合成二倍半萜蛇孢菌素f的系统和微生物及其应用
阅读说明：本技术 合成二倍半萜蛇孢菌素f的系统和微生物及其应用 (System and microorganism for synthesizing sesterterpene serpentin F and application thereof ) 是由 洪葵 袁薇 邓子新 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统和微生物及其应用。本发明优化了培养条件,发酵结果显示：五碳糖阿拉伯糖和木糖对比原发酵条件中甘油能显著增加蛇孢菌素F的产量；真菌来源基因倍半萜合成酶Au6298,融合标签SUMO和Trx和通过定点突变蛇孢菌素合成酶D87E,E95V,Q122D,R131K和H190F也能显著提高蛇孢菌素F的产量。本发明构建的微生物能稳定产生蛇孢菌素F的培养物,为后续进一步利用微生物产生蛇孢菌素F后修饰产物奠定了基础。(The invention discloses a system and a microorganism for synthesizing sesterterpene sporothrin F and application thereof. The invention optimizes the culture condition, and the fermentation result shows that: the five-carbon sugar arabinose and xylose can obviously increase the yield of the ophiosporin F compared with the glycerol in the original fermentation condition; the fungal source gene sesquiterpene synthetase Au6298, fusion tags SUMO and Trx and the yield of the snake sporophytin F can also be obviously improved by site-directed mutagenesis of snake sporophytin synthetase D87E, E95V, Q122D, R131K and H190F. The microorganism constructed by the invention can stably produce the culture of the snake spore bacillus F, and lays a foundation for further producing the modified product of the snake spore bacillus F by utilizing the microorganism.)
技术领域
本发明属于合成生物学、基因工程和酶工程领域，具体是指一种合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统和微生物及其应用。
背景技术
蛇孢菌素类(Ophiobolins，ophs)是一类二倍半萜类化合物，其具有特征性5-8-5三环母核结构(Chiba R,Minami A,Gomi K,Oikawa H.Identification of ophiobolin Fsynthase by a genome mining approach:a sesterterpene synthase fromAspergillus clavatus.Organic letters,2013,15(3):594-597.)。截至2019年，56种天然产物来源的ophs化合物被报道(TianW,Deng Z,Hong K.The biological activitiesofsesterterpenoid-Type ophiobolins[J].Marine drugs,2017,15(7):229；Zhu T,Lu Z,Fan J,et al.Ophiobolins from the mangrove fungus Aspergillus ustus[J].Journalof natural products,2017,81(1):2-9.)。该类化合物显示了抗肿瘤，广谱的抗菌、抗线虫和抗病毒活性(Tian W,Deng Z,Hong K.The biological activities ofsesterterpenoid-Type ophiobolins[J].Marine drugs,2017,15(7):229.)。Ophs骨架合成是一种嵌合性的萜类合成酶合成，之所以称之为嵌合酶是因为该类酶具有两个结构域：链延伸结构域，负责将五碳前体异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸合成法尼基牻牛儿基焦磷酸(GFPP)；环化结构域，能够把GFPP环化为5-8-5三环oph母核(Chiba R,Minami A,Gomi K,Oikawa H(2013)Identification of ophiobolin F synthase by a genomemining approach:a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus.Organicletters,2013,15(3):594-597.)。在原生真菌中，ophs的产量不仅仅和oph合成酶有关，还涉及到倍半萜Au6298，二萜Au13192和Au11565，三萜Au3446合成酶相关基因簇(Chai H,YinR,Liu Y,et al.Sesterterpene ophiobolin biosynthesis involving multiple geneclusters in Aspergillus ustus[J].Scientific reports,2016,6:27181.)。
目前萜类的生产方法主要有3种：提取法、化学合成法和生物合成法。Ophs从原始菌株分离和化学合成去大量供应该类化合物存在实际的困难。首先，野生型真菌TKYX429能够产生ophs化合物，但是如果从工业化菌株的角度分析，存在着多方面的困难：该菌株除了能合成ophs产物，还合成其它类型的化合物，如倍单萜、异色满、甾醇和环二肽等代谢产物，因此不利于分离获取高纯度的oph类单体化合物；其次，合成的ophs同系物成分较为复杂，从而导致单体化合物的制备尤其的困难；再次，固体发酵工艺导致原始发酵材料容易残留在终产物中，从而增加了后期分离纯化的难度(Chai H,Yin R,Liu Y,etal.Sesterterpene ophiobolin biosynthesis involving multiple gene clusters inAspergillus ustus[J].Scientific reports,2016,6:27181.)。该类化合物结构较为复杂且具有多个手性中心，自从1977的第一篇论文发表试图合成oph的骨架开始，经过几十年的发展，ophs的全合成仍然限制于实验室规模(Brill Z G,Grover H K,Maimone TJ.Enantioselective synthesis of an ophiobolin sesterterpene via a programmedradical cascade[J].Science,2016,352(6289):1078-1082.)。因此需要其它策略来供应低廉的大量oph化合物。
利用合成生物学方法异源宿主合成萜类化合物，为推动该类化合物的产业化指明了出路(George KW,Alonso-Gutierrez J,Keasling JD,Lee TS Isoprenoid drugs,biofuels,and chemicals-artemisinin,farnesene,andbeyond.In:Schrader J.,Bohlmann J.(eds)Biotechnology of Isoprenoids.Adv.Biochem.Eng./Biotechnol,vol148.Springer,Cham,2015:355-389.)。国内外大批的课题组将萜类化合物在大肠杆菌底盘细胞中异源表达。Jay Keasling教授实验室通过大肠杆菌在重构甲羟戊酸途径的合成途径进行倍半萜青蒿素素前体的生物合成，刘天罡教授将番茄红素相关的合成途径在大肠杆菌中过表达(Martin V J J,Pitera D J,Withers S T,et al.Engineering a mevalonatepathway in Escherichia coli for production of terpenoids[J].Naturebiotechnology,2003,21(7):796；Zhu F,Lu L,Fu S,et al.Targeted engineering andscale up of lycopene overproduction in Escherichia coli[J].ProcessBiochemistry,2015,50(3):341-346.)。
