阅读说明：本技术 ***瘤病毒相关抗原短肽及其应用 (Papillomavirus related antigen short peptide and application thereof ) 是由 黄燕花 赵乙木 罗夫·辛克纳吉 孙晨 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了乳头瘤病毒相关抗原短肽及其应用。所述乳头瘤病毒相关抗原短肽序列如SEQ ID NO:1-16任一所示。该短肽具有与DC细胞上MHC I类和MHC II分子高度的亲和力,并能有效地使其起到抗原提呈作用,具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力。将该短肽中的至少一条体外致敏树突状细胞,制备的DC疫苗能够预防乳头瘤病毒相关疾病,具有良好的临床转化前景。而且,本发明的抗原短肽长度较短,化学合成难度小,可以直接合成得到高纯的产物,应用成本大大降低,同时效果明确,具有很好的应用前景。(The invention discloses a papilloma virus related antigen short peptide and application thereof, wherein the sequence of the papilloma virus related antigen short peptide is shown as SEQ ID NO: 1-16- , the short peptide has high affinity with MHC class I and MHC class II molecules on DC cells, can effectively play a role in antigen presentation, and has good potential of a polypeptide vaccine and a DC vaccine, at least in the short peptide sensitizes dendritic cells in vitro, and the prepared DC vaccine can prevent papilloma virus related diseases and has good clinical transformation prospect.)

***瘤病毒相关抗原短肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及***瘤病毒相关抗原短肽及其应用。

背景技术

人***瘤病毒(human papillomavirus，HPV)。HPV主要引起人类皮肤、黏膜的增生性病变，HPV基因组约7.9KB，陈述的病毒颗粒直径为52～55nm。对皮肤黏膜上皮细胞具有较高的亲嗜性，可以造成棘细胞增生，行程表皮增厚和表角化。目前已证实，HPV可以参与多种肿瘤的发生，卵巢癌患者中HPV16、HPV18、HPV33感染率更高；肺癌患者HPV16和HPV18的基因和抗体表达升高；HPV也是食管癌的危险因素，其可引起食管上皮细胞恶性转化和致癌作用；结直肠癌的组织中HPV 16、HPV18表达升高。另外HPV还可以参与多种慢性疾病的进展，如慢阻肺等。

HPV目前已有有效疫苗，可以起到防止***的作用。但是对于更多更优HPV疫苗的探究仍具有很大的需求。免疫学表明，树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前所知的，功能最强的抗原提呈细胞，被认为是机体免疫反应的始动者，在免疫应答中处在中心位置。成熟的DC表达丰富的、与抗原提呈相关的MHC I类和MHC II类分子，其可以摄取、加工处理并提呈抗原；参与免疫记忆的维持；分泌细胞因子调节免疫应答。而能与MHC I类和MHC II类分子结合的***瘤病毒抗原多肽尤为关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有***瘤病毒疫苗的不足，提供能与MHC I类和MHC II类分子结合的***瘤病毒抗原多肽，提供基于DC技术的HPV疫苗，可应用于采用DC技术防治HPV相关慢性疾病，联合干细胞因子/vitrogen增加成熟DC细胞活性，同时通过多种HPV特异性抗原肽，促进DC细胞活化，达到预防***瘤病毒感染和治疗的目的，具有很好的应用前景。

本发明的目的是提供HPV抗原相关短肽。

本发明另一目的是提供所述HPV抗原相关短肽在制备HPV抗原多肽DC疫苗方面的应用。

本发明再一目的是提供一种HPV抗原多肽DC疫苗。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

提供HPV相关抗原短肽，其序列如SEQ ID NO:1-16任一所示。

提供所述HPV相关抗原短肽在制备***瘤病毒抗原多肽DC疫苗方面的应用。

提供所述HPV相关抗原短肽在制备HPV相关疾病的防治药物中的应用。

另外还提供一种***瘤病毒相关慢病防治的DC疫苗，由上述***瘤病毒相关抗原短肽和树突状细胞加载得到。具体地，是由SEQ ID NO:1-16中至少一条所示短肽联合体外致敏树突状细胞，从而获得的自体树突状细胞制剂。

SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所述的***瘤病毒相关抗原短肽能够诱导DC起到抗原提呈作用。

具体地，疫苗为静脉回输型疫苗。

在所述***瘤病毒相关慢病防治的DC疫苗的制备方法中，选用干细胞因子或vitrogen因子作为佐剂增加DC细胞活性，特异性的抗原肽体外致敏树突状细胞，获得自体树突状细胞制剂，作为静脉回输型***瘤病毒相关慢病防治疫苗。具体制备方法为：以成熟促进因子，同时以干细胞因子或Vitrogan因子作为佐剂，促进DC细胞成熟；然后向诱导成熟的DC细胞培养体系中加入权利要求1所述短肽，收集负载有短肽片段的DC细胞，用生理盐水洗涤后，用生理盐水重悬即得到DC疫苗。

