T细胞特异接头蛋白slp-76的类泛素化修饰位点的鉴定及应用
阅读说明：本技术 T细胞特异接头蛋白slp-76的类泛素化修饰位点的鉴定及应用 (Identification and application of ubiquitin-like modification site of T cell specific adaptor protein SLP-76 ) 是由 刘合宾 熊伊韦 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,本发明首次鉴定出特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰的位点在第266位和第284位的赖氨酸上,并且突变这两个类泛素化修饰位点可直接改变T细胞功能,该方法具有可靠性、简便性和经济性,以及较高的应用价值。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and identifies that the ubiquitin-like modified sites of specific joint protein SLP-76 are positioned on the 266 th lysine and the 284 th lysine for the first time, and the mutation of the two ubiquitin-like modified sites can directly change the function of a T cell.)
技术领域
本发明生物医药技术领域，具体涉及T细胞特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰位点的鉴定及其应用。
背景技术
SLP-76是T细胞特异的免疫接头蛋白，它在结构上包含多种结构域，这些结构域介导SLP-76和其它蛋白信号分子相互作用，从而实现一系列T细胞受体信号转导的调控功能。SLP-76是TCR信号转导核心信号轴(TCR-p56Lck-ZAP-70-LAT-GADs-SLP-76)的关键的“节点”枢纽分子,不仅能整合TCR近端信号和远端信号的级联放大，而且在TCR信号转导中发挥重要的调控作用。SLP-76介导的TCR近端信号事件包括重要信号分子的酪氨酸磷酸化、相互作用和激活；而远端信号则包括ERK、NF-B等重要信号路径的激活，细胞骨架重排，免疫粘附及细胞因子IL-2分泌增加等。这些TCR信号级联反应最终导致T细胞分化、增殖、活化和效应免疫反应的获得。因此，SLP-76蛋白结构或翻译修饰水平的改变可直接影响T细胞功能。
类泛素化(SUMOylation)与泛素化(Ubiquitination)类似，是一种在多种细胞内实现对信号转导精细调控的重要的翻译后修饰过程，广泛参与调节蛋白质功能和细胞生命活动各个环节。它们的反应机制相似，并且底物的作用靶点都是赖氨酸。两者不同之处在于，类泛素化过程被修饰的是Ubiquitin分子，而类泛素化被修饰的是SUMOs(smallubiquitin-like modifiers)分子。在多数情况下,泛素化和SUMO化以拮抗性的方式调控底物蛋白的功能。不仅如此，在很多细胞中泛素化与类泛素化可作为一对相互制约的调控机制同时存在，并可修饰同一个靶标蛋白甚至竞争性修饰同一个蛋白上的同一个赖氨素残基如IB的K21位点，从而实现对靶标蛋白介导的信号传导路径一正一反的平衡调控。
目前，泛素化通路在T细胞信号传导中的调控作用及其机制的研究已十分清楚：主要通过c-Cbl、Cbl-b和Itch等泛素连接酶介导的泛素化修饰导致的降解作用。这些泛素连接酶在T细胞中的靶标分子包括包括Lck、Fyn、ZAP-70和SLP-76等这些在T细胞激活信号传导中有重要作用的信号分子。这些分子被泛素化修饰后而被降解，从而下调TCR信号传导强度和T细胞免疫反应水平。因此，蛋白类泛素化修饰对调节T细胞功能具有重要的生物学意义，为T细胞相关疾病的治疗提供潜在的药物作用靶点和治疗策略。
尽管类泛素化修饰过程与泛素化有诸多共同点，但到目前为止，T细胞中重要的靶标分子如何被类泛素化修饰仍知之甚少，尤其是关键的接头蛋白SLP-76，目前尚无关于SLP-76被类泛素化修饰的报道，并且用传统方法鉴定SLP-76的类泛素化修饰，无法得到阳性结果。在此之前，对接头蛋白SLP-76的研究中，缺少一种能直接鉴定SLP-76类泛素化水平的分析方法，从技术上分析，可能的原因：一是类泛素化是可逆的过程，加上类泛素分子可以被很快地被senp1酶催化介导的水解反应去除，且细胞内蛋白类泛素化修饰的丰度普遍偏低，对检测方法的敏感度要求高；二是SLP-76本身分子内作用牵制影响类泛素化的水平。
