一种人***瘤病毒68型l1蛋白的突变体

文档序号：1690658 发布日期：2019-12-10 浏览：12次 >En<

阅读说明：本技术 一种人***瘤病毒68型l1蛋白的突变体 (Mutant of human papilloma virus 68 type L1 protein ) 是由顾颖杨与柔王大宁王颖彬李少伟夏宁邵于 2019-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种突变的HPV68L1蛋白(或其变体),其编码序列和制备方法,以及包含其的病毒样颗粒,所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如,HPV68和HPV39)的中和抗体,从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途,所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。(The present invention relates to a mutated HPV68L1 protein (or a variant thereof), a coding sequence and a preparation method thereof, and virus-like particles comprising the same, which are capable of inducing neutralizing antibodies against at least two types of HPV (e.g., HPV68 and HPV39), and thus can be used for preventing infection of the at least two types of HPV and diseases caused by the infection, such as cervical cancer and condyloma acuminatum. The invention also relates to the use of the above proteins and virus-like particles for the preparation of a pharmaceutical composition or vaccine useful for the prevention of HPV infections of said at least two types and diseases caused by said infections, such as cervical cancer and condyloma acuminata.)

一种人***瘤病毒68型L1蛋白的突变体

本申请是以CN申请号为201810566210.5，申请日为2018年6月4日的申请为基础，并主张其优先权，该CN申请的公开内容在此作为整体引入本申请中。

技术领域

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种突变的HPV68 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV39和HPV68)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如***和***。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如***和***。

背景技术

人***瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤和粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性***在内的生殖器癌症的主要原因；低危型则主要引起***。预防与控制HPV感染的最有效方式是接种HPV疫苗，特别是针对能引起***的高危型HPV的疫苗。

HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体构成的20面体立体对称结构(Doorbar,J.and P.H.Gallimore.1987.J Virol,61(9):2793-9)。HPV VLP的结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A 89(24):12180-4)。

然而，现有的研究显示，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在低的交叉保护作用(SaraL.Bissett,Giada Mattiuzzo,et al.2014 Vaccine.32:6548-6555)。因此，现有的HPV疫苗的保护范围非常有限。通常，一个型别的HPV VLP只能用于预防该型别的HPV感染。在这种情况下，如果要扩大HPV疫苗的保护范围，那就只能在疫苗中增加更多型别的HPV VLP。目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的(其为针对HPV16，18，6和11的四价疫苗)，GSK公司的(其为针对HPV16，18的二价疫苗)和Merck公司的9(其为九价疫苗)，均是通过混合多个型别的HPV VLP而制成。然而，这种方案将导致HPV疫苗的生产成本大大提高，并且可能因为免疫剂量的增加而导致潜在的安全性问题。

因此，本领域需要开发能够诱导针对多个型别的HPV的保护性中和抗体的HPV病毒样颗粒，以更经济、有效地预防多个型别的HPV感染和由此导致的疾病例如***和***。

发明内容

本发明至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：将人***瘤病毒(HPV)68型L1蛋白中的特定区段置换为第二型别的HPV(例如HPV39)L1蛋白的相应区段后，所获得的突变的HPV68 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV68和第二型别的HPV(例如HPV39)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV68 VLP和第二型别的HPV VLP相当，并且针对HPV68的保护效果与单独的HPV68 VLP相当，且针对第二型别的HPV(例如HPV39)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当。

因此，在一个方面，本发明提供了一种突变的HPV68 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV68L1蛋白与野生型HPV68 L1蛋白相比，具有下述突变：

(a)位于野生型HPV68 L1蛋白第53-61位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或

(b)位于野生型HPV68 L1蛋白第348-359位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；

并且，所述变体与所述突变的HPV68 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV68 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV68和HPV39)的中和抗体。

在某些优选的实施方案中，所述第二型别的野生型HPV为HPV39。在某些优选的实施方案中，(a)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV39 L1蛋白第53-61位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(b)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV39 L1蛋白第347-358位的氨基酸残基。

在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV68 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV39 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2或15所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV39L1蛋白第53-61位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:13示。

在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV39 L1蛋白第347-358位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:14示。

在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV68 L1蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:3和7。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的突变的HPV68L1蛋白或其变体。在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含所述分离的核酸。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:8和12。

可用于***目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。

在另一个方面，本发明涉及一种HPV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的突变的HPV68 L1蛋白或其变体，或者由本发明的突变的HPV68 L1蛋白或其变体组成或形成。