更具体地，作为一种可选择的方案，所述***瘤病毒相关慢病防治的DC疫苗的制备步骤如下：

S1.DC细胞的提取与诱导：

S11.获取未成熟DC细胞

采集健康捐献者的外周血，通过淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基中，37℃、5％CO₂条件下常规培养3小时后，贴壁细胞为未成熟DC细胞；

S12.未成熟DC细胞的扩增培养

37℃、5％CO₂条件下培养5天，期间隔天换液，完成未成熟DC细胞(imDC细胞)的扩增培养；

S13.DC细胞的诱导

加入成熟促进因子，同时以干细胞因子或Vitrogan因子作为佐剂，促进DC细胞成熟；

S2.多肽的负载：

诱导DC细胞成熟5天后，向培养体系中加入权利要求1所述短肽；

S3.制备DC疫苗：

离心收集负载有短肽片段的DC细胞，用生理盐水洗涤细胞3次，最后将负载有短肽片段的DC细胞用生理盐水重悬，即得到DC疫苗。

另外所述DC疫苗在制备***瘤病毒相关慢性疾病的防治药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明结合生物信息学技术预测HPV自身可以做为抗原的序列簇，并经过大量研究摸索，得到的16条***瘤病毒抗原肽具有与DC细胞上MHC I类和MHC II分子高度的亲和力，并能有效地使其起到抗原提呈作用，具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力，并且提示其具有良好的临床转化及疾病防治前景。

本发明选用特异性的表位多肽，体外致敏自体DC细胞，制备DC细胞制剂，对患者进行静脉回输，重建机体全身免疫平衡，启动免疫系统，对感染微生物的特异性预防。

本发明采用的DC技术，用多种特异性抗原肽联合激活树突细胞，这些抗原肽具有极强的特异性，诱导具有更高活性的树突状细胞携带多种抗原信息，回输进入人体后可刺激机体免疫，可以达到诱导人体产生针对***瘤病毒产生特异性抗体，及针对***瘤病毒特异性的CTL细胞，从而可以有效防治***瘤病毒相关慢性疾病的发生发展。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了序列如SEQ ID NO:1-16所示的***瘤病毒抗原多肽，这些抗原肽具有与DC细胞上MHC I类和MHC II分子高度的亲和力，并能有效地使其起到抗原提呈作用，具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力。

而且本发明的短肽长度较短，化学合成难度小，可以直接合成得到高纯的产物，应用成本大大降低，具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力，能够预防***瘤病毒相关疾病，尤其是相关慢性疾病，具有良好的临床转化及实际应用前景。

基于本发明***瘤病毒抗原肽制备DC疫苗用于***瘤病毒防治的技术具有诸多优势：(1)DC体外激活后，干细胞因子/Vitrogen因子可以增加DC细胞活性，增加识别抗原提成能力，回输体内后促进产生免疫应答。(2)长期免疫记忆：由于使用特异抗原肽与具有记忆功能的免疫细胞充分接触，回输体内后，使免疫细胞具有了精确长久的免疫记忆，加强了免疫防治效果，为防止再感染或预防提供了长期保护。(3)DC回输后体内后，可以重建机体免疫，从而达到防治体内感染病毒的目的。

附图说明

图1为DC疫苗治疗组和多肽-DC疫苗对照组对靶细胞的杀伤活性的对比。

图2为体外DC致敏T细胞，CCK-8法检测空白对照组、DC疫苗组、多肽疫苗组、多肽-DC疫苗组T细胞活性变化。

图3为小鼠免疫6周后，ELISA检测空白对照组、DC疫苗组、多肽疫苗组、多肽-DC疫苗组中血清中的抗体水平。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

树突细胞治疗技术(Dendritic Cell，DC)是通过收集自体外周血单个核细胞后，在严格无菌环境下加入特定的细胞因子，同时辅以干细胞因子/Vitrogen因子，获得转化的更具活性的具有抗原呈递功能的树突状细胞(dendritic cell，DC)。回输前一天加入HPV抗原多肽，DC通过识别和捕获多种单表位抗原肽，获得高危致病病毒特异性抗原肽致敏的成熟树突细胞，利用树突细胞的可以靶向游走及免疫活性，可以诱导人体自身产生大量针对特异抗原产生的抗体，进而重建机体免疫平衡，从而通过防治致病病毒感染，对致病微生物的预防更定向更主动，根本上防治***瘤病毒相关慢病的发生。

本研究目的是研发筛选能与MHC I类和MHC II类分子结合的***瘤病毒抗原多肽，用于制备基于DC技术的***瘤病毒疫苗。

1、HPV抗原与MHC I类和MHC II类分子结合能力多肽的预测：

通过uniprot数据库，确定HPV序列簇(https://www.uniprot.org/uniref/)，再将序列簇输入(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)在线分析，Threshold设置为0.6，确定HPV抗原蛋白，通过IEDB数据库预测(http://tools.iedb.org/main/)抗原与MHC I类和MHC II类分子具有高度亲和力的短肽位点，获得一系列多肽。