大肠杆菌表达由于系统缺乏翻译后加工机制，所以在表达外源蛋白过程中，会因蛋白不正确的折叠而形成不可溶的包涵体。根据Novagen公司表达载体pET系列说明书，正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。比如，硫氧还蛋白(TrxA)具有催化蛋白质二硫键还原的功能，可帮助蛋白质正确折叠，共表达可以增加外源蛋白的可溶性；小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)是一种分子伴侣，具有同泛素相似β是片层缠绕α层螺旋的球状折叠的结构，拥有高度疏水的核心，它为融合蛋白的折叠提供成位点，从而能够提高外源蛋白可溶性和稳定性。根据以前的文献，嵌合性萜类合成酶选取的融合蛋白仅仅是谷胱甘肽-S-转移酶(GST),这种融合蛋白虽然经典，但是蛋白标签较大，很容易影响酶活(Chen M,Chou W K W,Toyomasu T,et al.Structure and function offusicoccadiene synthase,a hexameric bifunctional diterpene synthase[J].ACSchemical biology,2016,11(4):889-899.)。由此可以得出：通过融合其它合适的蛋白标签非常有利于提高该类化合物的异源表达产量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统和微生物及其应用。
为实现上述目的，本发明如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统，其特征在于：包含如下成分：蛇孢菌素合成相关基因或其功能等同体；所述蛇孢菌素合成相关基因为经过密码子优化的Au8003基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1所示；所述蛇孢菌素合成相关基因或其功能共同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上；
还包括：真菌TKYX429来源的倍半萜合成酶Au6298、Au13192、Au11565或者Au3446基因；融合标签SUMO和Trx；蛇孢菌素合成酶突变D87E，E95V，Q122D，R131K和H190F中的一种或多种。
第二方面，本发明提供一种合成二倍半萜蛇孢菌素F的微生物，其特征在于：所述微生物包含如权利要求1所述合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统；所述微生物为丝状真菌、酵母、链霉菌、芽孢杆菌或大肠杆菌中任一种。
进一步地，所述微生物为基因组DNA中整合了如权利要求1所述合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统的核酸序列一种或多种；所述微生物为含有质粒pWHU4003、pWHU4004-pWHU4009、pWHU4014-pWHU4016或pWHU4003(1)-(13)的大肠杆菌一种或多种：所述质粒启动子均为T7强启动子，复制子为中等拷贝数的pBBR322复制子都包含密码子优化的蛇孢菌素合成酶基因；所述微生物生产蛇孢菌素F的培养基碳源包括五碳糖***糖、木糖或者酒石酸铵、柠檬酸、甘油以及葡萄糖。
第三方面，本发明提供一种上述合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统在生产蛇孢菌素中的应用。
第四方面，本发明提供一种上述合成二倍半萜蛇孢菌素F的微生物在生产蛇孢菌素中的应用。
本发明中真菌TKYX429来源Au8003基因在大肠杆菌系统内的密码子优化，具有序列表SEQ ID NO.1中碱基序列。
本发明中生产的系统，包含蛇孢菌素合成相关基因或其功能等同体(同功能基因)。
上述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。所述微生物有前体供应途径。优选的，含有质粒pWHU4003的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4003启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.2所示。
将上述生产蛇孢菌素F的菌株介入含碳源的培养基中进行发酵得到蛇孢菌素F。所述的碳源优选为甘油，葡萄糖，酒石酸铵，柠檬酸，***糖或木糖。
所述培养基优选为如下培养基中的一种：
2xTYGly：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，20mL/L甘油，pH 7.2；
2xTYGlu：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，15.2g甘油，10g/L葡萄糖，pH 7.2；
2xTYAmm：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，15.2g甘油，10g/L酒石酸铵，pH 7.2；
2xTYCit：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，15.2g甘油，10g/L柠檬酸，pH 7.2；
2xTYAra：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，15.2g甘油，10g/L***糖，pH 7.2；
2xTYXylo：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，15.2g甘油，10g/L木糖，pH 7.2；
所述的培养基为2xTYAra(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，15.2g甘油，10g/L***糖，pH 7.2)。
供应不同链延伸长度的焦磷酸中间体C15(Au6298)，C20(Au11565和Au13192)或C30(Au3446)。
所述的C15(Au6298)，C20(Au11565和Au13192)，C30(Au3446)和oph合成相关基因或其功能共同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物含有质粒pWHU4004的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4004启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.3所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物含有质粒pWHU4005的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4005启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物含有质粒pWHU4006的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4006启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.5所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物含有质粒pWHU4007的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4007启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.6所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物含有质粒pWHU4008的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4008启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.7所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物含有质粒pWHU4009的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4009启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.8所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物含有质粒pWHU4004的大肠杆菌。
融合蛋白修饰oph合成酶：采用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、小分子泛素相关修饰蛋白(SUMO)和硫氧还蛋白(Trx)融合标签修饰oph合成酶提高蛋白的折叠或者可溶性表达。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物为质粒pWHU4014的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4014启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.9所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物为质粒pWHU4015的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4015启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.10所示。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物为质粒pWHU4016的大肠杆菌；所述的质粒pWHU4016启动子为T7强启动子，复制子为只是复制子为pBBR322中等拷贝复制子，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.11所示。