在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV68L1蛋白，其与野生型HPV68 L1蛋白相比，位于野生型HPV68 L1蛋白第53-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV39 L1蛋白第53-61位的氨基酸残基。

在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV68 L1蛋白，其与野生型HPV68 L1蛋白相比，位于野生型HPV68 L1蛋白第348-359位的氨基酸残基被替换为野生型HPV39 L1蛋白第347-358位的氨基酸残基。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV68 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:3或7示的序列。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述突变的HPV68 L1蛋白或其变体，或上述分离的核酸或载体或宿主细胞或HPV病毒样颗粒的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的突变的HPV68 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV病毒样颗粒。

在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病例如***和***。

在某些优选的实施方案中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV68感染和/或HPV39感染)。在某些优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病选自***和***。

本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。

在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HPV病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。

在另一个方面，本发明涉及一种制备如上所述的突变的HPV68L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV68 L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV68 L1蛋白或其变体。

在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在某些优选的实施方案中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV68 L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV68 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV68 L1蛋白或其变体。

在另一个方面，本发明涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。

在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV68感染和/或HPV39感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，***和***。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，本发明还涉及本发明的突变的HPV68 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV68感染和/或HPV39感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，***和***。

在另一个方面，本发明还涉及本发明的突变的HPV68 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒，其用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV68感染和/或HPV39感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，***和***。

本发明中相关术语的说明及解释

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

根据本发明，术语“第二型别的野生型HPV”是指，不同于HPV68的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第二型别的野生型HPV优选为野生型HPV39。

根据本发明，表述“相应位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中的等同位置。

根据本发明，术语“野生型HPV68 L1蛋白”是指，天然存在于人***瘤病毒68型(HPV68)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV68L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号AAZ39498.1，AGU90717.1，P54669.1和AGU90703.1)。

在本发明中，当提及野生型HPV68 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV68 L1蛋白的第53-61位氨基酸残基”是指，SEQID NO：1所示的多肽的第53-61位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV68可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV68的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV68 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:1所示的蛋白，而且应包括各种HPV68分离株的L1蛋白(例如NCBI数据库登录号AAZ39498.1，AGU90717.1，P54669.1或AGU90703.1)。并且，当描述野生型HPV68 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括各种HPV68分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV68 L1蛋白的第53-61位氨基酸残基”包括，SEQID NO：1的第53-61位氨基酸残基，以及各种HPV68分离株的L1蛋白中的相应片段。

根据本发明，术语“野生型HPV39 L1蛋白”是指，天然存在于人***瘤病毒39型(HPV39)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV39L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号P24838.1、ARQ82617.1、AGU90549.1和AEP23084.1)。

在本发明中，当提及野生型HPV39 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV39 L1蛋白的第53-61位氨基酸残基”是指，SEQID NO：2所示的多肽的第53-61位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV39可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV39的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV39 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:2所示的蛋白，而且应包括各种HPV39分离株的L1蛋白(例如NCBI数据库登录号P24838.1、ARQ82617.1、AGU90549.1和AEP23084.1)。并且，当描述野生型HPV39 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括各种HPV39分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV39 L1蛋白的第53-61位氨基酸残基”包括，SEQID NO：2的第53-61位氨基酸残基，以及各种HPV39分离株的L1蛋白中的相应片段。

根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸”是指，用起始密码子(用于起始蛋白质翻译)编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1－X位氨基酸残基。例如，N端截短了15个氨基酸的HPV39 L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV39 L1蛋白N末端的第1-15位氨基酸残基所获得的蛋白质。

根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的突变的HPV68L1蛋白(如SEQ ID NO：3或7所示的蛋白)的氨基酸序列相比，具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，或者具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述突变的HPV68 L1蛋白的功能。在本发明中，术语“突变的HPV68 L1蛋白的功能”是指：能够诱导机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV68和HPV39)的中和抗体。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法(例如BLAST)来计算。

根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。

根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。

根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。

根据本发明，术语“裂解上清”是指通过下述步骤所产生的溶液：将宿主细胞(例如大肠杆菌)在裂解液中破碎，然后将含有经破碎的宿主细胞的裂解液中的不溶物去除。各种裂解液是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。此外，可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现宿主细胞的破碎，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。去除裂解液中的不溶物的方法也是本领域技术人员公知的，包括但不限于过滤和离心。

