阅读说明：本技术 一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法 (Preparation method of surface grafted recombinant epidermal growth factor nanofiber ) 是由 汤佳鹏 葛彦 操维芳 朱俐 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子新型纳米纤维的制备方法,包括(1)将一定量O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90％乙酸溶液,搅拌均匀,得到纺丝液；(2)采用纺丝液进行静电纺丝,得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；(3)将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性,烘干之后经等离子处理器处理活化；(4)活化的纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子EGF和CoCl<Sub>2</Sub>的DMEM培养基中进行负压闪爆,之后进行接枝反应,离心冻干。本发明制备的纳米纤维是一种能够诱导组织上皮损伤部的再生的医疗用材料,能够刺激多种细胞的增殖,适用于表皮细胞、内皮细胞。(The invention discloses a preparation method of novel plasma surface grafted recombinant epidermal growth factor nanofiber, which comprises the following steps(1) Completely dissolving a certain amount of O-carboxymethyl chitosan and polyoxyethylene in a 90% acetic acid solution, and uniformly stirring to obtain a spinning solution; (2) performing electrostatic spinning by using the spinning solution to obtain O-carboxymethyl chitosan/polyoxyethylene nano-fibers; (3) washing the O-carboxymethyl chitosan/polyethylene oxide nano-fiber to be neutral by using a DMEM culture medium, drying, and then treating and activating by using a plasma processor; (4) soaking the activated nanofiber in the solution containing recombinant epidermal growth factors EGF and CoCl 2 The DMEM medium is subjected to negative pressure flash explosion, then grafting reaction is carried out, and centrifugal freeze-drying is carried out. The nanofiber prepared by the invention is a medical material capable of inducing the regeneration of a tissue epithelial injury part, can stimulate the proliferation of various cells, and is suitable for epidermal cells and endothelial cells.)

一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，尤其涉及一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法。

背景技术

羧甲基壳聚糖及其多种衍生物均具有不同程度的抗感染作用。小分子的脱乙酰壳聚糖具有质子化铵，质子化铵与细菌带负电荷的细胞膜作用，吸附和聚沉细菌，同时穿透细胞壁进入细胞内，扰乱细菌的新陈代谢及合成而具有抗菌作用。相对分子量为1500的脱乙酰壳聚糖对大肠杆菌的抑制效果最强，随着分子量增大，则抑菌作用下降。脱乙酰壳聚糖对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、小肠结尖耶尔氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和李斯特单核增生菌，均有较强的抑制作用。羧甲基壳聚糖已被制成无纺布、流延膜、涂层纱布等多种医用敷料用于临床，其中羧甲基壳聚糖与醋酸制成的无纺布透气透水性能极佳，用于大面积烧伤烫伤，抗感染和促进伤口愈合效果很好。

1975年首次从人尿液中提取得到人表皮生长因子。90年代采用生物工程技术基因重组，即通过选择生产菌株，进行工程菌发酵，再经纯化、冻干后制得重组人表皮生长因子。重组表皮生长因子可以促进细胞有丝***以及糖、蛋白质、DNA、RNA合成，具有促进上皮细胞***增殖的作用，在临床应用上与免疫性皮肤病、创面组织修复和手术血管愈合的治疗密切相关。临床上应用精制的重组人表皮生长因子，可以促进创面愈合，配合常规烧伤创面处理，对烧伤浅II度、深II度(尤其是后者)慢性创面、供皮区等均具有不同程度的加速愈合的作用，可缩短患者住院时间。目前，有文献报道，将重组人表皮生长因子做成水凝胶、水溶液、普通乳剂等剂型，但是由于重组人表皮生长因子分子量较大，这些剂型中的重组人表皮生长因子稳定性差，并且分散基质无明显的吸收促进作用，造成制剂透皮效果不佳，有效成分的吸收利用度很低，特别是手术血管接合有较大难度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，本发明将表皮生长因子接枝在O-羧甲基壳聚糖纳米纤维上，得到的纳米纤维能够更好地促进角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：

S1：将一定量O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90v/v％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

S2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

S3：将所述O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化，得活化纳米纤维；

S4：将步骤S3得到的活化纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子和CoCl₂的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干后得到表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。

优选的，所述O-羧甲基壳聚糖粘均分子量为5.0×10⁵，脱乙酰度为80～85％，所述聚氧化乙烯的平均分子量为1.0×10⁶。

优选的，步骤S1中，O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度为10～30g/L，O-羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为1:1～4。

优选的，步骤S2中，所述静电纺丝工艺中，注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针，电压12～20KV，距离7～10cm，进样速率0.3～1.0ml/h，温度25～35℃。

优选的，步骤S3中，所述烘干的温度为37～45℃，烘干时间为2～4h。

优选的，步骤S3中，等离子体处理器处理的条件为：气体采用氮气或氧气，处理功率为250～300W，压强50～60Pa，处理时间为10～15min。

优选的，步骤S4中，所述含有重组表皮生长因子和CoCl₂的DMEM培养基中重组表皮生长因子的浓度为40～80mg/L，CoCl₂的浓度为0.15～0.30g/L。

优选的，步骤S4中，接枝反应的浸泡浴比为1:100～300，浸泡温度为0～4℃，浸泡时间为12～24h。

优选的，步骤S4中，所述负压闪爆的真空度为0.100～0.024mBar，所述冻干的温度为-30～-20℃，真空度为0.100～0.024mBar，冻干时间为3～5d。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1)采用O-羧甲基壳聚糖，该高分子化合物具有游离的羧基和氨基，水溶性和生物相容性比壳聚糖更佳。其丰富的羧基和氨基能够为蛋白分子的锚定提供多锚定位点，增强结合强度。