所述的SUMO融合修饰蛇孢菌素F合成相关基因或其功能共同体共表达。
蛇孢菌素合成酶定点突变：利用NCBI数据库基于系统发育(phylogeny-based)方法得出oph合成酶的氨基酸偏好性。根据和Au8003蛋白比对，找到13个待突变点S38A、D87E、E95V、Q122D、R131K、A134Q、L144I、H190F、M224L、Y231F、Y231W、N238A和A274L。由此，从突变体中找到产量提高的菌株。
所述的生产蛇孢菌素F的微生物为蛇孢菌素合成酶突变位点在S38A、D87E、E95V、Q122D、R131K、A134Q、L144I、H190F、M224L、Y231F、Y231W、N238A和A274L。
所述的突变株D87E，E95V，Q122D，R131K和H190F。
本发明通过提高生产蛇孢菌素F能力的方法为增加上述系统中任一基因或其功能等同体的表达。
综上所述，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明利用大肠杆菌工程菌高表达二倍半萜化合物蛇孢菌素F。
(2)通过优化培养基碳源，蛇孢菌素的合成量增加及其显著，其中五碳糖***糖和木糖最为明显。
(3)本发明利用真菌TKYX429来源的萜类合成酶，其中Au6298，Au13192，Au11565显著提高蛇孢菌素F的产量。
(4)为了增加双功能酶Au8003的可溶性表达，本发明选择三种GST、SUMO和Trx融合标签，其中SUMO对于蛇孢菌素产量的提高最为显著。
(5)跟传统的建立突变库相比，基于系统发育筛选到待突变株数量少，且阳性率高(38％)。
附图说明
图1是本发明蛇孢菌素类化合物共用前体蛇孢菌素F的结构图；
图2是本发明质粒pWHU4003示意图；
图3是本发明蛇孢菌素F的GC-MS图谱；
图4是本发明定量蛇孢菌素F的标准曲线；
图5是本发明碳源优化图；
图6是本发明质粒pWHU4004示意图；
图7是本发明质粒pWHU4005示意图；
图8是本发明质粒pWHU4006示意图；
图9是本发明质粒pWHU4007示意图；
图10是本发明质粒pWHU4008示意图；
图11是本发明质粒pWHU4009示意图；
图12是本发明真菌来源合成途径相关基因对蛇孢菌素F产量的影响；
图13是本发明质粒pWHU4014示意图；
图14是本发明质粒pWHU4015示意图；
图15是本发明质粒pWHU4016示意图；
图16是本发明融合蛋白修饰蛇孢菌素合成酶对蛇孢菌素F产量的影响；
图17是本发明系统发育指导的突变蛇孢菌素合成酶对蛇孢菌素F产量的影响。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非有特殊说明，本发明中的寡核苷酸引物由武汉擎科伟业生物科技有限公司合成，脱氧核酸序列测定由武汉擎科伟业生物科技有限公司完成。所用感受态细胞Top10、BL21(DE3)购买自康为世纪生物科技有限公司，限制性内切酶购自NEB公司，T4连接酶购买于宝生物工程(大连)有限公司，质粒提取、凝胶回收和酶切体系回收采用OmegaBio-Tek公司试剂盒，按说明书方法操作。氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素抗生素抗生素均购自Biosharp公司，甘油、葡萄糖、酒石酸铵、柠檬酸、***糖和木糖等培养基组成成分均购买自国药集团化学试剂有限公司。
实施例中所用到的引物如表1所示，序列如SEQ ID NO.12-53所示：
表1引物列表
实施例一pWHU4003质粒构建
将来源于真菌TKYX429(保藏编号为CCTCC NO：M 2013166)的蛇孢菌素(ophiobolin,oph)F(结构见附图1)合成基因Au8003经过密码子优化后(序列如SEQ IDNO.1所示)，由金斯瑞生物科技有限公司合成。将Au8003基因和载体pET21a(+)(Novagen公司)的使用Bam HI和Sac I双酶切产生一致的粘性末端。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收后，使用T4DNA连接酶16酶连接过夜，连接产物转化进入大肠杆菌感受态细胞Top10，以氨苄霉素抗性筛选转化子将挑选的阳性转化子扩培，抽提质粒DNA，经过Bam HI和Sac I双酶切双酶切鉴定。并将双酶切验证正确的重组克隆质粒送往公司测序。idi基因扩增来自于大肠杆菌MG1655基因组(ATCC 700926)，先通过IDI-1F和IDI-R，再通过IDI-2F和IDI-R扩增，并引入Sac I,EcoR I,Kpn I,Pme I,Nco I,SbfI,Nsi I,Xba I,Nde I,NotI和HindIII酶切位点，方便后续基因***；idi两轮扩增产物通过Sac I和Xho I位点***载体，构建的载体即pWHU4003，该质粒示意图如附图2所示，序列(不含骨架载体序列)如SEQ IDNO.2所示。
实施例二蛇孢菌素F生产菌株的构建
将甲羟戊酸途径的两个质粒pMH1和pFZ81同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得BL21(DE3)/pMH1/pFZ81(武汉大学.一种生产法尼烯的菌株及其应用：中国，CN201310209421.0.2013-08-14)，随后将蛇孢菌素表达质粒pWHU4003转化进入BL21(DE3)/pMH1/pFZ81中，获得初步蛇孢菌素F生产菌株OS3。
实施例三菌株摇瓶发酵、提取以及GC-MS定性检测
挑取三个待检测菌株的单菌落到含20mL/L甘油的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中(添加100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素抗生素)，于37℃、220rpm过夜培养，随后按10mL/L接种量接种到新鲜的同一培养基中28℃，220rpm继续培养至OD600约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，加入诱导剂96小时后。每次取样为500μL，17000g离心5min，移除上清后，重复一次离心并倒掉上清，收集菌体。加入500μL丙酮，漩涡振荡仪混匀5min，超声破碎仪破碎20min后，用GC-MS检测产物。
GC-MS分析条件和结果分析：
GC-MS为Varian 450GC-320TQ-MS三重四极杆质谱仪气相色谱，气相色谱柱为VF-5MS(30m×0.25mm,0.25μm薄膜厚度)，每次分析进样1μL，GC条件为60℃维持2分钟，然后30℃/min升温到150℃、10℃/min升温到180℃、2℃/min升温到210℃，最后保持210℃5min。MS结果如图3所示：分子量为358.3，碎片峰54.8、69.0、80.9、94.9、121.1、135.1、147.1、161.1、187.2、229.3、247.3、325.3、340.3。根据文献比对GC-MS碎片峰(Chiba R,Minami A,Gomi K,Oikawa H(2013)Identification of ophiobolin F synthase by a genomemining approach:a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus.Organicletters,2013,15(3):594-597.)，该化合物为蛇孢菌素F。
结论：本发明中构建的菌株OS3是可产生蛇孢菌素F的微生物。
实施例四蛇孢菌素F的HPLC-PDA定量方法
首先将蛇孢菌素F溶于色谱甲醇中，配成10mg/L的储备溶液。用液相甲醇溶解定容，配成浓度分别为0.4，0.2，0.1，0.05和0.025mg/mL的蛇孢菌素F。Waters 2998 HPLC-PDA检测，设置检测波长210纳米。使用柱子为Phenomenex Gemini C18 column(250×4.6mm,5μm)，温度为25℃，进样量10μL。流动相为100％乙腈洗脱30min，流速为1mL/min。
蛇孢菌素F保留时间为21.8min。待测样品中蛇孢菌素F含量的计算公式Y＝2.58*107X+145367.26。R2＝0.99921(附图4)
其中X：待测样品oph F面积；Y：待测样品中蛇孢菌素F含量。
结论：本发明显示HPLC-PDA检测方法蛇孢菌素F在质量浓度0.025-0.4mg/mL与峰面积线性关系良好。
实施例五不同碳源培养基对蛇孢菌素F产量的影响
本实施例探索了碳源甘油、葡萄糖、酒石酸铵、柠檬酸、***糖和木糖对蛇孢菌素合成的影响。首先从平板上挑选菌株单菌落3个至10mL LB培养基中，37℃、220rpm培养。待菌株生长至指数中后期，将1mL培养液全部转接至100mL 2xTYGly、2xTYGlu、2xTYAmm、2xTYCit、2xTYAra和2xTYXylo培养基，OD600约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，加入诱导剂96小时后诱导产物用HPLC-PDA方法定量蛇孢菌素F的量。本发明结果(见附图5)显示添加五碳糖的培养基2xTYAra(***糖)和2xTYXylo(木糖)产量高于2xTYGly、2xTYGlu、2xTYAmm、2xTYCit。