发明的有益效果

研究表明，虽然HPV68和其他型别的HPV(例如HPV39)之间存在一定的交叉保护，但是这种交叉保护的能力很低，通常低于自身型别的VLP的保护水平的百分之一，甚至低于千分之一。因此，对于接种了HPV68疫苗的受试者来说，其感染其他型别的HPV(例如HPV39)的风险依然很高。

本发明提供了一种突变的HPV68 L1蛋白以及由其形成的HPV病毒样颗粒。本发明的HPV病毒样颗粒能够在HPV68和其他型别的HPV(例如HPV39)之间提供显著的交叉保护能力。特别地，在同等免疫剂量下，本发明的HPV病毒样颗粒能够诱发机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HP68和HPV39)的高滴度中和抗体，并且其效果与多个型别的HPV VLP的混合物(例如，HPV68VLP和HPV39VLP的混合物)相当。因此，本发明的HPV病毒样颗粒能够用于同时预防至少两个型别的HPV(例如，HPV68和HPV39)的感染以及与此相关的疾病，具有显著的有利技术效果。这在扩大HPV疫苗的保护范围和降低HPV疫苗的生产成本等方面具有特别显著的优势。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了实施例1中经纯化的突变蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道1：蛋白分子量标记；泳道2:HPV68N0(全长的HPV68 L1蛋白)；泳道3:HPV39N15(N端截短了15个氨基酸的HPV39 L1蛋白)；泳道4:H68N0-39T1；泳道5:H68N0-39T2；泳道6:H68N0-39T3；泳道7:H68N0-39T4；泳道8:H68N0-39T5；结果显示，经过色谱纯化后，蛋白H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4、H68N0-39T5的纯度达到90％以上。

图2显示了用广谱抗体4B3检测实施例1中制备的H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5的蛋白质免疫印迹检测的结果。泳道1:HPV68N0；泳道2:HPV39N15；泳道3:H68N0-39T1；泳道4:H68N0-39T2；泳道5:H68N0-39T3；泳道6:H68N0-39T4；泳道7:H68N0-39T5。结果显示，突变蛋白H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5能够被广谱抗体4B3特异性识别。

图3显示了包含蛋白H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4、H68N0-39T5和HPV68N0的样品的分子筛层析分析的结果。结果显示，包含H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5的样品最先出现的蛋白峰均在13-14min左右，与HPV68N0 VLP相当。这表明，上述突变蛋白组装均可组装成VLP。

图4显示了H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T2 VLP、H68N0-39T3VLP、H68N0-39T4 VLP、H68N0-39T5 VLP和HPV68N0 VLP的沉降速率分析的结果。结果显示，H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T2VLP、H68N0-39T3 VLP、H68N0-39T4 VLP和H68N0-39T5 VLP的沉降系数分别为138S、148S、147S、155S和147S。这表明，如上制备的5种突变的HPV68 L1蛋白各自能够组装成大小、形态与野生型VLP(HPV68N0 VLP，153S)相似的病毒样颗粒。

图5显示了各种VLP样品的透射电镜观察结果(放大倍数为100,000倍，Bar＝0.1μm)。结果显示，H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T2 VLP、H68N0-39T3 VLP、H68N0-39T4 VLP和H68N0-39T5VLP与HPV68N0 VLP类似，都能够组装成半径为25nm左右的VLP。

图6A-图6C显示了用H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T2 VLP、H68N0-39T3 VLP、H68N0-39T4 VLP和H68N0-39T5 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图6A：铝佐剂组1(免疫剂量为5.0μg，使用铝佐剂)；图6B：铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)；图6C：铝佐剂组3(免疫剂量为0.2μg，使用铝佐剂)。结果显示，H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T5VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV68的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV68N0 VLP、混合的HPV68/HPV39 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV39N15 VLP；H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV39的中和抗体，其保护效果虽稍弱于同剂量的单独的HPV39N15 VLP、混合的HPV68/HPV39 VLP，但显著优于同剂量的单独的HPV68N0 VLP。这表明，H68N0-39T1VLP和H68N0-39T5 VLP对HPV68和HPV39具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。

图7显示了HPV68N0 VLP、HPV39N15 VLP和H68N0-39T1VLP热稳定性的检测结果。其中A为HPV68N0 VLP的热稳定性检测结果；B为HPV39N15 VLP的热稳定性检测结果；C为H68N0-39T1 VLP的热稳定性检测结果。结果显示，H68N0-39T1 VLP形成的VLP具有极高的热稳定性，与野生型相当。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

