阅读说明：本技术 一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法及在生物分子修饰中的应用 (Synthesis method of dihydrothiazole heterocyclic compound and application of dihydrothiazole heterocyclic compound in modification of biological molecules ) 是由 吴川六 李卓儒 高巍 郑晓莉 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法及在生物分子修饰中的应用,涉及有机合成技术领域。将硫烯醚化合物和含1,2-巯基乙胺骨架结构化合物在溶剂中混合,加入弱碱进行反应,反应温度为20～60℃,反应时间为60～240min,即得到二氢噻唑杂环化合物。所述二氢噻唑杂环化合物的合成方法,温和、高效,可以在室温及水中快速反应,克服传统合成方法中反应条件剧烈、时间长等缺点；利用该合成方法,可以高效、精准地对含有氮端半胱氨酸残基的生物分子如多肽及蛋白进行修饰,并进一步开发检测和治疗方法等应用。(A synthetic method of a dihydrothiazole heterocyclic compound and application thereof in biomolecule modification, relating to the technical field of organic synthesis. Mixing a thioether compound and a compound containing a 1, 2-mercaptoethylamine skeleton structure in a solvent, adding a weak base to react at the temperature of 20-60 ℃ for 60-240 min, and obtaining the dihydrothiazole heterocyclic compound. The synthesis method of the dihydrothiazole heterocyclic compound is mild and efficient, can quickly react at room temperature and in water, and overcomes the defects of violent reaction conditions, long time and the like in the traditional synthesis method; by utilizing the synthesis method, biomolecules containing the nitrogen-terminal cysteine residue, such as polypeptide and protein, can be modified efficiently and accurately, and further, the detection and treatment methods and other applications can be developed.)

一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法及在生物分子修饰中的 应用

技术领域

本发明涉及有机合成技术领域，尤其涉及一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法及在生物分子修饰中的应用。

背景技术

二氢噻唑杂环常见于生物相关的小分子中，如萤火虫荧光素(Luciferin)、Desferrithiocin、Micacocidin等(参见SYNTHESIS 2013,45,2763)。该结构具有良好的生物相容性，且由于其独特的杂环结构，其具有参与生物反应、调控生命过程的功能，而且具有独特的药用价值(参见J.Am.Chem.Soc.1963,85,337)。此外通过进一步反应，可以利用二氢噻唑得到噻唑结构，以合成具有噻唑杂环的药物(参见J.Med.Chem.2011,54,4678)。

合成二氢噻唑杂环通常需要长时间且剧烈的条件。二氢噻唑杂环结构可以使用氰基与半胱氨酸在水中(参见J.Med.Chem.1999,42,2432)反应得到，在该条件下反应通常需要3～7天时间。Maltsev等人(参见SYNTHESIS 2013,45,2763–2767)进一步优化了反应条件，通过使用甲醇回流的方法，反应可以在12～24h内完成。对于以上方法，许多具有生物活性的结构都会在反应中逐渐失去活性。这使得以上方法仅能用于小分子药物的合成中，人们难以将二氢噻唑杂环与现有的生物活性结构结合，以在现有的生物活性结构的基础上进一步开发具有二氢噻唑杂环的改进化合物。

在现有方法中，能够温和且高效地得到二氢噻唑杂环结构的方法是2-甲腈苯并噻唑(CBT)与半胱氨酸的反应(参见Angew Chem Int Ed Engl.2009,48(51),9658)，该反应可以在温和生理条件下发生，且该反应快速高效，当反应物浓度在微摩尔每升的情况下，仍能在约1h内完成反应。此外，该反应专一性好，不易受体系中的其他物质干扰。该反应的以上特点使其不仅可以作为得到二氢噻唑杂环结构的一种方法，还可以作为一种高效的反应应用于各种生物体系的标记与修饰中。

