阅读说明：本技术 单炔类化合物及其制备方法和用途 (Monoacetylene compound and preparation method and application thereof ) 是由 武海波 石莎 于 2019-01-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及单炔类化合物及其制备方法和用于农药,尤其防治根结线虫、土传病原真菌的用途。所述化合物具有式(1)所示结构：<Image he="249" wi="700" file="DDA0001956478990000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明的化合物对植物土传病原体(根结线虫及土传病原菌)具有较好综合防治效果,通过减少现有化学农药杀线剂和杀菌剂分别使用的次数和用量,有助于我国保护地的绿色发展和高附加值作物的可持续性栽培。(the compound of the invention has better comprehensive control effect on plant soil-borne pathogens (root-knot nematodes and soil-borne pathogenic fungi), and is beneficial to green development of protected areas in China and sustainable cultivation of crops with high added value by reducing the times and the dosage of the prior chemical pesticide nematocide and bactericide respectively.)

单炔类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及单炔类化合物及其制备方法和用于农药，尤其防治根结线虫、土传病原真菌的用途。

背景技术

近20年来，保护地的发展和高附加值作物的栽培，大幅度增加了农民的收入，实现了由传统农业向现代农业的转变。随着保护地的发展和高附加值作物的连年栽培，造成土壤中植物病原体和虫卵积累，毁灭性土传病害如根结线虫病及枯萎病、根腐病、黄萎病、青枯病等连年发生，逐年加重，通常栽种3-5年后，作物产量和品质受到严重影响，一般造成减产20％-40％，严重的减产60％以上，甚至绝收。因此，根结线虫病及土传真菌病已成为严重危害设施蔬菜生产、影响农民增收、制约我国蔬菜和其他重要经济作物可持续发展的突出问题。目前，对土传病害的防治主要依赖长期大量使用各种化学合成农药，此类农药一般具有较高毒性、残留期长，易污染环境和地下水源，这不仅造成害物抗性进化，对人类健康和环境也具有一定负面影响。发明人在山东调研发现，由于无有效防治方法，当地农民盛行偷用国家禁用药剂(如甲拌磷、克百威等)防治根结线虫及土传病害。因此，研究开发高效、低毒、低残留的新型农药尤为迫切。

植物是生物活性物质的天然宝库，不仅为人类对抗疾病提供有力武器，而且为我国植物源农药发展提供绿色低毒物质。苦艾(Artemisia absinthium L.)为菊科(Compositae)蒿属植物(Artemisia)。《新疆中草药》记载其具有清热燥湿，杀虫止痒之功效，常用于关节肿痛，湿疹瘙痒，疖肿疮毒，蛔虫病，食欲不振。另外，苦艾还是制作苦艾酒的主要原材料。

根据现有文献的报道，苦艾叶子的提取物的成分是非常复杂的，而且由于提取方法的不同而往往导致提取到不同的活性成分。

硕士论文“维药苦艾化学成分及其生活活性的初步研究”(新疆大学硕士论文，阿娜姑·托合提，2012年)公开了对苦艾挥发油进行提取的方法：1)首先采用水蒸气蒸馏法和有机溶剂萃取法对苦艾挥发油进行提取，通过单因素和正交实验法进行了提取工艺优化，且利用GC-MS法对所制备样品进行了化学成分分析；用水蒸气蒸馏法提取的挥发油中含量较多的成分为反式-乙酸菊烯酯、棕榈酸、-姜黄烯、石竹素和薄荷脑等；以有机溶剂提取的挥发油中含量较多的成分为邻苯二甲酸二丁酯、十八碳-9,12,15-三烯酸、正四十四烷、抗坏血酸二棕榈酸酯、正-二十九烷、反式-乙酸菊烯酯和1,3-甘油二油酸酯等；2、采用乙醇回流提取法对苦艾黄酮类化合物的提取工艺进行了初步探讨；单因素和正交实验结果表明，苦艾黄酮类化合物的最佳提取工艺：乙醇浓度80％、提取时间5h、提取温度80℃、料液比1:25g/mL，此条件下测定的总黄酮含量为0.5625％；3、采用常用的提取方法和柱层析分离技术对苦艾的化学成分进行提取与分离，得到了6个化合物，并利用IR、1H NMR、13C NMR、ESI-MS等波谱技术确定了所分离化学成分的结构。这些化合物分别为苦艾木脂素、槲皮素、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷和β-谷甾醇；4、通过羟基自由基清除能力测定法、DPPH清除能力测定法和还原能力测定法以维生素C为标准品，对苦艾黄酮和苦艾挥发油粗提取物进行了体外抗氧化活性客观评价；结果表明，羟基自由基清除能力测定法中，抗氧化活性为：总黄酮>维生素C>粗挥发油2>粗挥发油1；在DPPH清除能力测定法中各样品的抗氧化活性较弱；在还原能力测定法中，抗氧化能力大小顺序为：维生素C>总黄酮>粗挥发油1>粗挥发油2。苦艾的体外抗氧化测定结果说明，苦艾中黄酮类化合物和挥发油都具有一定的抗氧化作用。