序列1(SEQ ID NO:1)：

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GMNGGRKQD

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IESSIPSTYDPS

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序列18(SEQ ID NO:18)：

GKGKACKPNNVST

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AIPAQLYIKGTDIRANPGSSVYC

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ATGGCACTGTGGAGAGCCAGCGACAACATGGTGTACCTGCCCCCTCCCAGCGTGGCCAAGGTGGTCAACACCGACGACTACGTGACCCGGACCGGCATGTACTACTACGCCGGCACCTCTCGGCTCCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTGCCCATGAGCGGCGGCAGAAAGCAGGGCATCCCCAAGGTGTCCGCCTACCAGTACCGGGTGTTCAGAGTGACCCTGCCCGACCCCAACAAGTTCAGCGTGCCCGAGAGCACCCTGTACAACCCCGACACCCAGCGGATGGTCTGGGCCTGCGTGGGCGTGGAGATCGGCAGAGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTACAATCGGCTGGACGACACCGAGAACAGCCCCTTCAGCAGCAACAAGAACCCCAAGGACAGCCGGGACAACGTGGCCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGTGCCTGCCATTGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCAAGAGCTGCAAGCCCACCAACGTGCAGCAGGGCGACTGCCCCCCTCTGGAACTGGTCAACACACCCATCGAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGAAACCAAGAGCGAGGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACGTGTACGGCGACAGCATGTTCTTTTGCCTGCGGCGGGAGCAGCTGTTCGCCCGGCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACGCCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATGGTGTCCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTTCTGACCGTGGTGGACACCACCAGAAGCACCAACTTCACCCTGAGCACCACCACCGACAGCACCGTGCCCGCCGTGTACGACAGCAATAAGTTCAAAGAATACGTGCGGCACGTGGAGGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGTACCATCACCCTGTCCACCGACGTGATGAGCTACATCCACACCATGAACCCCGCCATCCTGGACGACTGGAACTTCGGCGTGGCCCCTCCCCCTAGCGCCAGCCTGGTGGATACCTACAGATACCTGCAGAGCGCCGCCATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCTGCCCCCGTGAAGAAGGACCCCTACGACGGCCTGAACTTCTGGAATGTGGACCTGAAAGAGAAGTTCAGCAGCGAGCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCCGGAAGTTCCTGCTGCAAGCCGGCGTGCGGAGAAGGCCCACCATCGGCCCCAGAAAGCGGACCGCCACCGCAGCCACAACCTCCACCTCCAAGCACAAGCGGAAGCGGGTGTCCAAGTGA

序列39(SEQ ID NO:39)：

ATGGCCCTCTGGCGCAGCTCCGATTCCATGGTCTACCTCCCCCCCCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1.突变的HPV68 L1蛋白的表达与纯化

表达载体的构建

采用多点突变PCR反应来构建编码含有来源于HPV39 L1蛋白的特定区段的突变的HPV68 L1蛋白(H68N0-39T1)的表达载体，其中，所使用的初始模板为pTO-T7-HPV68N0C质粒(其编码全长的HPV68 L1蛋白，在表2中简写为68L1N0)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。退火温度和时间列于表2。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。

向扩增产物(50μL)中加入2μL DpnI限制性内切酶(Fermentas(MBI)，货号：FD1704，2500U/管)，并在37℃温育60min。取10μL酶切产物，用于转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(终浓度25μg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃ 220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中***的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的质粒(表达载体)中***的目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：8，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3(所对应的蛋白命名为H68N0-39T1)。突变蛋白H68N0-39T1与HPV68N0C的区别在于：位于野生型HPV68 L1蛋白第53-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV39 L1蛋白第53-61位的氨基酸残基。

