一种恶臭假单胞菌***载体的构建方法及其应用
阅读说明：本技术 一种恶臭假单胞菌***载体的构建方法及其应用 (Construction method and application of pseudomonas putida suicide vector ) 是由 崔格特 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法,并提供了该自杀载体在恶臭假单胞菌中进行基因敲除的应用方法。首先将pBBR1MCS-5质粒的复制子替换成R6K复制子,使得其能在大肠杆菌S17/λpir中复制,而不能在恶臭假单胞菌中复制,然后在该质粒中依次插入待敲除靶基因的上游同源臂、抗生素抗性筛选基因和待敲除靶基因的下游同源臂,从而得到恶臭假单胞菌基因敲除自杀载体。将该自杀载体通过转化或接合转移导入恶臭假单胞菌中,构建待敲除靶基因的缺失突变株。本发明提出的构建恶臭假单胞菌基因缺失突变株的方法,方便快捷,正确率高。(The invention discloses a construction method of a pseudomonas putida suicide vector and provides an application method of the suicide vector in gene knockout of pseudomonas putida. Firstly, replacing a replicon of a pBBR1MCS-5 plasmid with an R6K replicon to ensure that the replicon can replicate in Escherichia coli S17/lambda pir but not in Pseudomonas putida, and then sequentially inserting an upstream homology arm of a target gene to be knocked out, an antibiotic resistance screening gene and a downstream homology arm of the target gene to be knocked out into the plasmid to obtain the pseudomonas putida gene knockout suicide vector. The suicide vector is introduced into pseudomonas putida through transformation or conjugative transfer, and a deletion mutant strain of a target gene to be knocked out is constructed. The method for constructing the pseudomonas putida gene deletion mutant strain provided by the invention is convenient and rapid, and has high accuracy.)
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种恶臭假单胞菌***载体的构建方法及其应用。
背景技术
恶臭假单胞菌是一类革兰氏阴性菌，具有广泛的代谢多样性和对不同环境的强适应性，经常被用于细菌基础代谢途径的研究，还被广泛地应用于各种生物技术应用中，如污染物的生物修复和特殊化学合成物的生产等。基因敲除是菌株遗传操作的主要方式，也是进行基因和蛋白功能研究、阐述生物降解途径和调控的主要方法，因此发展高效、快捷、准确的基因敲除手段是充分利用恶臭假单胞菌的重要前提。
***质粒是指一些在某些特定细菌中自主复制而在其它细菌中不能自主复制的质粒，由于大多数细菌中不存在复制基因起始所需的复制蛋白而无法复制，因此，当***质粒进入宿主细胞时，要么不能复制，被消除，要么在外界选择性压力的作用下整合到宿主染色体上，和染色体一起复制。依据***质粒的这一特点，将采用基因工程技术构建的基因突变DNA片段克隆入***质粒，利用突变基因两端的同源片段与基因组发生同源交换，构建得到精确的基因缺失突变株，而质粒本身由于***性特性连同染色体上原有的野生型基因一起随着细菌的传代从菌体中消失。
目前应用广泛的恶臭假单胞菌基因敲除载体为pK18mobsacB，这种传统***载体进行基因敲除时存在一些明显缺陷，包括：(1)sacB是被广泛用作***载体的致死基因，但sacB所引发的蔗糖致死效应在恶臭假单胞菌中教弱，导致筛选到正确缺失突变株的比例非常低，造成筛选工作量增大；(2)***载体本身较大，造成质粒接合转移的效率低；(3)同源臂连接到一起，进行二轮筛选，但由于第二轮交换回复为野生型的概率非常大，正确率低，常用手段为PCR验证，增加了筛选敲除突变体的成本。因此，当用于恶臭假单胞菌基因敲除时，现有***载体表现出明显的局限性。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种恶臭假单胞菌***载体的构建方法及其应用，实现高效、快捷、准确地对恶臭假单胞菌进行基因敲除。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提出了一种恶臭假单胞菌***载体的构建方法，包括如下步骤：
