨基酯；以1,2-双(2-氨基乙氧基)乙烷和Boc保护的赖氨酸为起始原料，通过发散合成法的酰胺化反应构建赖氨酸的树枝状分子Lys-G4；Lys-G4末端的氨基与聚β-氨基酯端基的丙烯酸酯发生Michael加成反应得到Lys-G4为核的树枝状炔基化聚β-氨基酯；

(3)细胞因子模拟肽偶联到树枝状炔基化聚β-氨基酯

通过点击化学反应将细胞因子模拟肽偶联到树枝状炔基化聚β-氨基酯。

进一步的，所述的细胞因子模拟肽的合成的具体操作如下：步骤1：(1)2-氯-三苯甲基氯树脂在固相反应管二氯甲烷溶胀；(2)氨基酸缩合，加入Fmoc-D-Pro-OH和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(3)甲醇封闭未反应的树脂；(4)脱Fmoc保护，加入20％哌DMF溶液反应30min；(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(6)重复步骤(4-5)，依次进行Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-azidolysine氨基酸缩合；(7)用三氟乙醇裂解液将氨基酸序列从树脂切下来；(8)环化氨基酸，加入HATU和DIEA的DMF溶液，并室温反应2h；(9)去除保护基，用TFA/TIPS/H₂O去除保护基；(10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的脑源性神经营养因子(BDNF)模拟肽。

进一步的，所述的DIEA，HBTU用量皆为氨基酸摩尔量的两倍，TFA/TIPS/H₂O的比例为38:1:1，反向高效液相色谱柱为18C柱，流动相为乙腈和水。

进一步的，所述的Lys-G4为核的树枝状炔基化聚β-氨基酯的合成的具体操作如下：

a.氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯(2.124g,3.54mmol)，炔丙胺(0.165g,3.54mmol)搅拌溶解在10mL氯仿中；反应数天后经无水***沉淀得到炔基化的聚β-氨基酯；

b.在HBTU和HOBt为缩合剂的条件下，1,2-双(2-氨基乙氧基)乙烷和(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸发生酰胺化反应得到Lys-G1Boc4；在三氟乙酸条件下，脱除Boc保护基，逐级发生酰胺化反应得到Lys-G4Boc32，最后再用三氟乙酸脱除保护基团得到Lys-G4；

c.Lys-G4溶解于二甲亚砜溶液，并缓慢加入炔基化聚β-氨基酯的二甲亚砜溶液中；在50摄氏度条件下，搅拌反应2天得到Lys-G4为核的树枝状炔基化聚β-氨基酯。

进一步的，所述的a.得到炔基化的聚β-氨基酯反应中，在反应为50℃反应6h，80℃反应12h，90℃反应24h。

进一步的，所述的b.酰胺化反应中反应温度为室温，反应时间为每次2h。

进一步的，所述的细胞因子模拟肽偶联到树枝状炔基化聚β-氨基酯的具体操作如下：树枝状炔基化聚β-氨基酯端基双键，与巯基化罗丹明(Rho-SH)发生Michaels加成反应得到Rho偶联的树枝状炔基化聚β-氨基酯；在铜离子催化条件下，与带有叠氮的BDNF模拟肽cyclo(DPRKK-N3)发生Click化学反应得到偶联有多肽的聚β-氨基酯。

进一步的，所述的铜离子浓度为3.4mg/ml，反应时间为2h，将收集到的产物透析冻干。

有益效果：本发明提供了一种将多肽和聚乙二醇通过点击化学反应来连接作为一种新型的高分子纳米输送体系治疗神经损伤，其中，聚β-氨基酯中的聚乙二醇能够延长模拟肽的半衰期，且树枝状的聚β-氨基酯生物相容好，可降解性好，结构可控性好，药动学和药理学重现性好。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本发明通过将多肽连上叠氮基团，将聚乙二醇连上炔丙胺，通过叠氮和炔基之间的点击化学反应来将细胞因子模拟肽连上树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物作为一种新型的高分子纳米输送体系治疗神经损伤的制备方法，具体步骤如下：