采用Gibson装配(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat Methods.2009；6:343–5.doi:10.1038/nmeth.1318)来构建编码其他的突变HPV68 L1蛋白的表达载体，所述突变的HPV68 L1蛋白含有来源于HPV39 L1的特定区段。简言之，首先采用PCR反应来获得一个包含突变的短片段和一个不包含突变的长片段，然后再采用Gibson装配体系将这两个片段连接成环。所使用的初始模板包括pTO-T7-HPV68N0C质粒和pTO-T7-HPV39N15C质粒(其编码N端截短了15个氨基酸的HPV39 L1蛋白，在表2中简写为39L1N15)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，用于扩增短片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸1分钟)；最后72℃延伸10分钟。用于扩增长片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟(请核对扩增条件)。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。将扩增产物进行电泳，随后使用DNA回收试剂盒(BEYOTIME(碧云天)，货号：D0033)回收目的片段并测定其浓度。按2:1的摩尔比将扩增得到的短片段和长片段混合(总体积3μL)，随后添加3μL 2XGibson装配预混试剂(2X Gibson Assembly Master Mix，购自NEB，包含T5exonuclease，Phusion DNA polymerase，Taq DNA ligase)，并在50℃反应1小时。

用装配后的产物(6μL)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素的固体LB培养基，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃ 220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中***的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中***的目的片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：4、5、6、7，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：9、10、11、12(所对应的蛋白分别命名为H68N0-39T2，H68N0-39T3，H68N0-39T4，和H68N0-39T5)。

突变蛋白H68N0-39T2与HPV68N0的区别在于：位于野生型HPV68 L1蛋白第117-151位的氨基酸残基被替换为野生型HPV39 L1蛋白第117-150位的氨基酸残基。突变蛋白H68N0-39T3与HPV68N0的区别在于：位于野生型HPV68 L1蛋白第170-182位的氨基酸残基被替换为野生型HPV39 L1蛋白第169-181位的氨基酸残基。突变蛋白H68N0-39T4与HPV68N0的区别在于：位于野生型HPV68 L1蛋白第270-292位的氨基酸残基被替换为野生型HPV39 L1蛋白第269-291位的氨基酸残基。突变蛋白H68N0-39T5与HPV68N0的区别在于：位于野生型HPV68 L1蛋白第348-359位的氨基酸残基被替换为野生型HPV39 L1蛋白第347-358位的氨基酸残基。

表2.用于构建表达载体的PCR反应的模板和引物

模板	上游引物	下游引物	产物	退火温度/时间
					68L1N0	H68N0-39T1-F	H68N0-39T1-R	H68N0-39T1	56℃/50s
39L1N15	G-H68N0-39T2-F	G-H68N0-39T2-R	H68N0-39T2-短片段	56℃/30s
					39L1N15	G-H68N0-39T3-F	G-H68N0-39T3-R	H68N0-39T3-短片段	56℃/30s
39L1N15	G-H68N0-39T4-F	G-H68N0-39T4-R	H68N0-39T4-短片段	56℃/30s
					39L1N15	G-H68N0-39T5-F	G-H68N0-39T5-R	H68N0-39T5-短片段	56℃/30s
68L1N0	G-V-H68N0-39T2-F	G-V-H68N0-39T2-R	H68N0-39T2-长片段	56℃/50s
					68L1N0	G-V-H68N0-39T3-F	G-V-H68N0-39T3-R	H68N0-39T3-长片段	56℃/50s
68L1N0	G-V-H68N0-39T4-F	G-V-H68N0-39T4-R	H68N0-39T4-长片段	56℃/50s
					68L1N0	G-V-H68N0-39T5-F	G-V-H68N0-39T5-R	H68N0-39T5-长片段	56℃/50s

表3：所使用的引物的具体序列(SEQ ID NO:20-37)

突变蛋白的大量表达

从-70℃冰箱中取出携带重组质粒pTO-T7-H68N0-39T1、pTO-T7-H68N0-39T2、pTO-T7-H68N0-39T3、pTO-T7-H68N0-39T4、pTO-T7-H68N0-39T5的大肠杆菌菌液，分别接种入100ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下培养大约8小时；然后分别转接入500ml含卡那霉素的LB培养基中(接入1ml菌液)，并继续进行培养。当细菌浓度达到OD₆₀₀为0.6左右时，将培养温度降至25℃，并向各培养瓶中加入500μL IPTG，继续培养8小时。培养结束后，离心收集菌体。获得表达了H68N0-39T1、H68N0-39T2、

H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5蛋白的菌体。

表达突变蛋白的菌体破碎

按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬上述得到的菌体。用超声波仪破碎菌体30min。以13500rpm(30000g)离心含有经破碎的菌体的裂解液15min，留取上清(即，菌体破碎上清)。

突变蛋白的色谱纯化

仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。

层析介质：SP Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)、CHT-Ⅱ(购自Bio－RAD)和Butyl Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)。