S1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到DNA片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；
S2、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到R6K复制子，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；
S3、将步骤S1所述DNA片段与步骤S2所述R6K复制子均用限制性内切酶NdeI进行酶切，然后连接得到载体pBR6K；
S4、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的上游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup；
S5、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到卡那霉素抗性基因，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan；
S6、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的下游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan-down；
在以上技术方案中，所述R6K复制子能在大肠杆菌S17/λpir中复制，不能在恶臭假单胞菌中复制。在待敲除靶基因的上下游同源臂之间***抗生素抗性筛选基因，一方面作为筛选阳性突变菌株的抗性标记位点，另一方面可以作为待敲除靶基因突变***序列，该抗生素抗性筛选基因中断靶基因的表达。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述待敲除靶基因x的上游同源臂和下游同源臂的长度分别为600bp-1000bp，使得容易在受体菌株中发生同源交换，效率高。
第二方面，本发明提出了一种利用所述方法构建的恶臭假单胞菌***载体构建恶臭假单胞菌基因缺失菌株的方法，将所述恶臭假单胞菌***载体经转化导入供体菌中，然后将此供体菌与受体菌混合，经接合作用将恶臭假单胞菌***载体转移进入受体菌，通过所述抗生素抗性筛选基因对应的抗生素和庆大霉素共同筛选，获得所述待敲除靶基因缺失的菌株。
第三方面，本发明还提出了一种利用所述方法构建的恶臭假单胞菌***载体构建恶臭假单胞菌基因缺失菌株的方法，将所述恶臭假单胞菌***载体通过热激转化或电转化直接导入恶臭假单胞菌中进行培养发生同源交换，通过所述抗生素抗性筛选基因对应的抗生素和庆大霉素共同筛选，获得所述待敲除靶基因缺失的菌株。
第四方面，本发明提出了所述方法构建的恶臭假单胞菌***载体在恶臭假单胞菌的基因敲除中的应用。
本发明的恶臭假单胞菌***载体的构建方法及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：
1.pBBR1MCS-5为广宿主载体，其复制元件与多种细菌兼容，因此能在多种细菌中稳定存在，本发明将质粒pBBR1MCS-5的复制子替换成R6K复制子，R6K复制子来自噬菌体基因组，必须在有识别这个复制子的特定蛋白存在条件下才能在细胞中复制，大肠杆菌S17/λpir中含有这样的复制系统，而恶臭假单胞菌中则没有，所以在S17/λpir菌株中构建***载体后，将其导入恶臭假单胞菌中，由于***载体在恶臭假单胞菌中无法进行复制，因此只有通过同源交换整合到基因组上的载体才能留存；
2.本发明的***载体分子量小，且带有mob基因，既能利用两亲本接合的方式也能用电转化的方式被导入受体菌株中，有利于提高接合转移或转化的频率以及正确整合的概率；
3.突变体筛选可使用PCR法也可使用抗生素法，操作简单，准确率高；
4.利用本发明的***载体，采取与基因敲除同样的策略可实现基因敲入和基因突变等等研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1载体pBR6K的构建示意图。
图2为实施例2fleQ基因***载体pBR6K-fleQup-kan-down的图谱。
图3为实施例2用fleQ基因内部引物进行PCR扩增检测突变体的检测图，1号泳道是以野生型KT2440为模板的扩增产物，2、3号泳道是以筛选得到的fleQ突变体为模板的扩增产物，M代表DNA Marker。
图4为实施例2用fleQ基因外侧引物进行PCR扩增检测突变体的检测图，1号泳道是以野生型KT2440为模板的扩增产物，2、3号泳道是以筛选得到的fleQ突变体为模板的扩增产物，M代表DNA Marker。
图5为实施例2将用fleQ基因外侧引物扩增的PCR产物用EcoRI+BamHI进行酶切的检测图，1、3、5泳道分别是没有进行酶切的野生型KT2440和2个突变体的扩增产物，2、4、6泳道分别是1、3、5泳道的酶切产物，M代表DNA Marker。