生物体系是当今化学及生命科学研究的重点。对生物分子的标记和修饰对于研究和应用都具有重要意义，其是探索自然系统，创造治疗药剂及创造新的生物分子的重要工具。为了快速、高效且温和地进行标记或修饰生物分子，人们发展了一系列反应。这些反应通常具有以下特点：具有好的化学选择性及区域选择性，能够在常温及水溶液中快速进行(<37℃,pH6-8水溶液)。前述的CBT与半胱氨酸的反应也属于此类反应，该反应可以对蛋白质氮端的半胱氨酸进行特异性地修饰。此外，叠氮-炔环加成反应、施陶丁格反应等的也是常用的反应(参见Angew.Chem.Int.Ed.41,2596、Science 287,2007)。这些面向天然或非天然氨基酸的现有的修饰方法已经组成了一个较为成熟且系统的工具箱。相较于单纯地对生物分子进行修饰，人们更期望，新的方法可以比已有工具具有更多的优点，如修饰的结构可以更好地模拟生物体中已有的结构，更快地修饰速率，生物体内反应性及更环保经济等(参见Nature Comm.5,4740)。

发明内容

本发明的目的在于解决目前制备二氢噻唑杂环化合物的反应条件苛刻，而且缺乏高效且自然的修饰方法等技术问题，提供一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法及在生物分子修饰中的应用，烯硫醚化合物与含1,2-巯基乙胺骨架结构化合物可在室温下水溶液反应生成具有二氢噻唑杂环骨架结构化合物，利用该反应基于烯硫醚化合物骨架及修饰基团对氮端含有半胱氨酸残基的生物分子如多肽或蛋白质进行修饰。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法，将硫烯醚化合物和含1,2-巯基乙胺骨架结构化合物在溶剂中混合，加入弱碱进行反应，经萃取及旋蒸，即可得到二氢噻唑杂环化合物；反应温度为20～60℃，反应时间为60～240min。

上述二氢噻唑杂环化合物的合成方法，所述硫烯醚化合物，结构通式如下：

其中，X为硫或氧，R₁为除巯基、氨基取代基外任选取代或未取代的烷基链、烷氧基链、环烷基或芳基；R₂为除巯基、氨基取代基外任选取代或未取代的苯基；

所述含1,2-巯基乙胺骨架结构化合物，结构通式如下：

其中，R₃为氢或任意取代基团。

所述硫烯醚化合物与含1,2-巯基乙胺骨架结构化合物的摩尔比为1:(1～2)。优选地，所述硫烯醚化合物与含1,2-巯基乙胺骨架结构化合物的摩尔比为1:1。

所述溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种；所述弱碱包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸缓冲液、三乙胺中的至少一种。

优选地，所述溶剂为水与乙腈的混合溶剂，体积比为1:1；所述弱碱为碳酸氢钠。

一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法在生物分子修饰中的应用，将硫烯醚化合物与氮端含有半胱氨酸残基的生物分子如多肽或蛋白质在弱碱环境下混合反应，即可得到经二氢噻唑杂环骨架连接的修饰生物分子。

上述二氢噻唑杂环化合物的合成方法在生物分子修饰中的应用，硫烯醚化合物的结构通式如下：

其中，X为硫或氧，R₁为除巯基、氨基取代基外任选取代或未取代的烷基链、烷氧基链、环烷基或芳基；R₂为除巯基、氨基取代基外任选取代或未取代的苯基；Y为通过共价键与R₂连接的染料、药物、功能生物分子；硫烯醚化合物与待修饰的生物分子的摩尔比为(1～100):1。

上述二氢噻唑杂环化合物的合成方法在生物分子修饰中的应用，优选地，所述弱碱为磷酸缓冲溶液，pH为7.4，反应温度为25～37℃，反应时间为60min～720min。

相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：

本发明所述二氢噻唑杂环化合物的合成方法，温和、高效，可以在室温及水中快速反应，克服传统合成方法中反应条件剧烈、时间长等缺点；该方法所用原料绿色、经济，不涉及金属催化剂，对环境友好，符合绿色化学的理念。基于该合成方法，本发明提供一种温和、高效的生物分子修饰方法，利用该修饰方法可以高效、精准地对含有氮端半胱氨酸结构的生物分子如多肽及蛋白进行修饰，得到标记或功能化的生物分子，以进一步开发检测及治疗等应用。

附图说明

图1为本发明的反应及修饰方法示意图；

图2为本发明应用于生物分子修饰方法的示意图；

图3为生物分子修饰方法的高效液相色谱表征图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。

如图1所示，将具有1,2-巯基乙胺骨架结构的有机或生物分子和硫烯醚化合物在弱碱性水相环境下混合，在室温下，反应一段时间，即可得到二氢噻唑杂环分子或修饰的生物分子。