结论：通过优化培养基的碳源能够提高蛇孢菌素F的产量，且利用五碳糖(***糖和木糖)作为添加碳源能获得更高的蛇孢菌素F产量(见附图5)。
实施例六真菌来源合成途径相关基因对蛇孢菌素F产量的影响
使用Qiagen RNeasy Mini Extraction kit(74104)试剂盒从真菌TKYX429菌丝提取RNA，使用Thermo K1622反转录试剂盒采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法获取cDNA(武汉大学.一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因AuOS及其应用：中国，ZL201510130163.6.2015-06-03)。
分别利用引物Au6298-F和Au6298-R、Au11565-F和Au11565-R、11565C-F和Au11565-R、Au13192-F和Au13192-R、Au13192PT-F和Au13192PT-R、Au3446-F和Au3446，扩增Au6298、Au11565、Au11565PT、Au13192、Au13192PT和Au3446基因，PCR扩增产物连入pMD19-T载体(takara公司)，经测序验证。把片段和表达载体pWHU4003分别采用Pme I和Sbf I、SacI和Kpn I、Sac I和Kpn I、Nsi I和Hind III、Nsi I和Hind III、Kpn I和Sbf I双酶切，酶切产物回收后，运用相同的粘性末端将片段和载体连接到一起，分别获得质粒pWHU4004-pWHU4009(示意图见附图6-11，不含载体骨架序列如SEQ ID NO.3-8所示)。
参照本发明实施例二、三和四的方法构建菌株、发酵和定量检测。pWHU4004-pWHU4009构建的菌株对应菌株命名为OS4-OS9。发酵和检测产物的菌株包括OS3-OS9，比较真菌来源的基因对于蛇孢菌素F产量的影响。
结论：对比菌株OS3(BL21(DE3)/pMH1/pFZ81/pWHU4003)，过表达Au6298的OS4、Au11565的OS5和Au13192的OS5-OS9显著性增强了蛇孢菌素F的产量(见图12)。此外，倍半萜合成酶Au6298没有环化结构域，不会引入其它化合物的可能性，因此基因Au6298是本发明筛选到的显著性增加蛇孢菌素F产量的最优的基因原件(该基因原件搭载在质粒pWHU4004上)。
实施例七融合蛋白修饰oph合成酶对蛇孢菌素F产量的影响
N端的融合蛋白GST、SUMO和TrxA序列分别来自pGEX-6P-1、pSmart-I和pET32a(+)质粒。使用限制性内切酶Xba I和Bam HI载体将上述三个质粒进行双酶切，消化产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，酶切片段回收。使用Bam HI和Sac I酶消化，将Au8003基因***表达载体pET21a(+)，测序验证获取pWHU4001质粒。然后使用限制性内切酶Xba I和Bam HI酶切pWHU4001质粒。pWHU4001质粒分别和包含融合蛋白的酶切产物使用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转入感受态细胞。抽提质粒，并将双酶切验证正确的重组克隆质粒送往公司进行测序，分别构建出表达载体pWHU4014、pWHU4015和pWHU4016(示意图见附图13-15，不含骨架载体序列如SEQ ID NO.9-11所示)。
参照本发明实施例二、三和四的方法构建生产菌株，随后发酵和定量检测。pWHU4001、pWHU4014-pWHU4016构建的菌株对应菌株命名为OS2、OS14-OS16。发酵和检测产物的菌株包括OS2和OS14-OS16，比较融合蛋白修饰蛇孢菌素合成酶对于蛇孢菌素F产量的影响。
结论：对比不含融合标签的菌株OS1，包含SUMO融合标签的OS15和Trx标签的OS16均都显著性增加蛇孢菌素F的产量(见附图16)。因此融合标签修饰蛇孢菌素合成酶对该类化合物产物有明显的促进作用。
实施例八系统发育指导的理性定点突变oph合成酶
以oph合成酶Au8003的环化结构域(从氨基末端开始1-332氨基酸)为检索序列，利用NCBI数据库找到100个同源性蛋白(一致性大于30％和Evalue≥2e-111)。为了降低系统发育相似的蛋白被反复测序，增加了该类的权重，本发明利用Mega 7.0软件将同源蛋白建立进化树，删除位于相同分支末端的重复附录。删除后仅保留30个核酸序列：Au8003、AcOS(A1C8C3)、PaFS(A2PZA5)、BAX09282.1、KND93463.1、KIN08340.1、XP_001239468.1、RHZ64856.1、XP_026614492.1、PGH21525.1、XP_007686878.1、KGQ06553.1、XP_023880808.1、GAO85920.1、EKG15508.1、CZT06311.1、RFN55282.1、XP_002340183.1、KIK55691.1、RMD43624.1、KFX51391.1、GAP91440.1、RAR00829.1、PTU17284.1、OTA08201.1、AHY23929.1、RDW88454.1、KXX73481.1、XP_018034954.1、XP_003174941.1。利用在线服务器Weblogo可视化，比对oph合成酶Au8003蛋白的氨基酸和对应同源蛋白的偏好性，找到13个待突变点S38A、D87E、E95V、Q122D、R131K、A134Q、L144I、H190F、M224L、Y231F、Y231W、N238A和A274L。
对Au8003蛋白环化域上的38、87、95、122、131、134、144、190、224、231、238和274进行定点突变是通过寡核苷酸引物介导的PCR法。20μL体系的PCR反应分别在不同的PCR管中进行。以pWH4003为模板，使用2×TSINGKE Master Mix试剂盒。上游片段的扩增加入1μL共同的上游片段的扩增引物8003Mut-F，分别加入1μL引物S38A-F、D87E-F、E95V-F、Q122D-F、R131K-F、A134Q-F、L144I-F、H190F-F、M224L-F、Y231F-F、Y231W-F、N238A-F、A274L-F。下游片段的扩增加入1μL下游片段的扩增引物8003Mut-R，分别加入引物S38A-R、D87E-R、E95V-R、Q122D-R、R131K-R、A134Q-R、L144I-R、H190F-R、M225L-R、Y232F-R、Y231W-R、N238A-R、A274L-R，并用双蒸水补齐体系。将上述PCR管进行瞬间离心后，置于C1000 TouchTMThermal Cycler PCR仪内，相应的PCR反应程序为：在95℃预变性3min，进入循环扩增阶段：95℃30s→58℃30s→72℃90s，循环15次，最后在72℃保温5min。各取1μL上、下游扩增片段作为模板，上下游引物8003Mut-F和8003Mut-R均加2μL，25μL 25μ Lut-R物30s→72℃，最后用19μL双蒸水补齐50μL体系。PCR反应程序为：在95℃预变性3min，进入循环扩增阶段：95℃30s→58℃30s→72℃90s，循环20次，最后在72℃保温5min。酶体系回收之后，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，回收1000-1500bp之间的核酸片段，***pMD19克隆载体，送至公司测序验证。测序正确的载体和pWHU4003都使用Bam HI和Sac II双酶切，酶切回收对应片段，使用T4DNA连接酶16℃过夜连接，分别构建出对应的表达载体，命名pWHU4003(1)到pWHU4003(13)。
参照本发明实施例二、三和四的方法构建生产蛇孢菌素F菌株、发酵并定量检测。转入载体pWHU4003(1)到pWHU4003(13)的菌株命名分别为OS3M1-OS3M13。本实施案例发酵和检测产物的菌株包括OS3和OS3M1-OS3M13，比较定点突变蛇孢菌素合成酶对于蛇孢菌素F产量的影响。
结论：所述的突变株D87E，E95V，Q122D，R131K和H190F显著性提高蛇孢菌素F的产量(见附图17)。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 合成二倍半萜蛇孢菌素F的系统和微生物及其应用
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagtaca aatatagcac catcgtggac agcagcaagt gggacccgga gggtctgatc 60
gaaggcattc cgctgcgtaa gcacgaagcg ggcgacctgg aggaagtggg tagcttccgt 120
gttcaggaag actggcgtcg tctggttggc ccggtggaaa acccgttccg tggtagcctg 180
ggcccggaga tcagctttat tacctacacc gtgccggaat gcctgccgga gcgtctggaa 240