步骤1：(1)2-氯-三苯甲基氯树脂在固相反应管二氯甲烷溶胀；(2)氨基酸缩合，加入Fmoc-D-Pro-OH和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(3)甲醇封闭未反应的树脂；(4)脱Fmoc保护，加入20％哌DMF溶液反应30min；(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(6)重复步骤(4-5)，依次进行Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-azidolysine氨基酸缩合；(7)用三氟乙醇裂解液将氨基酸序列从树脂切下来；(8)环化氨基酸，加入HATU和DIEA的DMF溶液，并室温反应2h；(9)去除保护基，用TFA/TIPS/H2O去除保护基；(10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的脑源性神经营养因子(BDNF)模拟肽。

其中，DIEA，HBTU用量皆为氨基酸摩尔量的两倍，TFA/TIPS/H2O的比例为38:1:1，反向高效液相色谱柱为18C柱，流动相为乙腈和水。

步骤2：氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯(2.124g,3.54mmol)，炔丙胺(0.165g,3.54mmol)搅拌溶解在10mL氯仿中。反应数天后经无水***沉淀得到炔基化的聚β-氨基酯。其中，在反应为50℃反应6h，80℃中反应12h，90℃中反应24h。

步骤3：在HBTU和HOBt为缩合剂的条件下，1,2-双(2-氨基乙氧基)乙烷和(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸发生酰胺化反应得到Lys-G1Boc4。在三氟乙酸条件下，脱除Boc保护基，逐级发生酰胺化反应得到Lys-G4Boc32，最后再用三氟乙酸脱除保护基团得到Lys-G4。其中，反应温度为室温，反应时间为每次2h。

步骤4：Lys-G4溶解于二甲亚砜溶液，并缓慢加入炔基化聚β-氨基酯的二甲亚砜溶液中。在50摄氏度条件下，搅拌反应2天得到Lys-G4为核的树枝状炔基化聚β-氨基酯。

步骤5：树枝状炔基化聚β-氨基酯端基双键，与巯基化罗丹明(Rho-SH)发生Michaels加成反应得到Rho偶联的树枝状炔基化聚β-氨基酯。在铜离子催化条件下，与带有叠氮的BDNF模拟肽cyclo(DPRKK-N3)发生Click化学反应得到偶联有多肽的聚β-氨基酯。其中，加入的铜离子浓度为3.4mg/ml，反应时间为2h，将收集到的产物透析冻干。

具体实施例1：

步骤1：(1)取2-氯-三苯甲基氯树脂1.0g溶胀；(2)氨基酸缩合，加入Fmoc-Arg-OH(2eq)和DIEA(4eq)的DMF溶液，室温反应2h；(3)甲醇封闭未反应的树脂；(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶DMF溶液反应30min；(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-Trp-OH，HBTU(4eq)和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(6)重复步骤(4)-(5)，依次进行Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln-OH，Fmoc-Lys-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asp-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Thr-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr-OH和Fmoc-azidolysine氨基酸缩合；(9)去除保护基，用TFA/TIPS/H2O去除保护基；(10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的神经生长因子(NGF)模拟肽。得到产物约500mg。

步骤2：氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯(2.124g,3.54mmol)，炔丙胺(0.165g,3.54mmol)搅拌溶解在10mL水中。50℃反应6h，90℃反应12h后经无水***沉淀得到炔基化的聚β-氨基酯。

步骤3：树枝状炔基化聚β-氨基酯端基双键(0.696mmol)，与巯基化罗丹明(Rho-SH)发生Michaels加成反应得到Rho偶联的树枝状炔基化聚β-氨基酯。铜离子催化条件(0.0087mmol)，与带有叠氮的NGF模拟肽(N3-TFVKALTMDGKQAAWR)(0.174mmol)发生Click化学反应得到偶联有多肽的聚β-氨基酯。