图6为实施例2fleQ缺失突变体和互补菌株游动性的检测图，WT代表野生型恶臭假单胞菌KT2440，ΔfleQ代表fleQ突变体，cΔfleQ代表fleQ突变体互补菌株。
图7为实施例3PP_0914基因***载体pBR6K-PP_0914up-kan-down的图谱。
图8为实施例3用PP_0914基因内部引物进行PCR扩增检测突变体的检测图，1号泳道为以野生型KT2440为模板扩增的产物，2、3、4号泳道为突变体为模板扩增的产物，M代表DNA Marker。
图9为实施例3用PP_0914基因外侧引物进行PCR扩增检测突变体的检测图，1号泳道是以野生型KT2440为模板的扩增产物，2、3、4号泳道为突变体为模板扩增的产物，M代表DNA Marker。
图10为实施例3将用PP_0914基因外侧引物扩增的PCR产物用EcoRI+BamHI进行酶切的检测图，1、3、5、7泳道分别是没有进行酶切的野生型KT2440和2个突变体的扩增产物，2、4、6、8泳道分别是1、3、5、7泳道的酶切产物，M代表DNA Marker。
图11为实施例3PP_0914缺失突变体和野生型KT2440生物被膜的检测图，WT代表野生型恶臭假单胞菌KT2440，ΔPP_0914代表PP_0914突变体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验用的大肠杆菌S17/λpir和恶臭假单胞菌KT2440购买于北京全式金公司，生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度为：20μg/mL庆大霉素Gm或50μg/mL卡那霉素Km。实验所用的原始质粒pBBR1MCS-5和pTnmod-RKm’均购买于生物技术公司，常见于市面。载体克隆、接合转移、电转化、感受态细胞制备详细步骤见分子克隆实验指南。
实施例1、载体pBR6K的构建
载体pBR6K的构建示意图如图1所示，利用引物对P1/P2，以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增除去其复制子的序列；利用引物对P3/P4，以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增R6K复制子；将两种PCR产物均用限制性内切酶NdeI酶切；然后用Takara公司的T4DNA连接酶将酶切后的片段连接在一起；测序验证，确定R6K复制子正确的***到载体上，最终得到载体pBR6K。如图1所示的载体pBR6K中，gentamicin-R为庆大霉素抗性基因用于筛选，lacZalpha基因编码半乳糖苷酶亚基用于蓝白班筛选；mob基因可以让质粒通过两亲本接合在不同菌株中转移；lacZ基因中有多克隆位点，可以将靶基因的同源臂通过这些酶切位点连入载体pBR6K。
实施例2、敲除恶臭假单胞菌KT2440的fleQ基因
S1、***载体pBR6K-fleQup-kan-down的构建
FleQ是假单胞菌中的一种转录调节子，对假单胞菌的生物被膜形成和游动性有重要影响，本发明用fleQ基因作为靶基因来检验本发明的可行性。首先以恶臭假单胞菌KT2440基因组总DNA为模板，利用引物对P5/P6扩增出fleQ基因上游600bp的同源臂，用XhoI和EcoRI酶切并连入pBR6K载体，得到载体pBR6K-fleQup，测序验证；然后以pTnmod-RKm’质粒为模板，利用引物对P7/P8扩增出卡那霉素抗性基因kan，用EcoRI和BamHI酶切并连入pBR6K载体，得到载体pBR6K-fleQup-kan，测序验证；最后以恶臭假单胞菌KT2440基因组总DNA为模板，利用引物对P9/P10扩增出fleQ基因下游1000bp的同源臂，用BamHI和XbaI酶切并连入pBR6K载体，得到载体pBR6K-fleQup-kan-down，测序验证，最终得到***载体pBR6K-fleQup-kan-down。***载体pBR6K-fleQup-kan-down的图谱如图2所示。
S2、将***载体导入恶臭假单胞菌KT2440中
通过热激转化或电转化将***载体pBR6K-fleQup-kan-down导入供体菌大肠杆菌S17/λpir感受态细胞中，将导入此***载体的大肠杆菌S17/λpir与受体菌恶臭假单胞菌KT2440混合，28℃摇床复苏6小时，将菌液涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，静置培养2天。
S3、fleQ突变体的筛选和验证
用抗生素致死法筛选转化子。若发生单交换，fleQ基因不能被完全敲除掉，***质粒会完全被整合到基因组上，因此会同时具有卡那霉素和庆大霉素两种抗性；若发生双交换，fleQ完全被kan取代，***质粒不会被整合到基因组上，而且其不能在KT2440中复制，在传代中会被消除，所以正确的fleQ缺失突变体有卡那霉素抗性而无庆大霉素抗性。挑取平板上的菌落，同时接种到含卡那霉素的LB培养基和含有卡那霉素加庆大霉素的LB培养基中，28℃培养12小时后观察，只能在含卡那霉素培养基里面生长而不能在含庆大霉素的LB中生长的菌株就是正确的fleQ突变体。