gcgatcagct acggtctgga ctatggcttt ctgcacgacg atgagatcga taccaagatt 300
gaggaagcgg aactggacga tgttggtgcg gcgctggcgc agggtggcag caccggtaaa 360
attcaagagg gcaccaagag cagcggcaag cgtaaaatgg cggcgcaact gctgcgtgag 420
atgatggcgc tggacccgga acgtgcgatg accctggcga aaagctgggc gcagggcgtg 480
caacacagcg cgcgtcgtgt tgaggaaaag gactggaaaa gcctggatga atacatcccg 540
ttccgttgca tggatctggg ttatatgcac tggcacggcc tggtgacctt tggttgcgcg 600
atcaccgttc cggaggaaga ggaagaggaa cgtcgtaccc tgctggagcc ggcggttatt 660
gcgtgcctga tgaccaacga cctgttcagc tacgaaaagg agaaaaacga taacaacccg 720
cagaacgcgg ttgcggtgat catgaagatt cacaaatgca gcgaggaaga ggcgcgtgac 780
atctgcaaac aacgtattcg tctggagtgc cgtaaatacg cgcgtatcgt gaaggaaacc 840
ctggcgcgta ccgacattag cctggatctg aagcgttaca tcgaaattat gcagtatacc 900
gttagcggca actgggcgtg gagcacccaa tgcccgcgtt atcacgcgga tgcgaaattt 960
aacgagctgc agatgctgcg tgcggaacac ggtgtggcga aatacccggc gcgttatagc 1020
ctggagaacc gtaagaacgg tgcgaacggc gttaacggtg tgaacggcat caacggtgtt 1080
aacggcgtga acggtgttaa cggcaagcgt aaacgtagcg gtgaagagac cgcggacgat 1140
gcgcgtacca acggtaacgg catcaagaaa ccggcgcacg ttctggagta ccgtgacagc 1200
ctggtgctgg aagatattgt tgcgctgagc ctggactgga acctgccgga cctgagcgat 1260
ggcgtggttg tgcagccgta caaatatctg accagcctgc cgagcaaggg tttccgtgac 1320
caagcgatcg atagcctgaa cacctggctg cgtgtgccga ccaagaccac caaaatgatc 1380
aaggacgtta ttaaaatgct gcacagcgcg agcctgatgc tggacgatat tgaggataac 1440
agcccgctgc gtcgtggcaa gccgagcacc cacgtgatct acggtaacgc gcagaccatt 1500
aacagcgcga cctaccaata taccgaagcg accggtctgg cggcgcgtct gccgaacccg 1560
accagcctgc gtatctacct ggaagaggtt cagcaactgt atattggtca gagctacgac 1620
ctgtattgga cccacaacgc gctgtgcccg agcatcccgg agtatctgaa aatggtggat 1680
caaaagaccg gtggcctgtt tcgtatgctg acccgtctga tggttagcga aagcccggcg 1740
cgtagcagca ttctggacca gaccctgtac ccgctgagcc acctgatcgg tcgtttcttt 1800
cagattcgtg acgattatca aaacctggcg agcgcggagt acgcgcgtca aaaaggctat 1860
gcggaggacc tggatgaggg taagtacagc ttcaccctga tccactgcat taacaccctg 1920
gaagcggagg cgagcctggc gagcgaaaaa atggcgctgc gtgcgtttct gatcaagcgt 1980
cgtgtggaca gcagcctgag caacgagagc aaacgtgaag ttctggatat tatgaagaaa 2040
accaagagcc tggagtatac cctgggcgtg ctgcgtgcgc tgcaggcgga actggagaaa 2100
gaagttgaca gcctggaggc gaagttcggt gaagagaact ttagcctgcg tatgatgctg 2160
gaactgctga aagtgtaa 2178
<210> 2
<211> 2873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagtaca aatatagcac catcgtggac agcagcaagt gggacccgga gggtctgatc 60
gaaggcattc cgctgcgtaa gcacgaagcg ggcgacctgg aggaagtggg tagcttccgt 120
gttcaggaag actggcgtcg tctggttggc ccggtggaaa acccgttccg tggtagcctg 180
ggcccggaga tcagctttat tacctacacc gtgccggaat gcctgccgga gcgtctggaa 240
gcgatcagct acggtctgga ctatggcttt ctgcacgacg atgagatcga taccaagatt 300
gaggaagcgg aactggacga tgttggtgcg gcgctggcgc agggtggcag caccggtaaa 360
attcaagagg gcaccaagag cagcggcaag cgtaaaatgg cggcgcaact gctgcgtgag 420
atgatggcgc tggacccgga acgtgcgatg accctggcga aaagctgggc gcagggcgtg 480
caacacagcg cgcgtcgtgt tgaggaaaag gactggaaaa gcctggatga atacatcccg 540
ttccgttgca tggatctggg ttatatgcac tggcacggcc tggtgacctt tggttgcgcg 600
atcaccgttc cggaggaaga ggaagaggaa cgtcgtaccc tgctggagcc ggcggttatt 660
gcgtgcctga tgaccaacga cctgttcagc tacgaaaagg agaaaaacga taacaacccg 720
cagaacgcgg ttgcggtgat catgaagatt cacaaatgca gcgaggaaga ggcgcgtgac 780
atctgcaaac aacgtattcg tctggagtgc cgtaaatacg cgcgtatcgt gaaggaaacc 840
ctggcgcgta ccgacattag cctggatctg aagcgttaca tcgaaattat gcagtatacc 900
gttagcggca actgggcgtg gagcacccaa tgcccgcgtt atcacgcgga tgcgaaattt 960
aacgagctgc agatgctgcg tgcggaacac ggtgtggcga aatacccggc gcgttatagc 1020
ctggagaacc gtaagaacgg tgcgaacggc gttaacggtg tgaacggcat caacggtgtt 1080
aacggcgtga acggtgttaa cggcaagcgt aaacgtagcg gtgaagagac cgcggacgat 1140
gcgcgtacca acggtaacgg catcaagaaa ccggcgcacg ttctggagta ccgtgacagc 1200
ctggtgctgg aagatattgt tgcgctgagc ctggactgga acctgccgga cctgagcgat 1260
ggcgtggttg tgcagccgta caaatatctg accagcctgc cgagcaaggg tttccgtgac 1320
caagcgatcg atagcctgaa cacctggctg cgtgtgccga ccaagaccac caaaatgatc 1380
aaggacgtta ttaaaatgct gcacagcgcg agcctgatgc tggacgatat tgaggataac 1440
agcccgctgc gtcgtggcaa gccgagcacc cacgtgatct acggtaacgc gcagaccatt 1500