2、从上述多肽中筛选出50条预测评分高且预测毒性较小的多肽片段，进行进一步研究。具体实验如下：

(1)DC细胞扩增及成熟

采集健康捐献者的外周血50ml，通过淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基(购自gibico公司)中，常规培养37℃、5％CO₂条件3小时后，贴壁细胞为未成熟DC。未成熟DC，37℃、5％CO₂条件，培养5天(隔天换液)，完成imDC的扩增培养。加入成熟因子，同时以干细胞因子或Vitrogan因子作为佐剂，促进DC成熟。

(2)特异性CTL对靶细胞的杀伤活性

将多肽-DCs诱导活化的T淋巴细胞作为效应性细胞，表达HPV的阳性成纤维细胞作为靶细胞进行杀伤活性测定。

分为四组：治疗组多肽-DCs诱导活化的T细胞，对照组DCs诱导活化的T细胞，按照效应细胞与靶细胞数量比例为2：1加入96孔培养板中，每组3个复孔，同时设置效应细胞组，靶细胞组作为空白对照，置于37℃、5％CO₂培养箱培养12h，用CCK-8法检测实验孔和对照孔OD 450nm值并计算杀伤率。

杀伤率＝[靶细胞OD值+效应细胞OD值-实验孔OD值]/靶细胞OD值

结果显示，根据多肽-DCs诱导活化的CTL对靶细胞的抑制性高低选择最佳的多肽，与上述预测出的50条多肽的预测评分高低，对应关系不显著相关，预测结果参考性较差。

最终选择的最佳16条多肽的序列如表1，此16条多肽-DCs诱导活化的CTL对靶细胞的抑制性数据如图1，多肽-DCs诱导活化的CTL对靶细胞的抑制活性明显高于未经多肽负载的DCs诱导活化的CTL。

表1

(3)T淋巴细胞的诱导活化

随机抽取以上16条多肽中的一条，将得到的多肽-DCs加入丝裂素孵育，使其失去增殖活性，用PBS洗2遍，按DC:T浓度比为1:20的比例混合于96孔培养板共培养，分为四组，阴性对照组、多肽组、DC组、多肽-DC组，每隔2天换液，培养至第四天时加入等量的多肽-DCs，通过重复刺激诱导特异性CTL克隆的活化增殖，检测至第6天细胞活性。如图2所示，发现多肽-DC组活性最强。

3、HPV特异性DC疫苗的免疫原性

通过随机抽取以上16条多肽中的一条，进行免疫原性检测。

每组5只BALB/C雌性小鼠，6-8周龄，分为4组，将多肽疫苗、多肽-DC疫苗、DC疫苗(阴性对照)，生理盐水作为空白对照，分别进行肌肉注射小鼠2×10⁵细胞/只，共行免疫两次，间隔2周。分别在免疫6周后，眼球摘除取血，分离血清(-80℃保存)，进行免疫检测。

通过ELISA试剂盒检测血清抗-HPV IgG抗体水平，结果如图3所示，DC疫苗组及空白组均为阴性；多肽-DC组为80％，多肽疫苗组小鼠血清40％转阳。而多肽-DC组抗体滴度明显高于单纯多肽疫苗组。结果表明，本发明研发的多肽-DC疫苗的转阳数较高。

上述实验表明，本发明所制备的DC疫苗能够有效地发挥抗原提呈作用，诱导机体产生HPV抗原的特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，从而有望达到防治HPV相关慢病的疗效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 维塔恩（广州）医药有限公司

<120> ***瘤病毒相关抗原短肽及其应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 1

Gln Ile Leu Pro His His Trp His Phe

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 2

Arg Pro Ser Thr Val Thr Leu Leu Leu

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 3

Asn Pro Arg Pro Ser Thr Val Thr Leu

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 4

Asn Pro Arg Pro Ser Thr Val Thr Leu Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 5

Gln Asn Pro Arg Pro Ser Thr Val Thr Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 6

Leu Gln Asn Pro Arg Pro Ser Thr Val

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 7

Leu Leu Gln Asn Pro Arg Pro Ser Thr Val

1 5 10

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 8

Ala Tyr Phe Cys Ala Val Asp Asp Met Ala Leu Leu Gln Asn Pro

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 9

Val Thr Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Pro Gln Ile Leu

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 10

Thr Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Pro Gln Ile Leu Pro

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 11

Thr Val Thr Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Pro Gln Ile

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 12

Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Pro Gln Ile Leu Pro His

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 13

Ser Thr Val Thr Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Pro Gln

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 14

Pro Thr Tyr Phe Ser Ala Leu Asp Gly Ala Tyr Phe Cys Ala Val

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 15

Thr Tyr Phe Ser Ala Leu Asp Gly Ala Tyr Phe Cys Ala Val Asp

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> ***瘤病毒相关抗原短肽

<400> 16

Leu Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Pro Gln Ile Leu Pro His His

1 5 10 15