缓冲液：缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT)；以及，缓冲液B(20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT，2M NaCl)。下面的洗脱程序中用到的含有不同浓度NaCl的缓冲液是由缓冲液A和B按比例混合配置而成。

样品：如上获得的含有H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5的菌体破碎上清。

洗脱程序为：

(1)用SP Sepharose 4Fast Flow对菌体破碎上清进行阳离子交换纯化：将样品上柱，然后用含有400mM NaCl的缓冲液(80％缓冲液A+20％缓冲液B)洗脱杂蛋白，然后用含有800mM NaCl的缓冲液(60％缓冲液A+40％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有800mMNaCl的缓冲液洗脱的级分；

(2)用CHTⅡ(羟基磷灰石色谱)对前一步获得的洗脱级分进行色谱纯化：对前一步骤获得的洗脱级分进行稀释，以使得NaCl的浓度降至0.5M；将样品上柱，然后用含有500mMNaCl的缓冲液(75％缓冲液A+25％缓冲液B)洗脱杂蛋白，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液(50％缓冲液A+50％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；

(3)用HIC(疏水相互作用色谱)对前一步骤获得的洗脱级分进行色谱纯化：将样品上柱，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有200mM NaCl的缓冲液(90％缓冲液A+10％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有200mM NaCl的缓冲液洗脱的级分。

取步骤(3)获得的洗脱级分150μL，加入30μL 6X Loading Buffer(1L中含有1M TB6.8 300ml、100％甘油600ml、SDS 120g、溴酚蓝6g、β-巯基乙醇50ml)中，混匀，并于80℃水浴中温育10min。然后取10μl样品于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果示于图1中。结果显示，经过上述纯化步骤后，H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5蛋白的纯度大于90％。

通过类似的方法，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV68N0C质粒制备和纯化了HPV68N0蛋白；并且，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV39N15C质粒制备和纯化了HPV39N15蛋白。

突变蛋白的免疫印迹实验

按上述方法对经纯化的H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5蛋白进行电泳。电泳结束后，使用抗HPV L1蛋白的广谱抗体4B3进行WesternBlot检测，结果示于图2中。结果显示，H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5都能够被广谱抗体4B3特异性识别。

实施例2：HPV病毒样颗粒的组装与颗粒形态学检测

HPV病毒样颗粒的组装

取一定体积(约2ml)的蛋白H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5，分别依次透析至(1)2L储存缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，0.5M NaCl)；(2)2L复性缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0，2mM CaCl2，2mM MgCl2，0.5M NaCl)；和(3)20mM磷酸钠缓冲液pH 7.0，0.5M NaCl中。在三种缓冲液中各自进行透析12h。

通过类似的方法，将HPV68N0和HPV39N15蛋白分别组装为HPV68N0 VLP和HPV39N15VLP。

分子筛层析分析

用美国安捷伦公司的1120Compact LC高效液相色谱系统对经透析的样品进行分子筛层析分析，其中，所使用的分析柱为TSK Gel PW5000xl 7.8x300mm。分析结果如图3所示。结果显示，包含蛋白H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5的样品最先出现的蛋白峰均在13-14min左右，与HPV68N0VLP相当。这表明，如上制备的蛋白均可组装成VLP。

沉降速率分析

沉降速率分析所使用的仪器为Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法分析HPV68N0 VLP、H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T2 VLP、H68N0-39T3 VLP、H68N0-39T4 VLP和H68N0-39T5 VLP的沉降系数。结果如图4所示。结果显示，H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T2 VLP、H68N0-39T3 VLP、H68N0-39T4 VLP和H68N0-39T5 VLP的沉降系数分别为138S、148S、147S、155S和147S。这表明，如上制备的5种突变的HPV68L1蛋白各自能够组装成大小、形态与野生型VLP(HPV68N0 VLP，153S)相似的病毒样颗粒。

病毒样颗粒的形态学检测

取100μL含有VLP的样品进行透射电镜观察。所使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。简言之，取13.5μL样品，用2％磷钨酸pH7.0进行负染，并固定于喷碳的铜网上，然后进行透射电镜观察。观察结果如图5所示。结果显示，突变蛋白H68N0-39T1、H68N0-39T2、H68N0-39T3、H68N0-39T4和H68N0-39T5均可组装成病毒样颗粒。此外，结果还显示，这些突变蛋白所组装形成的颗粒的半径均在25nm左右，大小均一。这表明，这些突变蛋白与野生型HPV68的L1蛋白(HPV68N0 VLP)类似，能够形成大小均一的VLP。