aacagcgcga cctaccaata taccgaagcg accggtctgg cggcgcgtct gccgaacccg 1560
accagcctgc gtatctacct ggaagaggtt cagcaactgt atattggtca gagctacgac 1620
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caaaagaccg gtggcctgtt tcgtatgctg acccgtctga tggttagcga aagcccggcg 1740
cgtagcagca ttctggacca gaccctgtac ccgctgagcc acctgatcgg tcgtttcttt 1800
cagattcgtg acgattatca aaacctggcg agcgcggagt acgcgcgtca aaaaggctat 1860
gcggaggacc tggatgaggg taagtacagc ttcaccctga tccactgcat taacaccctg 1920
gaagcggagg cgagcctggc gagcgaaaaa atggcgctgc gtgcgtttct gatcaagcgt 1980
cgtgtggaca gcagcctgag caacgagagc aaacgtgaag ttctggatat tatgaagaaa 2040
accaagagcc tggagtatac cctgggcgtg ctgcgtgcgc tgcaggcgga actggagaaa 2100
gaagttgaca gcctggaggc gaagttcggt gaagagaact ttagcctgcg tatgatgctg 2160
gaactgctga aagtgtaaga gctcgaattc ggtaccgttt aaacccatgg cctgcaggat 2220
gcattctaga catatggcgg ccgcaagctt aggaggatta ctatatgggc agcagccatc 2280
atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatgcaa acggaacacg 2340
tcattttatt gaatgcacag ggagttccca cgggtacgct ggaaaagtat gccgcacaca 2400
cggcagacac ccgcttacat ctcgcgttct ccagttggct gtttaatgcc aaaggacaat 2460
tattagttac ccgccgcgca ctgagcaaaa aagcatggcc tggcgtgtgg actaactcgg 2520
tttgtgggca cccacaactg ggagaaagca acgaagacgc agtgatccgc cgttgccgtt 2580
atgagcttgg cgtggaaatt acgcctcctg aatctatcta tcctgacttt cgctaccgcg 2640
ccaccgatcc gagtggcatt gtggaaaatg aagtgtgtcc ggtatttgcc gcacgcacca 2700
ctagtgcgtt acagatcaat gatgatgaag tgatggatta tcaatggtgt gatttagcag 2760
atgtattaca cggtattgat gccacgccgt gggcgttcag tccgtggatg gtgatgcagg 2820
cgacaaatcg cgaagccaga aaacgattat ctgcatttac ccagcttaaa taa 2873
<210> 3
<211> 3919
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagtaca aatatagcac catcgtggac agcagcaagt gggacccgga gggtctgatc 60
gaaggcattc cgctgcgtaa gcacgaagcg ggcgacctgg aggaagtggg tagcttccgt 120
gttcaggaag actggcgtcg tctggttggc ccggtggaaa acccgttccg tggtagcctg 180
ggcccggaga tcagctttat tacctacacc gtgccggaat gcctgccgga gcgtctggaa 240
gcgatcagct acggtctgga ctatggcttt ctgcacgacg atgagatcga taccaagatt 300
gaggaagcgg aactggacga tgttggtgcg gcgctggcgc agggtggcag caccggtaaa 360
attcaagagg gcaccaagag cagcggcaag cgtaaaatgg cggcgcaact gctgcgtgag 420
atgatggcgc tggacccgga acgtgcgatg accctggcga aaagctgggc gcagggcgtg 480
caacacagcg cgcgtcgtgt tgaggaaaag gactggaaaa gcctggatga atacatcccg 540
ttccgttgca tggatctggg ttatatgcac tggcacggcc tggtgacctt tggttgcgcg 600
atcaccgttc cggaggaaga ggaagaggaa cgtcgtaccc tgctggagcc ggcggttatt 660
gcgtgcctga tgaccaacga cctgttcagc tacgaaaagg agaaaaacga taacaacccg 720
cagaacgcgg ttgcggtgat catgaagatt cacaaatgca gcgaggaaga ggcgcgtgac 780
atctgcaaac aacgtattcg tctggagtgc cgtaaatacg cgcgtatcgt gaaggaaacc 840
ctggcgcgta ccgacattag cctggatctg aagcgttaca tcgaaattat gcagtatacc 900
gttagcggca actgggcgtg gagcacccaa tgcccgcgtt atcacgcgga tgcgaaattt 960
aacgagctgc agatgctgcg tgcggaacac ggtgtggcga aatacccggc gcgttatagc 1020
ctggagaacc gtaagaacgg tgcgaacggc gttaacggtg tgaacggcat caacggtgtt 1080
aacggcgtga acggtgttaa cggcaagcgt aaacgtagcg gtgaagagac cgcggacgat 1140
gcgcgtacca acggtaacgg catcaagaaa ccggcgcacg ttctggagta ccgtgacagc 1200
ctggtgctgg aagatattgt tgcgctgagc ctggactgga acctgccgga cctgagcgat 1260
ggcgtggttg tgcagccgta caaatatctg accagcctgc cgagcaaggg tttccgtgac 1320
caagcgatcg atagcctgaa cacctggctg cgtgtgccga ccaagaccac caaaatgatc 1380
aaggacgtta ttaaaatgct gcacagcgcg agcctgatgc tggacgatat tgaggataac 1440
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accagcctgc gtatctacct ggaagaggtt cagcaactgt atattggtca gagctacgac 1620
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ccccgaggtc attggaaaga taggaaccga tattcaggac aacaagtgct cgtggattgt 3000
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tcgcaaggac gccgctctcg aggccaaggt caaggagctc ttcaaggagc tggatctgga 3120
gacagtctac aaggagtatg aggagaagat tgtgggcgag atcaagacta agatcgcggc 3180
cgtggacgag tcccagggac tgaagaagga ggtctttgag gccttcctag gtaagattta 3240
caagcgcacc aaataacctg caggatgcat tctagacata tggcggccgc aagcttagga 3300
ggattactat atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg 3360
cggcagccat atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat gcacagggag ttcccacggg 3420