发明内容
本发明所要解决问题是在现有技术的基础上，提供T细胞特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰位点的鉴定及应用。
本发明第一方面提供T细胞特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰位点，为第266位的赖氨酸。
T细胞特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰位点为第284位的赖氨酸。
T细胞特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰位点，为第266位和第284位的赖氨酸。
本发明第二方面提供突变SLP-76的类泛素化修饰位点调控T细胞IL-2产出。
本发明优选的技术方案中，突变SLP-76的第266位的赖氨酸位点。
本发明优选的技术方案中，突变SLP-76的第284位的赖氨酸位点。
本发明优选的技术方案中，突变SLP-76的第266位和第284位的赖氨酸位点。
本发明优选的技术方案中，突变SLP-76的类泛素化修饰位点消除SLP-76与Ubc9协同提升T细胞的IL-2产出作用。
SLP-76蛋白的序列为(NCBI基因数据库，编号NM_005565.5)。
本发明通过直接鉴定SLP-76类泛素化水平的分析方法，在该方法的基础上，首次鉴定出特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰的位点在第266位和第284位的赖氨酸上，并且突变这两个类泛素化修饰位点可直接改变T细胞功能，该方法具有可靠性、简便性和经济性，以及较高的应用价值。
附图说明
图1为利用T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的检测方法，提高SLP-76类泛素化修饰丰度。
图2为SLP-76类泛素化修饰蛋白富集和分离后考马斯亮蓝染色图。
图3为高分子量的SLP-76类泛素化修饰蛋白的蛋白质谱学分析结果图(赖氨酸修饰位点K266)。
图4为高分子量的SLP-76类泛素化修饰蛋白的蛋白质谱学分析结果图(赖氨酸修饰位点K284)。
图5为利用蛋白免疫印迹法验证SLP-76类泛素化位点K266和K284，显示SLP-76类泛素化位点突变引起类泛素化修饰水平下降。
图6为SLP-76类泛素化位点突变对T细胞IL-2转录水平的影响。
图7为SLP-76类泛素化位点突变对T细胞IL-2蛋白产出的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，例如具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3 rdedition,2001,NY,Cold SpringHarbor)。
所用引物及序列由上海生工有限公司合成。表达载体pcDNA 3.1购自invitrogen公司，质粒pSRa-UBC9、pSRa-SUMO1和pSRa-SLP-76，以及jurkat T细胞、HEK293T细胞在发表于《Molecular cell》的“The Immune Adaptor SLP-76 Binds to SUMO-RANGAP1 atNuclear Pore Complex Filaments to Regulate Nuclear Import of TranscriptionFactors in T Cells”一文中有明确提及，且名称一致。
实施例1
利用T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的检测方法，富集和鉴定SLP-76类泛素化修饰位点包括以下步骤：
1.1构建SLP-76-UBC9融合表达质粒
将编码SLP-76蛋白的序列***pcDNA3-MCS-Ubc9质粒的多克隆位点内，从而构建SLP-76-UBC9融合表达质粒；
编码SLP-76-UBC9融合蛋白的氨基酸序列为：