实施例3：用VLP免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价

在本实验中，免疫方案如表4所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为3个组：铝佐剂组1(免疫剂量为5μg，使用铝佐剂)，铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)，和铝佐剂组3(免疫剂量为0.2μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为8个亚组，对照亚组1-3分别用单独的HPV68N0 VLP、单独的HPV39N15 VLP和混合的HPV68/HPV39 VLP(即，HPV68N0 VLP和HPV39N15 VLP的混合物，其中每种VLP均以指定的免疫剂量施用)进行免疫，实验亚组1-5分别用H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T2 VLP、H68N0-39T3 VLP、H68N0-39T4 VLP和H68N0-39T5进行免疫。

采用腹腔注射方式免疫5只小鼠/亚组，免疫剂量分别为5μg、1μg、0.2μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV68和HPV39抗体的滴度。分析结果如图6A-6C所示。H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV68的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV68N0 VLP、混合的HPV68/HPV39 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV39N15 VLP；H68N0-39T1 VLP、H68N0-39T5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV39的中和抗体，其保护效果虽稍弱于同剂量的单独的HPV39N15 VLP、混合的HPV68/HPV39 VLP，但显著优于同剂量的单独的HPV68N0 VLP。这表明，H68N0-39T1VLP和H68N0-39T5 VLP对HPV68和HPV39具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。

表4.免疫方案

实施例4：VLP诱导血清转换的ED₅₀的评价

采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄的BalB/c雌鼠(8只)进行免疫，其中，实验组使用H68N0-39T1 VLP或H68N0-39T5 VLP(免疫剂量为0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg或0.011μg)；对照组使用单独的HPV68N0 VLP或单独的HPV39N15 VLP(免疫剂量为0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg或0.011μg)，或者混合的HPV68/HPV39 VLP(即，HPV68N0 VLP和HPV39N15 VLP的混合物，其中每种VLP的免疫剂量各为0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg或0.011μg)；免疫体积为1mL。另外，还将用于稀释疫苗的稀释液用作空白对照。每组免疫8只小鼠，并且于免疫后第五周采集血清。随后，通过中和实验检测血清中的中和抗体滴度，并根据Reed-Muench法(Reed LJ MH.A simple method of estimating fifty percentendpoints.Am J Hyg.1938；27:493-7)计算各个样品诱导血清转换(即，诱导小鼠产生抗体)的ED₅₀。实验结果如表5.1-5.5所示。

表5.1:HPV68N0 VLP诱导小鼠产生抗HPV39和抗HPV68抗体(血清转换)的ED₅₀

表5.2:HPV39N15 VLP诱导小鼠产生抗HPV68和抗HPV39抗体(血清转换)的ED₅₀

表5.3:H68N0-39T1 VLP诱导小鼠产生抗HPV68和抗HPV39抗体(血清转换)的ED₅₀

表5.4:H68N0-39T5 VLP诱导小鼠产生抗HPV68和抗HPV39抗体(血清转换)的ED₅₀

表5.5:混合的HPV68/HPV39 VLP诱导小鼠产生抗HPV68和抗HPV39抗体(血清转换)的ED₅₀

结果显示，H68N0-39T1 VLP诱导小鼠产生抗HPV68抗体的ED₅₀与单独的HPV68N0VLP和混合的HPV68/HPV39 VLP相当，且显著优于单独的HPV39N15 VLP；并且，H68N0-39T1VLP诱导小鼠产生抗HPV39抗体的ED₅₀虽稍弱于单独的HPV39N15 VLP和混合的HPV68/HPV39VLP，但显著优于单独的HPV68N0 VLP。这进一步表明，H68N0-39T1 VLP对HPV68和HPV39具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。

实施例5：病毒样颗粒的热稳定性的评价

使用购自美国GE公司(原MicroCal公司)的差温量热仪VP Capillary DSC来评价HPV68N0蛋白、HPV39N15蛋白和H68N0-39T1蛋白所形成的VLP的热稳定性，使用所述蛋白的储存缓冲液作为对照，并且以1.5℃/min的升温速率在10℃-90℃区间对各蛋白进行扫描。检测结果如图7A-7C所示。结果显示，H68N0-39T1 VLP具有极高的热稳定性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