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ttggctgttt aatgccaaag gacaattatt agttacccgc cgcgcactga gcaaaaaagc 3540
atggcctggc gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca caactgggag aaagcaacga 3600
agacgcagtg atccgccgtt gccgttatga gcttggcgtg gaaattacgc ctcctgaatc 3660
tatctatcct gactttcgct accgcgccac cgatccgagt ggcattgtgg aaaatgaagt 3720
gtgtccggta tttgccgcac gcaccactag tgcgttacag atcaatgatg atgaagtgat 3780
ggattatcaa tggtgtgatt tagcagatgt attacacggt attgatgcca cgccgtgggc 3840
gttcagtccg tggatggtga tgcaggcgac aaatcgcgaa gccagaaaac gattatctgc 3900
atttacccag cttaaataa 3919
<210> 4
<211> 4960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggagtaca aatatagcac catcgtggac agcagcaagt gggacccgga gggtctgatc 60
gaaggcattc cgctgcgtaa gcacgaagcg ggcgacctgg aggaagtggg tagcttccgt 120
gttcaggaag actggcgtcg tctggttggc ccggtggaaa acccgttccg tggtagcctg 180
ggcccggaga tcagctttat tacctacacc gtgccggaat gcctgccgga gcgtctggaa 240
gcgatcagct acggtctgga ctatggcttt ctgcacgacg atgagatcga taccaagatt 300
gaggaagcgg aactggacga tgttggtgcg gcgctggcgc agggtggcag caccggtaaa 360
attcaagagg gcaccaagag cagcggcaag cgtaaaatgg cggcgcaact gctgcgtgag 420
atgatggcgc tggacccgga acgtgcgatg accctggcga aaagctgggc gcagggcgtg 480
caacacagcg cgcgtcgtgt tgaggaaaag gactggaaaa gcctggatga atacatcccg 540
ttccgttgca tggatctggg ttatatgcac tggcacggcc tggtgacctt tggttgcgcg 600
atcaccgttc cggaggaaga ggaagaggaa cgtcgtaccc tgctggagcc ggcggttatt 660
gcgtgcctga tgaccaacga cctgttcagc tacgaaaagg agaaaaacga taacaacccg 720
cagaacgcgg ttgcggtgat catgaagatt cacaaatgca gcgaggaaga ggcgcgtgac 780
atctgcaaac aacgtattcg tctggagtgc cgtaaatacg cgcgtatcgt gaaggaaacc 840
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ccggagggtc tgatcgaagg cattccgctg cgtaagcacg aagcgggcga cctggaggaa 600
gtgggtagct tccgtgttca ggaagactgg cgtcgtctgg ttggcccggt ggaaaacccg 660
ttccgtggta gcctgggccc ggagatcagc tttattacct acaccgtgcc ggaatgcctg 720
ccggagcgtc tggaagcgat cagctacggt ctggactatg gctttctgca cgacgatgag 780
atcgatacca agattgagga agcggaactg gacgatgttg gtgcggcgct ggcgcagggt 840
ggcagcaccg gtaaaattca agagggcacc aagagcagcg gcaagcgtaa aatggcggcg 900
caactgctgc gtgagatgat ggcgctggac ccggaacgtg cgatgaccct ggcgaaaagc 960
tgggcgcagg gcgtgcaaca cagcgcgcgt cgtgttgagg aaaaggactg gaaaagcctg 1020
gatgaataca tcccgttccg ttgcatggat ctgggttata tgcactggca cggcctggtg 1080
acctttggtt gcgcgatcac cgttccggag gaagaggaag aggaacgtcg taccctgctg 1140
gagccggcgg ttattgcgtg cctgatgacc aacgacctgt tcagctacga aaaggagaaa 1200
aacgataaca acccgcagaa cgcggttgcg gtgatcatga agattcacaa atgcagcgag 1260
gaagaggcgc gtgacatctg caaacaacgt attcgtctgg agtgccgtaa atacgcgcgt 1320
atcgtgaagg aaaccctggc gcgtaccgac attagcctgg atctgaagcg ttacatcgaa 1380
attatgcagt ataccgttag cggcaactgg gcgtggagca cccaatgccc gcgttatcac 1440
gcggatgcga aatttaacga gctgcagatg ctgcgtgcgg aacacggtgt ggcgaaatac 1500
ccggcgcgtt atagcctgga gaaccgtaag aacggtgcga acggcgttaa cggtgtgaac 1560
ggcatcaacg gtgttaacgg cgtgaacggt gttaacggca agcgtaaacg tagcggtgaa 1620
gagaccgcgg acgatgcgcg taccaacggt aacggcatca agaaaccggc gcacgttctg 1680
gagtaccgtg acagcctggt gctggaagat attgttgcgc tgagcctgga ctggaacctg 1740
ccggacctga gcgatggcgt ggttgtgcag ccgtacaaat atctgaccag cctgccgagc 1800
aagggtttcc gtgaccaagc gatcgatagc ctgaacacct ggctgcgtgt gccgaccaag 1860
accaccaaaa tgatcaagga cgttattaaa atgctgcaca gcgcgagcct gatgctggac 1920
gatattgagg ataacagccc gctgcgtcgt ggcaagccga gcacccacgt gatctacggt 1980
aacgcgcaga ccattaacag cgcgacctac caatataccg aagcgaccgg tctggcggcg 2040
cgtctgccga acccgaccag cctgcgtatc tacctggaag aggttcagca actgtatatt 2100
ggtcagagct acgacctgta ttggacccac aacgcgctgt gcccgagcat cccggagtat 2160
ctgaaaatgg tggatcaaaa gaccggtggc ctgtttcgta tgctgacccg tctgatggtt 2220
agcgaaagcc cggcgcgtag cagcattctg gaccagaccc tgtacccgct gagccacctg 2280
atcggtcgtt tctttcagat tcgtgacgat tatcaaaacc tggcgagcgc ggagtacgcg 2340
cgtcaaaaag gctatgcgga ggacctggat gagggtaagt acagcttcac cctgatccac 2400
tgcattaaca ccctggaagc ggaggcgagc ctggcgagcg aaaaaatggc gctgcgtgcg 2460
tttctgatca agcgtcgtgt ggacagcagc ctgagcaacg agagcaaacg tgaagttctg 2520
gatattatga agaaaaccaa gagcctggag tataccctgg gcgtgctgcg tgcgctgcag 2580