ATGGCACTGAGGAATGTGCCCTTTCGCTCAGAGGTCCTGGGCTGGGACCCCGACAGCCTTGCTGACTATTTCAAGAAGCTCAACTATAAGGACTGTGAGAAGGCAGTGAAGAAGTACCACATCGATGGGGCTCGCTTCTTGAACCTGACAGAAAATGACATCCAGAAGTTCCCCAAGCTCCGGGTGCCGATTCTCAGTAAGTTAAGTCAGGAAATCAACAAGAACGAAGAGAGGAGGAGCATCTTCACACGCAAACCCCAAGTCCCGCGGTTTCCTGAAGAGACAGAAAGCCACGAAGAGGACAATGGGGGCTGGTCGTCCTTTGAAGAAGACGATTATGAAAGTCCCAATGATGACCAGGATGGGGAGGATGATGGAGACTATGAGTCCCCCAATGAGGAGGAAGAGGCACCCGTGGAAGATGACGCGGATTATGAGCCGCCACCCTCCAATGACGAGGAAGCTCTGCAGAACTCCATCCTGCCTGCCAAGCCTTTCCCCAACTCCAACTCCATGTACATCGACCGGCCCCCCTCTGGGAAAACCCCCCAGCAGCCTCCTGTGCCCCCCCAGAGACCGATGGCCGCCCTCCCGCCCCCACCAGCCGGCCGGAATCACTCGCCACTGCCCCCACCCCAGACCAACCACGAAGAACCCAGCAGAAGCAGAAACCACAAAACGGCAAAGCTCCCTGCTCCTTCAATAGACAGAAGCACGAAACCTCCCCTAGATCGTTCATTAGCTCCGTTTGATAGAGAACCCTTCACACTAGGAAAGAAACCACCATTTTCTGACAAGCCCTCGATTCCAGCGGGAAGGTCACTCGGGGAGCATTTACCCAAGATTCAAAAGCCTCCTTTACCACCGACCACGGAAAGACATGAAAGGAGCAGCCCCCTGCCAGGGAAGAAGCCACCTGTGCCAAAGCATGGATGGGGACCAGACAGAAGAGAGAATGATGAAGATGATGTGCATCAGAGACCTTTGCCCCAGCCAGCACTACTTCCTATGAGCTCCAACACTTTCCCTTCAAGATCTACTAAGCCAAGTCCCATGAACCCTCTCCCATCCTCTCACATGCCTGGAGCATTCTCAGAAAGTAACAGCAGTTTTCCACAGAGTGCCTCCCTGCCACCATACTTCTCTCAAGGCCCTAGCAACAGACCACCTATCAGAGCCGAAGGCAGAAACTTCCCCTTGCCACTTCCAAACAAACCTCGGCCCCCATCCCCCGCGGAGGAAGAGAATTCATTAAATGAAGAGTGGTACGTTTCTTATATTACCCGACCAGAGGCAGAAGCTGCTCTTAGAAAGATAAACCAGGATGGCACATTTCTGGTCAGAGACAGCTCTAAAAAAA CAACAACCAATCCATATGTCCTCATGGTGTTGTACAAAGATAAAGTTTACAACATCCAGATCCGTTATCAGAAGGA AAGTCAAGTTTACTTGTTGGGAACTGGACTCCGAGGGAAAGAGGACTTTCTGTCTGTGTCAGATATTATTGACTAC TTCAGGAAAATGCCACTTCTGCTCATTGATGGGAAAAACCGAGGTTCCAGATACCAGTGCACATTAACGCATGCTGCAGGGTACCCACGAGGAGGATCGGGGATCGCCCTCAGCCGCCTTGCGCAGGAAAGGAAAGCCTGGAGGAAGGACCACCCTTTTGGCTTTGTAGCTGTCCCAACAAAGAACCCTGATGGCACAATGAACCTGATGAACTGGGAGTGCGCTATCCCTGGAAAGAAGGGGACTCCATGGGAAGGAGGCTTGTTCAAGCTACGGATGCTTTTCAAAGATGACTATCCGTCCTCACCACCAAAATGTAAATTTGAGCCCCCACTGTTTCATCCAAACGTGTATCCTTCTGGCACAGTGTGCCTGTCCATCCTGGAGGAAGACAAGGACTGGAGGCCAGCTATCACCATCAAACAGATCTTATTAGGAATACAAGAACTTCTAAATGAACCAAATATTCAAGACCCAGCTCAAGCAGAGGCCTACACAATTTACTGCCAAAACAGAGTGGAATATGAGAAAAGGGTCCGAGCACAAGCGAAGAAGTTTGCCCCCTCATAA；