厦门万泰沧海生物技术有限公司

<120> 一种人***瘤病毒68型L1蛋白的突变体

<130> IDC180138

<150> CN201810566210.5

<151> 2018-06-04

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 505

<212> PRT

<213> Human papillomavirus type 68

<400> 1

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tccagcgaca gccagctgtt caacaagccc tactggctgc acaaggccca gggccacaac 960

aacggcatct gctggcacaa ccagctgttt ctgaccgtgg tggacaccac cagaagcacc 1020

aacttcaccc tgagcaccac caccgacagc accgtgcccg ccgtgtacga cagcaataag 1080

ttcaaagaat acgtgcggca cgtggaggaa tacgacctgc agttcatctt ccagctgtgt 1140

accatcaccc tgtccaccga cgtgatgagc tacatccaca ccatgaaccc cgccatcctg 1200

gacgactgga acttcggcgt ggcccctccc cctagcgcca gcctggtgga tacctacaga 1260

tacctgcaga gcgccgccat cacctgccag aaggacgccc ctgcccccgt gaagaaggac 1320

ccctacgacg gcctgaactt ctggaatgtg gacctgaaag agaagttcag cagcgagctg 1380

gaccagttcc ccctgggccg gaagttcctg ctgcaagccg gcgtgcggag aaggcccacc 1440

atcggcccca gaaagcggac cgccaccgca gccacaacct ccacctccaa gcacaagcgg 1500

aagcgggtgt ccaagtga 1518

<210> 9

<211> 1515

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码H68N0-39T2的DNA序列

<400> 9

atggcactgt ggagagccag cgacaacatg gtgtacctgc cccctcccag cgtggccaag 60

gtggtcaaca ccgacgacta cgtgacccgg accggcatgt actactacgc cggcacctct 120

cggctcctga ccgtgggcca cccctacttc aaggtgccca tgagcggcgg cagaaagcag 180

ggcatcccca aggtgtccgc ctaccagtac cgggtgttca gagtgaccct gcccgacccc 240

aacaagttca gcgtgcccga gagcaccctg tacaaccccg acacccagcg gatggtctgg 300

gcctgcgtgg gcgtggagat cgggcgcggg cagcccctcg gcgtcggcat ctccggccac 360

cccctgtaca accgccagga cgacaccgag aatagcccct tcagcagcac aacaaacaag 420

gattcccgcg acaacgtcag cgtcgactac aagcagaccc agctgtgcat catcggctgc 480

gtgcctgcca ttggcgagca ctgggccaag ggcaagagct gcaagcccac caacgtgcag 540

cagggcgact gcccccctct ggaactggtc aacacaccca tcgaggacgg cgacatgatc 600

gacaccggct acggcgccat ggacttcggc accctgcagg aaaccaagag cgaggtcccc 660

ctggacatct gccagagcgt gtgcaagtac cccgactacc tgcagatgag cgccgacgtg 720

tacggcgaca gcatgttctt ttgcctgcgg cgggagcagc tgttcgcccg gcacttctgg 780

aacagaggcg gcatggtcgg cgacaccatc cccaccgaca tgtacatcaa gggcaccgac 840

atcagagaga cacccagcag ctacgtgtac gcccccagcc ccagcggcag catggtgtcc 900

agcgacagcc agctgttcaa caagccctac tggctgcaca aggcccaggg ccacaacaac 960

ggcatctgct ggcacaacca gctgtttctg accgtggtgg acaccaccag aagcaccaac 1020

ttcaccctga gcaccaccac cgacagcacc gtgcccgccg tgtacgacag caataagttc 1080

aaagaatacg tgcggcacgt ggaggaatac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgtacc 1140

atcaccctgt ccaccgacgt gatgagctac atccacacca tgaaccccgc catcctggac 1200

gactggaact tcggcgtggc ccctccccct agcgccagcc tggtggatac ctacagatac 1260

ctgcagagcg ccgccatcac ctgccagaag gacgcccctg cccccgtgaa gaaggacccc 1320

tacgacggcc tgaacttctg gaatgtggac ctgaaagaga agttcagcag cgagctggac 1380

cagttccccc tgggccggaa gttcctgctg caagccggcg tgcggagaag gcccaccatc 1440

ggccccagaa agcggaccgc caccgcagcc acaacctcca cctccaagca caagcggaag 1500

cgggtgtcca agtga 1515

<210> 10

<211> 1518

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码H68N0-39T3的DNA序列

<400> 10