gcggaactgg agaaagaagt tgacagcctg gaggcgaagt tcggtgaaga gaactttagc 2640
ctgcgtatga tgctggaact gctgaaagtg taa 2673
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgcaggatg cattctagac atatggcggc cgcaagctta ggaggattac tatatgggc 59
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagctcgaat tcggtaccgt ttaaacccat ggcctgcagg atgcattcta gacatatgg 59
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggctcgagt tatttaagct gggt 24
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtttaaacag gaggtaatac tcatgtcttc accgcgtgcc gc 42
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctgcaggtt atttggtgcg cttgtaaatc ttacctagg 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccgagctca ggaggtaata ctcatgccac aaacacaatc cgaatcatac 50
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttggtacct taaaccttca gcagcagcag aaagatac 38
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggtaatactc atggctctgt tattagcagt ttttcagagc tttagcccgc gttatcaac 59
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gacgagctca ggaggtaata ctcatggctc tgttattagc agtt 44
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggatgcata ggaggtaata ctcatgccac aaacacaatc cgaatcatac 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gggatgcata ggaggtaata ctcatgtcag tctcgtcggc cgcttc 46
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaagcttta caccttcaac ctctgcacca acaagc 36
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggtaccagga ggtaatactc atggactttc cgcagcaact cg 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cctgcaggtt acttcctccg gttcatggcc 30
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggatcca tggagtacaa atatagcacc atcgtg 36
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgtaaacgt agcggtgaag agaccgcgga cgatgc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcgacctgg aggaagtggg tgcattccgt gttcaggaag actggcgtcg tc 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacgacgcca gtcttcctga acacggaatg cacccacttc ctccaggtcg cc 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atcagctacg gtctggaata tggctttctg cac 33
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgcagaaag ccatattcca gaccgtagct gat 33
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atggctttct gcacgacgat gttatcgata ccaagattga ggaagcggaa ctg 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cagttccgct tcctcaatct tggtatcgat aacatcgtcg tgcagaaagc cat 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggcgcagg gtggcagcac cggtaaaatt gatgagggca ccaagagcag cgg 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ccgctgctct tggtgccctc atcaatttta ccggtgctgc caccctgcgc cag 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagagcagcg gcaagaaaaa aatggcggcg caa 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgcgccgcc atttttttct tgccgctgct ctt 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggcaccaaga gcagcggcaa gcgtaaaatg caggcgcaac tgctgcgtga gat 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atctcacgca gcagttgcgc ctgcatttta cgcttgccgc tgctcttggt gcc 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggcgcaac tgctgcgtga gatgatggcg attgacccgg aacgtgcgat gac 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccaggccg tgccaaaaca tataacccag atc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttattgcgt gcctgctgac caacgacctg ttc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaacaggtcg ttggtcatca ggcacgcaat aac 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cgtgcctgat gaccaacgac ctgttcagct ttgaaaagga gaaaaacgat aa 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ttatcgtttt tctccttttc aaagctgaac aggtcgttgg tcatcaggca cg 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtgcctgat gaccaacgac ctgttcagct gggaaaagga gaaaaacgat aa 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttatcgtttt tctccttttc ccagctgaac aggtcgttgg tcatcaggca cg 52
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gttcagcttt gaaaaggaga aaaacgatgc aaacccgcag aacgcggttg c 51
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtgccgta aatacctgcg tatcgtgaag gaa 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttccttcacg atacgcaggt atttacggca ctc 33
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