一种r-氰醇裂解酶的制备方法及其应用

文档序号：1841915 发布日期：2021-11-16 浏览：15次 >En<

阅读说明：本技术 一种r-氰醇裂解酶的制备方法及其应用 (Preparation method and application of R-cyanohydrin lyase ) 是由曹金辉宗匡喻海亮曾鹏刘建明陈文欢于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种新型的、来源于芒果的R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用。具体地,通过通过构建随机突变和点饱和突变文库,以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶,其方法安全、简单且易于操作。(The invention provides a preparation method and application of a novel R-cyanohydrin lyase derived from mango. Specifically, the method is safe, simple and easy to operate by constructing random mutation and point saturation mutation libraries and screening in high throughput to obtain various mutated cyanohydrin lyases.)

一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

背景技术

手性氰醇(酯)是一类在工业不对称合成生产中具有重要地位的手性原料，同时，它能很容易地转化为手性α-羟基酸(酯)、α-氨基酸、β-氨基醇等具有重要商业价值的医药和农药中间体，因此，手性氰醇的合成一直是学术界和工业界的关注热点之一。手性氰醇的合成有一定的难度和挑战性，其不对称合成需要使用手性化学或者生物催化剂，其中生物催化剂(氰醇酶)由于来源丰富、成本低廉、催化效率高、反应条件温和、产率和光学纯度高、底物适用范围广等特点，而远远优于化学催化剂，被广泛使用在有机合成工业中。

氰醇(裂解)酶催化HCN与醛酮的加成，生成α-手性氰醇产物。天然的R-氰醇酶存在于蔷薇科李属植物及一些水果中，目前只有来源于蔷薇科植物的才是工业化应用成功的案例，比如Prunus amygdalus(Pa HNL)、Prunus domestica(Pd HNL)或者Prunus mume(PmHNL)等，其中又以Prunus amygdalus(Pa HNL)的氰醇裂解酶为主，所以寻找其它来源的氰醇酶，并且将其应用到手性氰醇的工业化生产中，具有很重要的实际意义。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有R-氰醇裂解酶制备方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是，提供一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种R-氰醇裂解酶的制备方法，包括，

R-氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将R-氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示；

添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；

制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；

导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；

菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述突变处理的方式为易错PCR。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述制备重组质粒中，表达载体为pET26b(+)，其N端包含信号肽pelB leader。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述菌株的分泌和表达中，所述培养液为LB培养基。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述菌株的分泌和表达中，还包括诱导培养，当培养基中OD₆₀₀＝1.0后，加入0.2mM IPTG并且保持温度为30℃，诱导表达4～5h。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法所得到产品的应用，其中：所述应用，包括，

将底物溶解于叔丁基甲醚(MTBE)中，得到底物的MTBE溶液；将所得到的产品稀释在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，并调节pH到3.4，得到酶液；将上述底物的MTBE溶液和酶液充分混合，使体系降温到10℃，搅拌成乳浊液后，加入液体氢氰酸反应得到R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法所得到产品的应用，其中：所述底物为苯乙氰醇和/或邻甲基苯乙氰醇中的一种或两种；所述底物的MTBE溶液浓度为8微升每毫升缓冲液；所述底物的MTBE溶液与酶液的体积比为2：1.2～1.7；所述液体氢氰酸的添加量与底物的MTBE溶液与酶液的总体积比为4～3.5：1.2。

作为本发明所述R-氰醇裂解酶的制备方法所制得产品，其中：所述产品，其R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇收率均≥95％，手性值(e.e值)均≥99.5％。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种新型的、来源于芒果的R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用。具体地，通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶，合成得到的R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇收率均≥99.5％，手性值(e.e值)均≥99.5％。其方法安全、简单且易于操作。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明的实施例中，采用来源于芒果(Mangifera indica)的R-选择性氰醇裂解酶。