用PCR法检测突变体。这样最后得到的突变体即为靶基因被替换成卡那霉素抗性基因的突变体。若发生单交换，fleQ基因仍然存在于菌株中，用fleQ基因内部引物对P11/P12扩增则可以扩出条带；若发生双交换，fleQ完全被kan取代，用fleQ基因内部引物对P11/P12扩增则不能扩出条带，如图3所示，野生型为模板可扩增出产物，突变体为模板扩增无产物。另外用fleQ基因外侧引物对对P13/P14检测的时候，单交换不能扩出产物，正确的双交换和野生型能扩出，如图4所示，野生型和两个突变体菌扩出产物。以野生型菌株和突变体基因组为模板时所扩增出的产物中限制性酶切位点不同，野生型中无EcoRI和BamHI酶切位点，突变体中有，可以用酶切的方式检测突变体是否正确。如图5所示，野生型的PCR产物不能被酶切，突变体的可以被切开。
S4、fleQ突变体游动性检测
fleQ基因在恶臭假单胞菌鞭毛合成过程中起重要调控作用，敲除fleQ会导致菌株丧失游动性，对利用本发明中的方法筛选到的fleQ突变体进行游动性检测。如图6所示，与已知报道结果一致，静置培养12小时后，fleQ突变体不具有游动性，互补后游动性部分恢复，说明利用本发明中的方法得到的菌株时正确的fleQ敲除突变体。
实施例3、敲除恶臭假单胞菌KT2440的PP_0914基因
S1、***载体pBR6K-PP_0914up-kan-down的构建
PP_0914是恶臭假单胞KT2440中的一个磷酸二酯酶，负责降解第二信使分子c-di-GMP，调控菌株生物被膜和游动性，缺失PP_0914导致菌株生物被膜形成能力增强。本发明用PP_0914基因作为靶基因来检验本发明的可行性。首先以恶臭假单胞菌KT2440基因组总DNA为模板，利用引物对P15/P16扩增出pp_0914基因上游1000bp的同源臂，然后用XhoI+EcoRI连入pBR6K载体，测序验证；然后以pTnmod-RKm’质粒为模板，利用引物对P7/P8扩增出卡那霉素抗性基因kan，用EcoRI和BamHI酶切并连入pBR6K载体，测序验证；最后以恶臭假单胞菌KT2440基因组总DNA为模板，利用引物对P17/P18扩增出PP_0914基因下游600bp的同源臂，用BamHI和XbaI酶切并连入pBR6K载体，测序验证，最终得到***载体pBR6K-PP_0914up-kan-down。***载体pBR6K-PP_0914up-kan-down的图谱如图7所示。
S2、将***载体导入恶臭假单胞菌KT2440中
通过热激转化或电转化将***载体pBR6K-PP_0914up-kan-down导入恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞中，28℃摇床复苏6小时，将菌液涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，静置培养2天。
S3、PP_0914突变体的筛选和验证
用抗生素致死法筛选转化子。采用实施例2步骤S3同样的抗生素致死法筛选正确的PP_0914突变体。
用PCR法检测突变体。若发生单交换，PP_0914基因仍然存在于菌株中，用PP_0914基因内部引物对P19/P20扩增则可以扩出条带；若发生双交换，PP_0914完全被kan取代，用PP_0914基因内部引物对P19/P20扩增则不能扩出条带，如图8所示，野生型为模板可扩增出产物，突变体为模板扩增无产物。另外用PP_0914基因外侧引物对对P21/P22检测的时候，单交换不能扩出产物，正确的双交换和野生型能扩出，如图9所示，野生型和两个突变体菌扩出产物。以野生型菌株和突变体基因组为模板时所扩增出的产物中限制性酶切位点不同，野生型中无EcoRI和BamHI酶切位点，突变体中有，可以用酶切的方式检测突变体是否正确。如图10所示，野生型的PCR产物不能被酶切，突变体的可以被切开。
S4、PP_0914生物被摸形成能力检测
将野生型菌株和突变体菌株分别在玻璃试管中培养12小时，PP_0914突变体形成的生物被膜显著多于野生型KT2440，如图11所示，说明利用本发明构建的PP_0914缺失突变体是正确的。
表1本发明所用的引物序列
引物
DNA序列 Sequence(5’-3’)
序列编号
P1
ggaattccatatgcctcgctaacggattcacc
SEQ ID No.3
P2
ggaattccatatgtttcgcatttcgccctat
SEQ ID No.4
P3
ggaattccatatgcatgcatgtcgacggtac
SEQ ID No.5
P4
ggaattccatatgcacaacgtggctttccc
SEQ ID No.6
P5
ccggaattctcagcaccaccgcaagg
SEQ ID No.7
P6
ccgctcgagtgaagccactccgcacc
SEQ ID No.8
P7
cgcggatcccctcgtgaagaaggtgttg
SEQ ID No.9
P8
ccggaattcaagccacgttgtgtctcaa
SEQ ID No.10
P9
tgctctagacttcaaggtcgcggcga
SEQ ID No.11
P10
cgcggatcccgtattcgccgtaccacc
SEQ ID No.12
P11
attgaagcgaatggaaccg
SEQ ID No.13
P12
gctgctggaaagcgaactg