步骤4：将联有多肽的聚β-氨基酯溶解在灭菌水中，分别以不同浓度加入到背跟神经节中，共聚焦观察神经纤维丝的生长情况。

经测试，该偶联NGF模拟肽的聚β-氨基酯有明显的促进背跟神经节纤维丝的生长作用。

具体实施例2：

步骤1：(1)取2-氯-三苯甲基氯树脂1.0g溶胀；(2)氨基酸缩合，加入Fmoc-Arg-OH(2eq)和DIEA(4eq)的DMF溶液，室温反应2h；(3)甲醇封闭未反应的树脂；(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶DMF溶液反应30min；(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-Ser-OH，HBTU(4eq)和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(6)重复步骤(4)-(5)，依次进行Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr-OH和Fmoc-azidolysine氨基酸缩合；(9)去除保护基，用TFA/TIPS/H2O去除保护基；(10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的视黄酸(YIGSR)模拟肽，得到产物约500mg。

步骤2：氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯(2.124g,3.54mmol)，炔丙胺(0.165g,3.54mmol)搅拌溶解在10mL水中。50℃反应6h，90℃反应12h后经无水***沉淀得到炔基化的聚β-氨基酯。

步骤3：树枝状炔基化聚β-氨基酯端基双键(0.696mmol)，与巯基化罗丹明(Rho-SH)发生Michaels加成反应得到Rho偶联的树枝状炔基化聚β-氨基酯。铜离子催化条件(0.0087mmol)，与带有叠氮的视黄酸模拟肽(YIGSR)(0.174mmol)发生Click化学反应得到偶联有多肽的聚β-氨基酯。

步骤4：将联有多肽的聚β-氨基酯溶解在灭菌水中，分别以不同浓度加入到背根神经节中，共聚焦观察神经纤维丝的生长情况并测试其增殖情况。

经测试，该偶联视黄酸模拟肽的聚β-氨基酯有明显的促进背跟神经节纤维丝的生长作用且对施旺细胞有明显的增殖作用。

具体实施例3：

步骤1：(1)取2-氯-三苯甲基氯树脂1.0g溶胀；(2)氨基酸缩合，加入Fmoc-Phe-OH(2eq)和DIEA(4eq)的DMF溶液，室温反应2h；(3)甲醇封闭未反应的树脂；(4)脱Fmoc保护，加入20％哌啶DMF溶液反应30min；(5)氨基酸缩合，加入Fmoc-Phe-OH，HBTU(4eq)和DIEA的DMF溶液，室温反应2h；(6)重复步骤(4)-(5)，依次进行布洛芬和Fmoc-azidolysine氨基酸缩合；(9)去除保护基，用TFA/TIPS/H2O去除保护基；(10)粗产品经反相高效液相色谱分离纯化得到带有叠氮的布洛芬，得到产物约500mg。

步骤2：氮气保护条件下，聚乙二醇丙烯酸酯(2.124g,3.54mmol)，炔丙胺(0.165g,3.54mmol)搅拌溶解在10mL水中。50℃反应6h，90℃反应12h后经无水***沉淀得到炔基化的聚β-氨基酯。

步骤3：树枝状炔基化聚β-氨基酯端基双键(0.696mmol)，与巯基化罗丹明(Rho-SH)发生Michaels加成反应得到Rho偶联的树枝状炔基化聚β-氨基酯。铜离子催化条件(0.0087mmol)，与带有叠氮的布洛芬(0.174mmol)发生Click化学反应得到偶联有布洛芬的聚β-氨基酯。

步骤4：将联有布洛芬的聚β-氨基酯溶解在灭菌水中，分别以不同浓度加入到成纤维细胞中，检测其生物毒性。

经测试，该偶联布洛芬的聚β-氨基酯对成纤维细胞的毒性作用明显降低。

本发明通过将多肽连上叠氮基团，将聚乙二醇连上炔丙胺，通过叠氮和炔基之间的点击化学反应来将细胞因子模拟肽连上树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物作为一种新型的高分子纳米输送体系，在临床上有较高的应用价值。

以上所述实施例仅用于对本发明的进一步说明，应当指出，对于本领域技术人员，在本发明构思的基础上所做的改进和完善也视为在本发明保护范围内。