2)采用O-羧甲基壳聚糖螯合Co²⁺离子，在细胞修复处产生化学低氧环境，诱导细胞内低氧诱导因子HIF的表达升高，通过转录因子调控诱导上皮及表皮生长。

附图说明

图1是本发明实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的生长情况；

图2是本发明实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的细胞增殖率。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。

本发明采用的技术方案如下：

一种表面接枝重组表皮生长因子新型纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：

S1：将一定量O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于90v/v％乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

S2：采用纺丝液进行静电纺丝，得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

S3：将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化；

S4：将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有重组表皮生长因子EGF的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应；

S5：将完成接枝反应的纳米纤维离心冻干。

步骤S1中，所用O-羧甲基壳聚糖的规格为粘均分子量5.0×10⁵，脱乙酰度优选为80～85％，更优选为80％。所用聚氧化乙烯的规格为平均分子量1.0×10⁶。O-羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯的总浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L，O-羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比优选为1:1～4，更优选为1:3。

步骤S2中，静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压优选为12～20KV，更优选为15KV，距离优选为7～10cm，更优选为8cm，进样速率优选为0.3～1.0ml/h，更优选为0.5ml/h，温度优选为25～35℃，更优选为30℃。

步骤S3中，洗涤终点pH为7，烘干的温度优选为37～45℃，更优选为37℃，烘干时间优选为2～4h，更优选为4h。等离子体处理的条件为：气体优选采用氮气或氧气，更优选为氧气，处理功率优选为250～300W，更优选为280W，压强优选为50～60Pa，更优选为55Pa，处理时间优选为10～15min，更优选为15min。

步骤S4中，所述的表皮生长因子EGF的浓度优选为40～80mg/L，更优选为80mg/L，CoCl₂的浓度优选为0.15～0.30g/L，更优选为0.20g/L。接枝反应的浸泡浴比优选为1:100～300，更优选为1:200，浸泡温度优选为0～4℃，更优选为4℃，浸泡时间优选为12～24h，更优选为24h。负压闪爆的真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar。

步骤S5中，冻干的温度优选为-30～-20℃，更优选为-30℃，真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar，冻干时间优选为3～5d，更优选为4d。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种表面接枝重组表皮生长因子新型纳米纤维的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1：

1、将0.5gO-羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×10⁵，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化乙烯(平均分子量1.0×10⁶)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

3、将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；

4、将得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LEGF和0.20g/L CoCl₂的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；

5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。

实施例2：

1、将0.5gO-羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×10⁵，脱乙酰度为85％)和0.5g聚氧化乙烯(平均分子量1.0×10⁶)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压12KV，距离7cm，进样速率0.3ml/h，温度25℃得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

3、将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，45℃烘2h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氮气，处理功率为250W，压强50Pa，处理时间为10min；

4、将得到的纳米纤维浸泡在含有40mg/LEGF和0.15g/L CoCl₂的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.100mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:100，浸泡温度为0℃，浸泡时间为12h；

5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-20℃，真空度为0.100mBar，冻干时间为3d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。

实施例3：

1、将0.6gO-羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×10⁵，脱乙酰度为80％)和2.4g聚氧化乙烯(平均分子量1.0×10⁶)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压20KV，距离10cm，进样速率1.0ml/h，温度35℃得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

3、将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为300W，压强60Pa，处理时间为15min；

4、将得到的纳米纤维浸泡在含有40mg/LEGF和0.30g/L CoCl₂的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:300，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；

5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为5d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子纳米纤维。

对比例1：

1、将0.5gO-羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×10⁵，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化乙烯(平均分子量1.0×10⁶)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

3、将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；

4、将得到的纳米纤维浸泡在DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；

5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体处理的纳米纤维。

对比例2：

1、将0.5gO-羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×10⁵，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化乙烯(平均分子量1.0×10⁶)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

3、将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7.2，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；

4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LEGF的DMEM培养基中，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；

5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面接枝重组表皮生长因子的纳米纤维。

对比例3：

1、将0.5gO-羧甲基壳聚糖(粘均分子量5.0×10⁵，脱乙酰度为80％)和1.5g聚氧化乙烯(平均分子量1.0×10⁶)完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；

2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；

3、将O-羧甲基壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7.2，37℃烘4h；

4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LEGF的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；

5、将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种表面接枝重组表皮生长因子的纳米纤维。

将本发明实施例与对比例的纳米纤维贴于24孔培养板孔底，每孔加入1ml DMEM培养基，按4×10³个/孔接种量接入大鼠肺上皮细胞，37℃，5％CO₂浓度培养24h，显微镜下观察细胞生长并计数。不同实施例和对比例的细胞生长情况观察结果如图1所示。图1是本发明实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的生长情况，图中，A为实施例1处理结果，B为实施例2处理结果，C为实施例3处理结果，D为对比例1处理结果，E为对比例2处理结果，F为对比例3处理结果。不同实施例和对比例的细胞生长增值情况如图2所示。图2是本发明实施例及对比例处理的大鼠肺上皮细胞培养24h的细胞增殖率。图中，A为实施例1处理结果，B为实施例2处理结果，C为实施例3处理结果，D为对比例1处理结果，E为对比例2处理结果，F为对比例3处理结果。图1和图2表明本发明实施例方法与对比例相比能够显著促进大鼠肺上皮细胞的生长与增殖。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。