另外，论文“苦艾挥发油的提取工艺及其化学成分分析”(阿娜姑·托合提、阿布拉江·克依木；新疆大学化学化工学院，2012年)公开道：从苦艾挥发油化学成分的GC-MS分析可知，用水蒸汽蒸馏法所得到挥发油主要是由反烯乙酸菊烯酯、石竹素、棕榈酸、α-姜黄烯、薄荷脑和2,4,6-三甲基-双环[4.1.0]-3-庚烯基甲醛等组成，而用石油醚提取法所得到的挥发油主要含有反烯乙酸菊烯酯、棕榈酸、十八碳-9,12,15-三烯酸、正四十四烷、正三十六烷等成分。

论文“苦艾提取物抗菌作用的实验研究”(中华中医药学会2013年药房管理分会学术年会论文汇编，李茜、李娟、吴燕春；新疆医科大学附属中医医院药学部，广西中医学院)公开道：苦艾(叶子)分别用水煎、70乙醇提取，在90℃水浴锅里回流浸提2小时，获得提取物。该提取物对于某些细菌(即大肠杆菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌)具有抑制作用。试验证实苦艾水提取物及醇提取物在体外均有抑制细菌的作用。

目前对于苦艾的叶子提取物的活性成分和活性进行较多的研究，而且对于苦艾的认识仅仅是其医用及医用卫生活性，未见到针对苦艾的根的提取物进行研究的报道，更未见本专利涉及单炔类化合物对南方根结线虫及土传病原真菌的防治方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有技术中的问题，提供单炔类化合物及其制备方法和用于防治根结线虫、土传病原真菌的用途。

本申请的发明人发现，从苦艾的根获得的提取物因为提取方法的不同而含有不同的成分。本申请的发明人通过深入研究发现了通过采用本发明的提取方法能够提取到两种特定的单炔类新化合物，这两种化合物对于特定的南方根结线虫及土传病原真菌具有良好的防治效果。

根据本发明的第一个方面，提供一种单炔类化合物，具有式(1)所示结构：

其中，R分别选自-C(＝O)CH₃和-C(＝O)CH₂CH(CH₃)₂。

本发明的单炔类化合物包括以下化合物1和化合物2的一种或两种：

其中，R选自-C(＝O)CH₃，为化合物1；

其中，R选自-C(＝O)CH₂CH(CH₃)₂，为化合物2。

发明人在研究中发现，式(1)所示结构的化合物具有较好的脂溶性、通透性和渗透性等优点。

根据本发明的第二个方面，提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)超临界CO₂萃取苦艾根，获得苦艾根的超临界CO₂萃取物；

2)将萃取物分散水中，依次用石油醚、二氯甲烷、丙酮萃取，得到石油醚浸膏、二氯甲烷浸膏、丙酮浸膏和水相浸膏；

3)取2)中二氯甲烷浸膏，采用硅胶柱色谱依次以石油醚-丙酮体积比15:1、10:1、8:1、5:1、3:1、1:1为洗脱剂进行梯度洗脱，得到6个馏分，依次为F1-F6；

4)取3)中F2部分，采用硅胶柱色谱，以正己烷-氯仿体积比5:1为洗脱剂洗脱，薄层色谱检测，显色，合并相同Rf值的洗脱部分，其中Rf＝0.61合并为F2-1部分、Rf＝0.48合并为F2-2、Rf＝0.26合并为F2-3；