1.2构建SLP-76羧基端改造融合表达质粒(SLP-76Δ416-516-Ubc9)
SLP-76羧基端改造质粒为SLP-76上438-516位氨基酸剔除的UBC9融合蛋白表达质粒。
注：被剔除的438-516位氨基酸，为步骤1.1编码SLP-76-UBC9融合蛋白的序列中的下划线所述的序列。
SLP-76 438-516位氨基酸截短体的构建方法为：以步骤1.1所得SLP-76-UBC9融合蛋白表达质粒为模版，设计438-516位氨基酸剔除的特异引物，使用quikchangeTM定点突变试剂盒(Agilent,#200524)；参照试剂盒说明书操作，突变后质粒序列以桑格测序法验证。
特异引物为：
Delete438-516正向引物5’-3’:GCTGCTCTTAGAAACCGAGGTTCCAGATACCAGTGCA
Delete438-516反向引物5’-3’:CCTCGGTTTCTAAGAGCAGCTTCTGCCTCTGGTCG。
1.3构建SUMO1第95位苏氨酸突变成精氨酸的表达质粒(SUMO1-T95R)
SUMO1第95位苏氨酸突变成精氨酸的表达质粒(SUMO1-T95R)的构建方法为：以pSRa-SUMO1为模版，设计95位氨基酸突变的特异引物(见下方具体引物序列)，使用quikchangeTM定点突变试剂盒(Agilent,#200524)，参照试剂盒说明书操作。突变后质粒序列以桑格测序法验证。
引物序列为：
SUMO1-T95R正向引物5’-3’:GGAACAAAGGGGGGGTTAGGGTACCTTCTGA
SUMO1-T95R反向引物5’-3’:TAACCCCCCCTTTGTTCCTGATAAACTTCAATCACATC
1.4将改造质粒与SUMO1表达质粒在HEK 293T细胞内共表达
利用脂质体转染法，将4微克SLP-76 Δ416-516-Ubc9质粒和4微克SUMO1-T95R混合后，加入12微升脂质体转染试剂(翊圣，#40802ES08)，静置20分钟后，滴加入培养有50-80％融合的HEK293T细胞中(10-cm培养皿)。继续培养24小时后，收集细胞。
1.5取待测细胞加入改良的裂解缓冲液；于冰上放置后离心；用标签亲和抗体和蛋白琼脂糖珠富集表达的标签蛋白，蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转膜，孵育SUMO1特异性地抗体和标签蛋白/SLP-76蛋白抗体；匹配蛋白条带位置，判定SLP-76是否发生了类泛素化修饰，结果如图1所示，
孔道1为：空白载体与FLAG-SUMO1质粒(pCMV-flag-Sumo1)共表达；在UBC9抗体孵育后100KD以上的位置并未出现高分子条带，且FLAG抗体孵育后无条带。
孔道2为：SLP-76-UBC9融合表达质粒与FLAG-SUMO1质粒(pCMV-flag-Sumo1)共表达；在UBC9抗体孵育后在130KD以上出现了多条高分子条带，且与FLAG条带重合，判定成SLP-76已发生了类泛素化修饰。
孔道3为：SLP-76-UBC9融合表达质粒与FLAG-SUMO1-T95R质粒(pCMV-flag-Sumo1-T95R)共表达；在UBC9抗体孵育后在130KD以上出现了多条高分子条带，且与FLAG条带重合，判定成SLP-76已发生了类泛素化修饰。
即，如图1孔道1-3显示，SLP-76融合-UBC9蛋白分子量约100KD,在100KD上方，以一抗UBC9抗体孵育(上图)，在130KD左右的位置出现多条上移带可同时被抗FLAG抗体识别(下图)，表明融合蛋白SLP-76-UBC9的类泛素化修饰成功。
1.6准备平行样本，比对蛋白印迹分析法中的类泛素化修饰蛋白条带位置，切出方框所示位置和大小的胶块(如图2所示)，胰蛋白酶消化，进行常规蛋白质谱分析。匹配氨基酸序列和原始谱图，分析荷质比，可鉴定出优选的SLP-76羧基端改造融合蛋白在第266位和284位赖氨酸上(蛋白肽段图谱分别如图3和图4所示)存在类泛素化修饰。
实施例2：SLP-76类泛素化位点突变引起类泛素化修饰水平下降。
包括以下步骤：