SEQ ID No.14
P13
ttgcacagcagctcaccc
SEQ ID No.15
P14
cccttcgccagtaccagaa
SEQ ID No.16
P15
ccggaattcgcatggcatcattttgcc
SEQ ID No.17
P16
ccgctcgagccctgcggaacctctatt
SEQ ID No.18
P17
ctagtctagattgtcgacgtagtcgatc
SEQ ID No.19
P18
cgcggatcccgggtttcggtgtcctga
SEQ ID No.20
P19
caccatgcccagttccg
SEQ ID No.21
P20
tcgaccacgagcaaatcc
SEQ ID No.22
P21
ctgaagcagtcttgctcgtct
SEQ ID No.23
P22
cctatgtttgttgcgtggttat
SEQ ID No.24
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉博欧特生物科技有限公司
<120> 一种恶臭假单胞菌***载体的构建方法及其应用
<130> 2019-9-23
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3765
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
catatgcctc gctaacggat tcaccgtttt tatcaggctc tgggaggcag aataaatgat 60
catatcgtca attattacct ccacggggag agcctgagca aactggcctc aggcatttga 120
gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt caataaaccg gtaaaccagc aatagacata 180
agcggctatt taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg tcgaatttgc tttcgaattt 240
ctgccattca tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc accaggcgtt taagggcacc 300
aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtcg gcctattggt 360
taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta 420
caatttccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc 480
ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac 540
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgagcgcg cgtaatacga 600
ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgctctagaa ctagtggatc 660
ccccgggctg caggaattcg atatcaagct tatcgatacc gtcgacctcg agggggggcc 720
cggtacccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaattgc gcgcttggcg taatcatggt 780
catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 840
gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 900
tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 960
gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcat gcataaaaac tgttgtaatt 1020
cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc atgatgaacc tgaatcgcca 1080
gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggacgca caccgtggaa 1140
acggatgaag gcacgaaccc agttgacata agcctgttcg gttcgtaaac tgtaatgcaa 1200
gtagcgtatg cgctcacgca actggtccag aaccttgacc gaacgcagcg gtggtaacgg 1260
cgcagtggcg gttttcatgg cttgttatga ctgttttttt gtacagtcta tgcctcgggc 1320