5)取4)中F2-2部分，经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析，以1:1氯仿-甲醇洗脱，得到化合物经过薄层检测、显色，根据Rf值确定为化合物1(Rf＝0.46)和化合物2(Rf＝0.39)。

本发明进行薄层色谱显色条件：紫外灯(254nm)下观察暗斑，喷洒10％硫酸乙醇后，105℃烘烤至显色。

步骤1)中，浸提所用溶剂优选是乙醇。

进一步地，步骤1)包括将苦艾根粉碎至10-100目(例如20目)，加入萃取釜中，萃取压力20-40MPa，优选约30MPa，萃取温度30-60℃，优选约40℃，超临界CO₂流量10-40L、L，优选约20L/h，萃取时间30-180min，例如60min，得到超临界CO₂萃取物。

根据本发明的第三个方面，本发明还提供一种农药制剂，其包括(A)上述单炔类化合物或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物以及(B)农药学上可接受的辅料。本发明的药物制剂中，组分(A)的质量百分数为10～25％，组分(B)的质量百分数为75～90％。

本发明的单炔类化合物包括其任何其晶型或其立体异构体。

在具体应用过程中，可以将本发明的所述的单炔类化合物与无机酸或有机酸形成生理上可接受的盐，使化合物结构更加稳定，有利于保存和制备杀线及杀菌制品，发挥杀线虫、抑制植物病原真菌生长活性。

上述单炔类化合物或其盐类化合物用做农用杀线剂、杀菌剂时，可以直接使用，或者以农药组合物的形式使用。

本发明所述农药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质，例如在可湿性粉剂的情况下，其可以选自十二烷基硫酸钠、CMC十二烷基硫酸钠、高岭土、凹凸棒粘土、分散剂等中的一种或多种。

在一个具体实施方案中，作为可湿性粉剂，其包括：本发明的化合物的粉末15-25wt％，白炭黑15-25wt％，十二烷基硫酸钠2-8wt％，CMC十二烷基硫酸钠0.5-2wt％和拉开粉1-6wt％，凹凸棒土46-56wt％。

本发明的化合物还可以根据常规方法制成其他任何适当的农药剂型，包括但不限于溶液、悬浮液、乳液等中的任何一种。

根据本发明的第四个方面，本发明提供了上述式(1)所示的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其农药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备农药中的应用，尤其用于防治根结线虫、土传病原真菌的用途。

此类单炔化合物可以在制备杀线剂中进行应用。发明人研究表明上述化合物对南方根结线虫具有较强杀虫作用，发现其杀线能力优于现有市售药剂阿维菌素，说明此类化合物作为植物源农药在杀线虫方向具有较好的应用前景，可以进一步制备成杀线剂用于根结线虫的防治。

此类单炔类化合物可以在制备杀菌剂中进行应用。发明人研究表明此类单炔化合物对多种植物土传病原真菌，尤其是疫霉属病原真菌具有明显的抑菌活性，发现其抑菌能力强于现有市售化学药剂多菌灵，说明此类化合物具有广泛的抑菌谱和明显的抑菌活性，作为植物源农药在抑制植物病原真菌方向具有较好的应用前景，可以进一步制备成杀菌剂用于植物病原真菌的防治。

在应用的过程中，可以根据实际的使用要求，将此类单炔化合物制备成合适的剂型或添加一种或几种本领域常规的辅料以制成药物组合物进行应用。

试验结果表明，本发明化合物具有较好的杀线虫和抑制植物土传病原真菌作用，为农业上筛选和/或制备杀线剂、杀菌剂药物提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，修改、替换或变更后的方案也在本发明保护范围内。

发明的优点和效果的说明

本发明的有益效果：本发明提供的式(1)所示的化合物可由《新疆中草药》收录的药用植物，同时也是酿造苦艾酒的主要原材料植物苦艾的干燥根部提取分离而获得，证明其对人体比较安全；式(1)所示的化合物来源于天然植物，在环境中易于降解，具有低毒低残留特性，对非靶标生物安全、环境相容性好，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要；式(1)所示的化合物对南方根结线虫二龄幼虫具有强杀灭活性，杀线能力优于商业用杀线剂阿维菌素，具有优秀杀线活性的单炔类化合物可以作为主要的新农药成分或先导化合物适用于控制农业植物寄生线虫；式(1)所示的化合物对多种植物土传病原真菌具有较强抑菌活性，其抑菌能力强于市售杀菌剂多菌灵，可以作为主要新农药成分或先导化合物用于控制植物病原真菌；式(1)所示的化合物对植物土传病原体(根结线虫及土传病原菌)具有较好综合防治效果，通过减少现有化学农药杀线剂和杀菌剂分别使用的次数和用量，有助于我国保护地的绿色发展和高附加值作物的可持续性栽培。