实施例1

硫烯醚化合物的合成，包括以下3个步骤。

步骤1、化合物methyl 4-(2,2-dicyano-1-hydroxyvinyl)benzoate的合成

具体步骤如下：

(1)将氢化钠(1.8g,75.0mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃(30mL)分散，氮气氛围保护下于0℃冰浴剧烈搅拌；将丙二腈(2.5g,37.5mmol)溶于无水四氢呋喃(30mL)中，缓慢滴加入以上体系中；反应体系保持0℃冰浴，滴加结束后于冰浴搅拌反应1h。

(2)将4-氯甲酰基苯甲酸甲酯(7.5g,37.5mmol)溶于无水四氢呋喃中(30mL)；保持0℃冰浴的同时，将该溶液缓慢滴加入体系中；在滴加结束后，将反应体系转移到室温，让其缓慢升温至室温，室温下搅拌反应1h。

(3)以减压蒸馏除去体系中的四氢呋喃；边搅拌边缓慢地向残余物中加入冰水，待残余物分散后，加入浓盐酸，调节pH为1～2；加入乙酸乙酯(3×100mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(3×50mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到浅黄色固体(6.9g)，收率为81％。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ7.98–7.91(m,2H),7.69–7.64(m,2H),3.87(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ186.90,166.34,145.21,130.67,129.14,127.81,122.76,121.28,52.68,47.91.

ESI-MS(m/z):calculated for C₁₂H₈N₂O₃[M-H]^-:229.1；found,228.6.

步骤2、化合物4-(2,2-dicyano-1-hydroxyvinyl)benzoic acid的合成

将上步反应所得化合物(0.5g,2.2mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，冰浴下缓慢滴加入溶于水(10mL)的氢氧化钠(0.18g,4.4mmol)，去除冰浴升至室温，搅拌反应4h；以减压蒸馏除去体系中的四氢呋喃，加入水(20mL)，并以乙酸乙酯(3×10mL)洗涤；加入盐酸(1mol/L)调节pH为1～2，加入乙酸乙酯(3×20mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(20mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到浅黄色固体(395.4mg)，收率为84％。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ13.04(br s,1H),7.92(d,J＝8.3Hz,2H),7.63(d,J＝8.4Hz,2H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ187.10,167.37,144.83,131.89,129.24,127.63,122.83,121.34,47.84.

ESI-MS(m/z):calculated for C₁₁H₆N₂O₃[M-H]^-:213.0；found,213.1.

步骤3、化合物4-(2,2-dicyano-1-(ethylthio)vinyl)benzoic acid的合成

将上步反应所得化合物(0.21g,1.0mmol)溶于乙腈(30mL)，加入五氯化磷(0.6g,3.0mmol,3.0equiv.)；在氮气氛围中，于50℃搅拌反应6h；冷却至室温，减压蒸馏浓缩；残余物溶于二氯甲烷(60mL)，先后以水(3×20mL)及饱和食盐水(20mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到浅黄色固体粉末。

将黄色固体溶于乙腈与水的混合液中(乙腈:水＝1:1,10mL)，于室温搅拌30min；之后，依次加入乙硫醇(86μL,1.2mmol)及碳酸氢钠(0.26g,3.0mmol)，于室温搅拌反应2h，使用盐酸(1mol/L)调节pH为4～5，以减压蒸馏除去体系中的乙腈，之后加入饱和食盐水(15mL)；加入乙酸乙酯(3×20mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(20mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到粗产品。经过高效液相色谱分析，纯度大于90％。粗产品经柱层析(硅胶,甲醇:二氯甲烷＝1:10)纯化得到黄色固体粉末(118.1mg)，收率为45％。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ13.54–13.33(br s,1H),8.13(d,J＝8.5Hz,2H),7.69(d,J＝8.5Hz,2H),2.74(q,J＝7.4Hz,2H),1.05(t,J＝7.4Hz,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ182.19,167.01,136.58,134.59,130.44,129.08,113.26,112.94,79.25,29.17,14.83.

ESI-MS(m/z):calculated for C₁₃H₁₀N₂O₂S[M-H]^-:257.0；found,256.8.