2.1构建第266位和284位赖氨酸点突变的SLP-76-UBC9融合表达质粒；
以步骤1.2所得SLP-76羧基端改造融合表达质粒(SLP-76Δ416-516-Ubc9)为模版，设计266位和284位赖氨酸点突变特异引物，使用quikchangeTM定点突变试剂盒(Agilent,#200524)；参照试剂盒说明书操作，突变后质粒序列以桑格测序法验证。
特异引物为：
SLP-76K266R正向引物5’-3’:TCTGACAGGCCCTCGATTCCAGCGGGAAGG
SLP-76K266R反向引物5’-3’:GGAATCGAGGGCCTGTCAGAAAATGGTGGTTTCTTTCCT；
SLP-76K284R正向引物5’-3’:GATTCAAAGGCCTCCTTTACCACCGACCACGGAAA
SLP-76K284R反向引物5’-3’:GTAAAGGAGGCCTTTGAATCTTGGGTAAATGCTCCCCG。
2.2将该突变质粒与SUMO1表达质粒在HEK 293T细胞内共表达，
利用脂质体转染法，将4微克SLP-76K266R-Δ416-516-Ubc9、SLP-76K284R-Δ416-516-Ubc9或SLP-76K266R/284R-Δ416-516-Ubc9突变质粒和4微克pCMV-flag-Sumo1混合后，加入12微升脂质体转染试剂(翊圣，#40802ES08)，静置20分钟后，滴加入培养有50-80％融合的HEK293T细胞中(10-cm培养皿)。继续培养24小时后，收集细胞。
2.3取待测细胞加入改良的裂解缓冲液；于冰上放置后离心；用标签亲和抗体和蛋白琼脂糖珠富集表达的标签蛋白，蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转膜，孵育SUMO1特异性地抗体和标签蛋白/SLP-76蛋白抗体；匹配蛋白条带位置，判定SLP-76类泛素化修饰水平是否因该位点突变而下降，即该位点确实为修饰位点。
如图5所示，孔道1为：空白载体与FLAG-SUMO1质粒(pCMV-flag-Sumo1)共表达；在HA抗体孵育后100KD以上的位置并未出现高分子条带。
孔道2为：SLP-76羧基端改造融合表达质粒(SLP-76Δ416-516-Ubc9)与FLAG-SUMO1质粒(pCMV-flag-Sumo1)共表达；在HA抗体孵育后在100-130KD之间出现了多条高分子条带，判定成SLP-76已发生了类泛素化修饰。
孔道3-5为：第266位、284位和266位与284位双赖氨酸点突变的SLP-76羧基端改造融合表达质粒与FLAG-SUMO1质粒(pCMV-flag-Sumo1)共表达；在HA抗体孵育后在100-130KD之间未见高分子条带，判定点突变该位点后，SLP-76类泛素化修饰水平下降。
即，如图5孔道2显示，SLP-76羧基端改造Ubc9融合蛋白分子量约100KD,在100KD上方，以一抗HA抗体孵育，在130KD左右的位置出现多条上移带，表明融合蛋白SLP-76Δ416-516-UBC9的类泛素化修饰成功。如孔道3-5显示，点突变第266位、284位以及266位与284位双位赖氨酸后，130KD左右的位置并无上移带，表明SLP-76类泛素化修饰消失，该位点确实为类泛素化修饰位点。
实施例3SLP-76类泛素化位点突变引起T细胞IL-2产出水平变化。
包括以下步骤：
3.1构建SLP-76点突变的表达质粒(K266R、K284R、K266R/K284R；非融合表达)；将该突变质粒在T细胞内表达，或与UBC9表达质粒共表达。
以pSRa-SLP-76为模版，设计266位和284位赖氨酸点突变特异引物，使用quikchangeTM定点突变试剂盒(Agilent,#200524)；参照试剂盒说明书操作，突变后质粒序列以桑格测序法验证。
特异引物为：
SLP-76K266R正向引物5’-3’:TCTGACAGGCCCTCGATTCCAGCGGGAAGG
SLP-76K266R反向引物5’-3’:GGAATCGAGGGCCTGTCAGAAAATGGTGGTTTCTTTCCT；
SLP-76K284R正向引物5’-3’:GATTCAAAGGCCTCCTTTACCACCGACCACGGAAA
SLP-76K284R反向引物5’-3’:GTAAAGGAGGCCTTTGAATCTTGGGTAAATGCTCCCCG。