附图说明

图1为实施例1中制备的化合物1的HRESIMS图。

图2为实施例1中制备的化合物1的¹H NMR谱图。

图3为实施例1中制备的化合物1的¹³C NMR谱图。

图4为实施例1中制备的化合物1的HMBC谱图。

图5为实施例1中制备的化合物2的HRESIMS图。

图6为实施例1中制备的化合物2的¹H NMR谱图。

图7为实施例1中制备的化合物2的¹³C NMR谱图。

图8为实施例1中制备的化合物2的HMBC谱图。

具体实施方式

实施例1：单炔类化合物的制备

1、实验材料：

1)药材

苦艾的根部于2016年8月采自新疆省，经本申请发明人武海波博士鉴定为菊科蒿属植物苦艾的干燥根。

2)试剂和填料

薄层层析硅胶GF254(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；GF254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，购于瑞典Amersham公司；石油醚、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于北京化工厂。

3)实验仪器

Bruker-AVIIIHD-600核磁共振仪(瑞士Bruker)；BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；Nicolet 5700红外光谱仪(美国Thermo公司)；DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)；R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)。

2、成分的分离纯化：

1)将苦艾根500g粉碎至20目，加入萃取釜中，萃取压力30MPa，萃取温度40℃，超临界CO₂流量20L/h，萃取时间60min，得到超临界CO₂萃取物；

2)将超临界CO₂萃取物分散水中，依次用石油醚、二氯甲烷、丙酮萃取，得到石油醚浸膏、二氯甲烷浸膏、丙酮浸膏和水相浸膏；

3)取步骤2)中所得二氯甲烷浸膏，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚-丙酮体积比15:1、10:1、8:1、5:1、3:1、1:1为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，合并相同洗脱部分，得到6个馏分，依次为F1-F6；其中，F1为石油醚-丙酮体积比15:1馏分，F2为石油醚-丙酮体积比10:1馏分；F3为石油醚-丙酮体积比8:1馏分；F4为石油醚-丙酮体积比5:1馏分；F5为石油醚-丙酮体积比3:1馏分；F6为石油醚-丙酮体积比1:1馏分，共6个馏分。

4)取步骤3)中F2部分，采用硅胶柱色谱，以正己烷-氯仿体积比5:1为洗脱剂洗脱，薄层色谱检测，显色，合并相同Rf值的洗脱部分，其中Rf＝0.61合并为F2-1部分、Rf＝0.48合并为F2-2、Rf＝0.26合并为F2-3；

5)取步骤4)中F2-2部分，经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)，以1:1氯仿-甲醇洗脱，得到化合物经过薄层检测、显色，根据Rf值确定为化合物1(Rf＝0.46)11.5mg和化合物2(Rf＝0.39)3.6mg；

6)本发明进行薄层色谱显色条件：紫外灯(254nm)下观察暗斑，喷洒10％硫酸乙醇后，105℃烘烤至显色。

3、化合物鉴定：

在分离得到各化合物后，对其理化性质和分子结构进行了鉴定，得到化合物1和化合物2为新化合物，化合物1-2的分子结构如式(2)所示，其具体理化性质和波谱数据如下表1：

表1化合物1和2的核磁数据

化合物1：黄色油状物；HRESIMS m/z,299.0176[M+Na]+,calcd for C₁₄H₁₂NaO₂S₂,299.0175；化合物1的HRESIMS图、¹H NMR图和¹³C NMR图分别如图1至图3所示。

化合物2：黄色油状物；HRESIMS m/z,341.0640[M+Na]+,calcd for C₁₇H₁₈NaO₂S₂,341.0646；化合物2的HRESIMS图、¹H NMR图和¹³C NMR图分别如图5至图7所示。