实施例2

将反应分子(0.2mmol,1.0equiv.)溶于乙腈与水的混合液中(乙腈:水＝1:1,4mL)，加入L-半胱氨酸(36.0mg,0.3mmol,1.5equiv.)及碳酸氢钠(51.6mg,0.6mmol,3.0equiv.)，于室温搅拌反应特定时间。加入水(20mL)进行稀释，加入盐酸(1mol/L)调节pH为1～2。加入乙酸乙酯(3×15mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(10mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩。残余物经柱层析(硅胶,甲醇:二氯甲烷＝1:10)纯化得到白色固体粉末。如表1所示，为不同的反应分子的表征数据结果。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.91(br s,1H),7.84–7.77(m,2H),7.59–7.55(m,1H),7.52–7.48(m,2H),5.31(dd,J＝9.5,8.1Hz,1H),3.75–3.61(m,2H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ172.22,168.77,132.79,132.25,129.32,128.58,78.81,35.41.

ESI(m/z):calculated for C₁₀H₉NO₂S[M+H]⁺:208.0；found,208.0.

表1

实施例3

将反应分子(0.2mmol,1.0equiv.)溶于乙腈与水的混合液中(乙腈:水＝1:1,4mL)中，加入L-半胱氨酸(36.0mg,0.3mmol,1.5equiv.)及碳酸氢钠(69.0mg,0.8mmol,4.0equiv.)，于室温搅拌反应特定时间。加入水(20mL)进行稀释，加入盐酸(1mol/L)调节pH为1～2。加入乙酸乙酯(3×15mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(10mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩。残余物经柱层析(硅胶,甲醇:二氯甲烷＝1:6)纯化得到白色固体粉末。如表2所示，为不同的反应分子的表征数据结果。

ESI(m/z):calculated for C₁₁H₉NO₄S[M+H]⁺:252.0；found,252.0.

表2

实施例4

将二肽(0.1mmol,1.0equiv.)加入至磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L,5mL)，之后加入溶于乙腈(1mL)的反应分子(0.1mmol,1.0equiv.)，于室温搅拌反应2h。加入盐酸(1mol/L)调节pH至酸性，以减压蒸馏除去体系中的乙腈，加入饱和食盐水(10mL)稀释。加入乙酸乙酯(3×20mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(10mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，残余物使用制备薄层色谱板分离，以质谱表征并测定收率。如表3所示，为实施例4中反应的表征数据

表3

实施例5

多肽的修饰

将反应分子母液(500μmol/L,20μL)与多肽母液(500μmol/L,10μL)加入至磷酸缓冲液(pH＝7.4,200mmol/L,50μL)中，并补充水(20μL)。最终体系中各组分浓度为：反应分子(100μmol/L)、多肽(50μmol/L)及磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L)。将体系置于室温下反应60min。

当多肽含有多个半胱氨酸时，加入N-乙酰-L-半胱氨酸，方法如下：将反应分子母液(500μmol/L,20μL)、多肽母液(500μmol/L,10μL)与N-乙酰-L-半胱氨酸(5mmol/L,4μL)加入至磷酸缓冲液(pH＝7.4,200mmol/L,50μL)中，并补充水(16μL)。最终体系中各组分浓度为：反应分子(100μmol/L)、多肽(50μmol/L)、N-乙酰-L-半胱氨酸(200μmol/L)及磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L)。将体系置于室温下反应60min。

根据高效液相色谱定量，多肽的转化率为100％，以质谱表征产物，如表4所示，为实施例5中反应的表征数据。

表4

实施例6

以下例举两种修饰组合物的合成。

1、第一种修饰组合物的合成

步骤1、化合物(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-(2,2-dicyano-1-(ethylthio)vinyl)benzoate)的合成

将化合物(4-(2,2-dicyano-1-(ethylthio)vinyl)benzoic acid)(65.0mg,0.25mmol,1.0equiv.)溶于乙腈(2mL)，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(34.5mg,0.3mmol,1.2equiv.)及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(58.0mg,0.3mmol,1.2equiv.)。室温下搅拌反应1h，高效液相色谱跟踪原料消耗完毕后，减压蒸馏浓缩。残余物经柱层析(硅胶,甲醇:二氯甲烷＝1:10)纯化得到淡黄色固体粉末(81.0mg)，收率为91％。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.31(d,J＝8.4Hz,2H),7.85(d,J＝8.4Hz,2H),2.92(s,4H),2.75(q,J＝7.4Hz,2H),1.07(t,J＝7.4Hz,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ181.23,170.63,161.50,139.27,131.30,129.95,127.48,113.09,112.77,79.88,29.20,26.05,14.86.