利用电转转染法，将10微克SLP-76K266R、SLP-76K284R或SLP-76K266R/284R突变质粒和5微克pSRa-UBC9质粒混合后，加入5x106个Jurkat T细胞，转入4mm电转杯中，250V，950μF电击一次，将电击后的细胞转入无抗生素的完全培养基中继续培养24小时，收集细胞。
3.2分析T细胞IL-2基因的转录水平，在步骤1)基础上，在Jurkat T细胞内同时共表达IL-2基因启动子的荧光素酶报告基因载体。取待测细胞加入裂解缓冲液；于冰上放置后离心；加入荧光素酶检测试剂(购自Promega)，于酶标仪中读取化学发光值，判定IL-2启动子的荧光素酶活性。
利用电转转染法，将10微克SLP-76K266R、SLP-76K284R或SLP-76K266R/284R突变质粒、5微克pSRa-UBC9质粒和5微克IL-2基因启动子的荧光素酶报告基因载体混合后，加入5x106个Jurkat T细胞，转入4mm电转杯中，250V，950μF电击一次，将电击后的细胞转入无抗生素的完全培养基中继续培养24小时，收集细胞。取待测细胞加入50微升裂解缓冲液；于冰上放置15分钟后离心；加入荧光素酶检测试剂(购自Promega)，于酶标仪中读取化学发光值，判定IL-2启动子的荧光素酶活性。
如图6所示，
(1)单独表达SLP-76点突变质粒(K266R、K284R、K266R/K284R)，IL-2启动子荧光素酶活性与单独表达野生型SLP-76质粒相近；表明突变类泛素化修饰位点并未改变T细胞IL-2转录活性。
(2)共表达SLP-76与UBC9质粒，IL-2启动子荧光素酶活性较单独表达时极大上升，表明SLP-76与UBC9协同提升IL-2转录活性；而共表达SLP-76点突变质粒(K266R、K284R、K266R/K284R)与UBC9质粒时，该协同作用消失，表明点突变类泛素化修饰位点可通过消除与UBC9的协同作用而影响IL-2转录活性。
3.3分析T细胞IL-2蛋白产出水平，在小鼠T细胞内表达步骤1)质粒，细胞培养24小时后，离心，取上清液，用小鼠IL-2ELISA试剂盒(购自达科为)分析细胞培养上清液中IL-2的产出量。
如图7所示，
(1)单独表达SLP-76点突变质粒(K266R、K284R、K266R/K284R)，IL-2在细胞培养上清液中的含量与单独表达野生型SLP-76质粒相近；表明突变类泛素化修饰位点并未改变T细胞IL-2产出。
(1)共表达SLP-76与UBC9质粒，IL-2产出含量较单独表达时显著上升，表明SLP-76与UBC9协同提升IL-2蛋白产出；而共表达SLP-76点突变质粒(K266R、K284R、K266R/K284R)与UBC9质粒时，该协同作用消失，表明点突变类泛素化修饰位点可通过消除与UBC9的协同作用而影响IL-2蛋白产出。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 西交利物浦大学
<120> T细胞特异接头蛋白SLP-76的类泛素化修饰位点的鉴定及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 2082
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcactga ggaatgtgcc ctttcgctca gaggtcctgg gctgggaccc cgacagcctt 60
gctgactatt tcaagaagct caactataag gactgtgaga aggcagtgaa gaagtaccac 120
atcgatgggg ctcgcttctt gaacctgaca gaaaatgaca tccagaagtt ccccaagctc 180
cgggtgccga ttctcagtaa gttaagtcag gaaatcaaca agaacgaaga gaggaggagc 240
atcttcacac gcaaacccca agtcccgcgg tttcctgaag agacagaaag ccacgaagag 300
gacaatgggg gctggtcgtc ctttgaagaa gacgattatg aaagtcccaa tgatgaccag 360
gatggggagg atgatggaga ctatgagtcc cccaatgagg aggaagaggc acccgtggaa 420
gatgacgcgg attatgagcc gccaccctcc aatgacgagg aagctctgca gaactccatc 480