实施例2：农药制剂的制备

实施例1所得化合物1的粉末20％，白炭黑20％，十二烷基硫酸钠5％，CMC十二烷基硫酸钠1％和拉开粉3％，凹凸棒土余量，所述％以农药制剂的总重量为基准。将上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机中，粉碎到150目以上，水分控制在6-8％(质量百分含量)，pH控制在7-7.5。即可制得20％式(1)所示化合物的可湿性粉剂。经制剂的水中分散性、稀释液稳定性、冷热贮稳定性符合商品农药制剂的要求。

实施例3：农药制剂的制备

实施例1所得化合物2的粉末20％，白炭黑20％，十二烷基硫酸钠5％，CMC十二烷基硫酸钠1％和拉开粉3％，凹凸棒土余量。将上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机中，粉碎到150目以上，水分控制在6-8％(质量百分含量)，pH控制在7-7.5。即可制得20％式(1)所示化合物的可湿性粉剂。经制剂的水中分散性、稀释液稳定性、冷热贮稳定性符合商品农药制剂的要求。

试验1：对南方根结线虫二龄幼虫的毒力测定

1)样品的配置：

待测化合物及商用杀线剂阿维菌素用丙酮溶解制备成浓度为10⁴mg/L的母液。用0.1％(V/V)吐温-80水溶液稀释待测化合物，保证最终待测化合物中有机溶剂含量不超过1％(V/V)。

2)南方根结线虫二龄幼虫的准备：

采集被南方根结线虫(M.incognita)侵染的黄瓜根，用灭菌的蒸馏水轻洗番茄根，于体视显微镜下，用镊子轻轻剥离卵块，置于含有少量蒸馏水的培养皿内，28℃培养箱孵化3-5天。孵化出的2龄根结线虫线虫可用作生物测定的目标生物。

3)生物活性测定：

取96孔生化测试板，取100μL的线虫悬浮液，保证每孔二龄线虫数80-100头，记录放入活虫数，各取供试药液100μL沿培养板边慢慢加入，以免对试虫造成不利影响，盖板以防水分蒸发。96孔板置于28℃培养箱，避光。每个处理重复4次。处理24小时后检查南方根结线虫二龄幼虫的存活数量和死亡数量，计算死亡率和校正死亡率。并用SAS软件计算出药剂的LC₅₀。死亡率和校正死亡率按如下公式计算：

4)生测结果：

表2两个单炔类化合物对南方根结线虫的杀线毒力(LC₅₀，mg/L)

阿维菌素作为阳性对照对根结线虫的LC₅₀为9.47mg/L，新化合物1和2的LC₅₀分别为2.69和4.17mg/L。从以上实验数据可以看出，本发明获得的单炔类化合物具有优异的杀线活性。

试验2：对植物土传病菌真菌抑菌活性测定

1)样品的配置：

化合物1、2及多菌灵以DMSO配置，母液浓度为51200mg/L

2)菌液的准备：

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、致病疫霉(Phytophthora infestans)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)以PDA培养基在28℃培养7天后，以无菌水冲洗得到孢子悬液，在显微镜下观察，稀释至1×10⁶CFU/mL，备用。

3)生物活性测定(MIC法)：

采用微量稀释法，用96孔微孔稀释板进行。每排12孔，每排的1～10孔各加入10μL药液用90μL带菌马铃薯葡萄糖培养液稀释成一系列药液，第11孔加入100μL带菌马铃薯葡萄糖培养液作为空白对照，第12孔加入10μL DMSO和90μL带菌马铃薯葡萄糖培养液液作为溶剂对照。使第1～10孔中的药液浓度倍比递减。操作完成，振荡混合后，在28℃培养48小时，取出，观察结果。无菌生长孔中所含药液最低的药物浓度极为该样品的MIC。

4)生测结果：

表3两个单炔类化合物对四种植物土传病原真菌的MIC(mg/L)

抑制植物土传真菌活性实验结果证实，化合物1和化合物2对致病疫霉和辣椒疫霉的抑菌活性明显优于现有市售杀菌剂多菌灵。

由于本发明分离获得的式(1)化合物是从药食两用植物苦艾中提取，在自然条件下易分解，不会引起生物富集现象，对人畜安全，可以作为天然农药长期使用。根结线虫和疫霉菌属通常共同侵染同一作物，如黄瓜、辣椒等，使用本发明获得的式(1)化合物，不仅能够达到化学农药减量减施，而且能够避免化学农药施用带来的负面影响，有益于我国可持续农业发展。