ESI-MS(m/z):calculated for C1₇H₁₃N₃O₄S[M+H]⁺:356.1；found,355.4.

步骤2、化合物N-(9-(2-(4-(4-(2,2-dicyano-1-(ethylthio)vinyl)benzamido)piperidine-1-car-bonyl)phenyl)-6-(diethylamino)-3H-xanthen-3-ylidene)-N-ethylethanaminium chloride的合成

将罗丹明B(0.1g,0.2mmol,1.0equiv.)溶于二氯甲烷(20mL)，依次加入4-N-叔丁氧羰基氨基哌啶(0.1g,0.5mmol,2.4equiv.)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.1g,0.5mmol,2.4equiv.)及4-二甲氨基吡啶(DMAP,10.0mg,0.08mmol,0.4equiv.)。室温下搅拌反应36h，减压蒸馏浓缩。残余物经柱层析(硅胶,甲醇:二氯甲烷＝1:10)纯化得到紫色固体粉末(40.0mg)，收率为30％。

将上步产物(40.0mg,0.06mmol)溶于少量乙酸乙酯(2mL)，加入氯化氢乙酸乙酯溶液(4mol/L,1.8mL,7.2mmol,120.0equiv.)，室温搅拌反应1h。以减压蒸馏浓缩，反复加入乙酸乙酯(3×5mL)并浓缩，以共沸除去体系中的氯化氢。残余物经过真空干燥后得到紫色固体粉末，直接进行之后反应。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.58(s,3H),7.85–7.69(m,2H),7.66–7.44(m,2H),7.20–7.05(m,4H),6.94(s,2H),4.06(d,J＝13.2Hz,1H),3.82–3.52(m,9H),3.23–3.13(m,1H),3.10–2.95(m,1H),2.63–2.52(m,1H),1.99–1.84(m,2H),1.62–1.33(m,2H),1.21(t,J＝7.0Hz,12H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ166.93,157.48,155.81,155.67,155.55,135.97,132.29,132.01,130.96,130.89,130.38,130.12,127.34,114.93,114.59,113.58,113.22,96.36,47.51,45.89,45.86,45.68,30.11,29.38,12.97.

ESI-MS(m/z):calculated for C₃₃H₄₂Cl₂N₄O₂[M-Cl]⁺:561.3；found,561.3.

步骤3、将脱除叔丁氧羰基的罗丹明分子(10.0mg,0.016mmol,1.0equiv.)溶于磷酸缓冲液(pH＝8.0,100mmol/L,1mL)中，将溶于乙腈(1mL)的化合物15(5.3mg,0.016mmol,1.0equiv.)加入体系，于室温搅拌3h。之后使用半制备型高效液相色谱纯化，得到紫色固体粉末。

ESI-MS(m/z):calculated for C₄₆H₄₉ClN₆O₃S[M-Cl]⁺:765.3；found,765.3.

2、第二种修饰组合物的合成

步骤1、化合物N-acetyl-S-(2,2-dicyano-1-(4-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)ethyl)carbamoyl)phenyl)vinyl)-L-cysteine的合成

将D-生物素(0.3g,1.2mmol,1.0equiv.)分散于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)，加热至固体全部溶解。依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.17g,1.4mmol,1.2equiv.)及N,N'-二环己基碳二亚胺(0.28g,1.4mmol,1.2equiv.)。于室温下搅拌反应24h。过滤除去固体沉淀，之后减压蒸馏浓缩。向残余物加入***(10mL)并超声，得到白色沉淀。使用离心沉降沉淀，并去除***。将沉淀重新分散于乙醇中，并反复分散及离心3次以洗涤沉淀。经过真空干燥后，得到白色固体(0.40g)，收率94％。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ6.43(s,1H),6.37(s,1H),4.35–4.28(m,1H),4.15(ddd,J＝7.7,4.4,1.8Hz,1H),3.11(ddd,J＝8.3,6.4,4.4Hz,1H),2.87–2.76(m,6H),2.70–2.65(m,2H),2.59(d,J＝12.4Hz,1H),1.67–1.42(m,6H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ170.71,169.38,163.13,61.45,59.63,55.69,30.47,28.30,28.04,25.91,24.77.