本发明中所用叔丁基甲醚与液体氢氰酸均为分析纯，其他原料和试剂，若无特殊说明，均为市售。

实施例1

本发明设计的具体原理为通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶。

R-氰醇裂解酶突变子来源为野生型氰醇裂解酶，其具体的合成方法为：将氰醇裂解酶野生基因如Seq ID No.1所示，或者将氰醇裂解酶突变子基因如Seq ID No.2所示，加入酶切位点NdeI和HindIII，DNA酶切纯化后插入到表达载体pET26b(+)中得到重组质粒，将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)中构建成重组表达菌株。上述重组菌株在LB培养基中培养到OD₆₀₀＝1.0后，加入0.2mM IPTG并在30℃诱导培养4～5小时，离心收集得到野生型或者突变子细胞，细胞超声裂解后得到粗酶液。

实施例2

野生型氰醇裂解酶突变子的制备方法如下：

将芒果(Mangifera indica)的氰醇裂解酶野生基因序列如Seq ID No.1所示，通过易错PCR的方式导入随机突变和(或者)基于酶蛋白结构/模拟底物对接而的导入的点饱和突变，然后进行高通量筛选，得到我方发明中氰醇裂解酶野生型突变子如Seq ID No.2所示。

芒果(Mangifera indica)的野生基因氰醇裂解酶进行转录翻译后的蛋白序列如Seq ID No.3所示，野生型氰醇裂解酶突变子翻译的蛋白序列如Seq ID No.4所示，野生型氰醇裂解酶突变子相较野生氰醇裂解酶相比有着109位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸，110位的天冬酰胺突变为丙氨酸或者丝氨酸，321位的异亮氨酸突变为苏氨酸或者丙氨酸，354位的脯氨酸突变为异亮氨酸，355位的丝氨酸突变为亮氨酸的区别，Seq ID No.4表示了其中一种蛋白质序列的可能，但是其他各种蛋白质序列发生突变的可能性也有着相同的性能。

R-氰醇裂解酶突变子基因除Seq ID No.2所示外，第325～327位更改为ATG、第328～330位更改为GCT或AGT、第961～963位更改为ACT或GCT，第1060～1062位更改为ATA，第1063～1065位更改为TTA或者TTG，还包括其中任一位点发生以上所述变化的任意情况。

实施例3

氰醇酶高通量筛选的步骤如下：在25℃下，于96孔板里依次加入130μL pH＝5.0的100mM磷酸钾-柠檬酸缓冲液、20μL稀释的氰醇裂解酶液，最后加入50μL的苯乙氰醇或者邻甲基苯乙氰醇的底物溶液，使用酶标仪在280nm处读取吸光值变化5分钟，吸光值变化大小代表酶活高低。

所述底物溶液：使用100mM pH＝3.5磷酸钾-柠檬酸缓冲液，配制浓度为8微升每毫升缓冲液。

实施例4

R-氰醇裂解酶的应用：用于合成R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇的流程方法如下。

将15mmol底物溶解于2.1mL叔丁基甲醚(MTBE)中，得到底物的MTBE溶液。将所得到的氰醇酶稀释在10mM磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，使总体积为3.7mL，并调节pH到3.4。将上述底物的MTBE溶液和酶液充分混合，使体系降温到10℃，搅拌成乳浊液后，加入1.2ml液体氢氰酸开始反应。

不同时间点取样，在吡啶和二氯甲烷存在情况下，用乙酸酐进行衍生，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上分析，得到底物转化率和对映异构体值。

底物转化完毕后，加入1倍水相体积的MTBE，萃取三次，合并有机相并无水硫酸钠脱水后，减压浓缩得到产品。15mmol底物添加量下，产品收率、产品手性值与氰醇酶添加量的关系如表1所示。

表1产品收率、产品手性值与氰醇酶添加量的关系

由表1可以得出，合成得到的R-苯乙氰醇和R-邻甲基苯乙氰醇收率均≥99.5％，手性值(e.e值)均≥99.5％。

本发明提供了一种新型的、来源于芒果的R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用。具体地，通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶，其方法安全、简单且易于操作。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

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