ctgcctgcca agcctttccc caactccaac tccatgtaca tcgaccggcc cccctctggg 540
aaaacccccc agcagcctcc tgtgcccccc cagagaccga tggccgccct cccgccccca 600
ccagccggcc ggaatcactc gccactgccc ccaccccaga ccaaccacga agaacccagc 660
agaagcagaa accacaaaac ggcaaagctc cctgctcctt caatagacag aagcacgaaa 720
cctcccctag atcgttcatt agctccgttt gatagagaac ccttcacact aggaaagaaa 780
ccaccatttt ctgacaagcc ctcgattcca gcgggaaggt cactcgggga gcatttaccc 840
aagattcaaa agcctccttt accaccgacc acggaaagac atgaaaggag cagccccctg 900
ccagggaaga agccacctgt gccaaagcat ggatggggac cagacagaag agagaatgat 960
gaagatgatg tgcatcagag acctttgccc cagccagcac tacttcctat gagctccaac 1020
actttccctt caagatctac taagccaagt cccatgaacc ctctcccatc ctctcacatg 1080
cctggagcat tctcagaaag taacagcagt tttccacaga gtgcctccct gccaccatac 1140
ttctctcaag gccctagcaa cagaccacct atcagagccg aaggcagaaa cttccccttg 1200
ccacttccaa acaaacctcg gcccccatcc cccgcggagg aagagaattc attaaatgaa 1260
gagtggtacg tttcttatat tacccgacca gaggcagaag ctgctcttag aaagataaac 1320
caggatggca catttctggt cagagacagc tctaaaaaaa caacaaccaa tccatatgtc 1380
ctcatggtgt tgtacaaaga taaagtttac aacatccaga tccgttatca gaaggaaagt 1440
caagtttact tgttgggaac tggactccga gggaaagagg actttctgtc tgtgtcagat 1500
attattgact acttcaggaa aatgccactt ctgctcattg atgggaaaaa ccgaggttcc 1560
agataccagt gcacattaac gcatgctgca gggtacccac gaggaggatc ggggatcgcc 1620
ctcagccgcc ttgcgcagga aaggaaagcc tggaggaagg accacccttt tggctttgta 1680
gctgtcccaa caaagaaccc tgatggcaca atgaacctga tgaactggga gtgcgctatc 1740
cctggaaaga aggggactcc atgggaagga ggcttgttca agctacggat gcttttcaaa 1800
gatgactatc cgtcctcacc accaaaatgt aaatttgagc ccccactgtt tcatccaaac 1860
gtgtatcctt ctggcacagt gtgcctgtcc atcctggagg aagacaagga ctggaggcca 1920
gctatcacca tcaaacagat cttattagga atacaagaac ttctaaatga accaaatatt 1980
caagacccag ctcaagcaga ggcctacaca atttactgcc aaaacagagt ggaatatgag 2040
aaaagggtcc gagcacaagc gaagaagttt gccccctcat aa 2082