ESI-MS(m/z):calculated for C₁₄H₁₉N₃O₅S[M+H]⁺:342.1；found,342.1.

步骤2、将上步产物(0.12g,0.36mmol,1.0equiv.)溶于分散于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，加热至固体全部溶解。加入乙二胺(0.5mL,3.6mmol,20.0equiv.)，于室温搅拌反应2h。加入***(50mL)，使用离心沉降沉淀，并去除***。将沉淀重新分散于***中，并反复分散及离心3次以洗涤沉淀。经过真空干燥后，得到白色固体(94.7mg)，收率92％。

¹H NMR(500MHz,MeOD)δ4.53–4.49(m,1H),4.36–4.32(m,1H),3.43–3.40(m,1H),3.33(p,J＝1.7Hz,1H),3.25–3.21(m,1H),3.01–2.90(m,3H),2.72(dd,J＝12.7,7.7Hz,1H),2.28–2.19(m,2H),1.77–1.63(m,4H),1.51–1.45(m,2H).

¹³C NMR(125MHz,MeOD)δ175.60,164.71,61.97,60.25,55.58,39.63,38.22,37.25,35.24,28.39,28.09,25.20.

ESI-MS(m/z):calculated for C₁₂H₂₂N₄O₂S[M+H]⁺:287.2；found,287.0.

步骤3、将上步产物(16.1mg,0.14mmol,1.2equiv.)溶于磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L,4mL)中，将溶于乙腈(4mL)的第一种修饰组合物的合成步骤1制备的化合物(40.0mg,0.12mmol,1.0equiv.)加入体系，于室温搅拌1h。高效液相色谱跟踪原料消耗完毕后，直接进行下一步反应。

步骤4、向含有上步产物(0.12mmol,1.0equiv.)的乙腈与水的混合液(乙腈:水＝1:1,8mL)，依次加入N-乙酰-L-半胱氨酸(40.0mg,0.24mmol,2.0equiv.)及碳酸氢钠(31.0mg,0.36mmol,3.0equiv.)。于室温搅拌1h。高效液相色谱跟踪原料消耗完毕后，加入盐酸(1mol/L)调节pH至酸性，使用半制备型高效液相色谱纯化，得到黄色固体粉末。

ESI-MS(m/z):calculated for C₂₈H₃₄N₇O₆S₂[M+H]⁺:628.2；found,628.2.

实施例7

多肽的染料标记

利用本发明的方法，对多肽进行染料修饰，方法示意图见图2。将含罗丹明的分子母液(乙腈,1000μmol/L,10μL)、多肽母液(500μmol/L,10μL)、TCEP(5mmol/L,2μL)加入至磷酸缓冲液(pH＝7.4,200mmol/L,50μL)中，并补充水(18μL)。最终体系中各组分浓度为：含罗丹明的分子(100μmol/L)、多肽(50μmol/L)、TCEP(100μmol/L)、磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L)及乙腈(10％,v/v)。将体系置于37℃下反应60min。如图3为高效液相色谱定量分析图，多肽的转化率为100％，通过以上修饰方法可以得到罗丹明标记的多肽。

ESI-MS(m/z):calculated for[M-Cl]⁺:2182.0；found,2182.0.

实施例8

多肽的生物素修饰

将含生物素的分子母液(1000μmol/L,10μL)、多肽母液(500μmol/L,10μL)、TCEP(5mmol/L,2μL)加入至磷酸缓冲液(pH＝7.4,200mmol/L,50μL)中，并补充水(18μL)。最终体系中各组分浓度为：含Biotin的分子(100μmol/L)、多肽(50μmol/L)、TCEP(100μmol/L)及磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L)。将体系置于37℃下反应60min。根据高效液相色谱定量，多肽的转化率为100％，通过以上修饰方法可以得到生物素修饰的多肽。

ESI-MS(m/z):calculated for[M+H]⁺:1061.4；found,1061.4.