atccaagcag caagcgcgtt acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga gcagcaacga 1380
tgttacgcag cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaggtg 1440
gctcaagtat gggcatcatt cgcacatgta ggctcggccc tgaccaagtc aaatccatgc 1500
gggctgctct tgatcttttc ggtcgtgagt tcggagacgt agccacctac tcccaacatc 1560
agccggactc cgattacctc gggaacttgc tccgtagtaa gacattcatc gcgcttgctg 1620
ccttcgacca agaagcggtt gttggcgctc tcgcggctta cgttctgccc aggtttgagc 1680
agccgcgtag tgagatctat atctatgatc tcgcagtctc cggcgagcac cggaggcagg 1740
gcattgccac cgcgctcatc aatctcctca agcatgaggc caacgcgctt ggtgcttatg 1800
tgatctacgt gcaagcagat tacggtgacg atcccgcagt ggctctctat acaaagttgg 1860
gcatacggga agaagtgatg cactttgata tcgacccaag taccgccacc taacaattcg 1920
ttcaagccga gatcggcttc ccggccgcgg agttgttcgg taaattgtca caacgccgcc 1980
aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgc ccgcgttcct gctggcgctg ggcctgtttc 2040
tggcgctgga cttcccgctg ttccgtcagc agcttttcgc ccacggcctt gatgatcgcg 2100
gcggccttgg cctgcatatc ccgattcaac ggccccaggg cgtccagaac gggcttcagg 2160
cgctcccgaa ggtctcgggc cgtctcttgg gcttgatcgg ccttcttgcg catctcacgc 2220
gctcctgcgg cggcctgtag ggcaggctca tacccctgcc gaaccgcttt tgtcagccgg 2280
tcggccacgg cttccggcgt ctcaacgcgc tttgagattc ccagcttttc ggccaatccc 2340
tgcggtgcat aggcgcgtgg ctcgaccgct tgcgggctga tggtgacgtg gcccactggt 2400
ggccgctcca gggcctcgta gaacgcctga atgcgcgtgt gacgtgcctt gctgccctcg 2460
atgccccgtt gcagccctag atcggccaca gcggccgcaa acgtggtctg gtcgcgggtc 2520
atctgcgctt tgttgccgat gaactccttg gccgacagcc tgccgtcctg cgtcagcggc 2580
accacgaacg cggtcatgtg cgggctggtt tcgtcacggt ggatgctggc cgtcacgatg 2640
cgatccgccc cgtacttgtc cgccagccac ttgtgcgcct tctcgaagaa cgccgcctgc 2700
tgttcttggc tggccgactt ccaccattcc gggctggccg tcatgacgta ctcgaccgcc 2760
aacacagcgt ccttgcgccg cttctctggc agcaactcgc gcagtcggcc catcgcttca 2820
tcggtgctgc tggccgccca gtgctcgttc tctggcgtcc tgctggcgtc agcgttgggc 2880
gtctcgcgct cgcggtaggc gtgcttgaga ctggccgcca cgttgcccat tttcgccagc 2940
ttcttgcatc gcatgatcgc gtatgccgcc atgcctgccc ctcccttttg gtgtccaacc 3000
ggctcgacgg gggcagcgca aggcggtgcc tccggcgggc cactcaatgc ttgagtatac 3060
tcactagact ttgcttcgca aagtcgtgac cgcctacggc ggctgcggcg ccctacgggc 3120
ttgctctccg ggcttcgccc tgcgcggtcg ctgcgctccc ttgccagccc gtggatatgt 3180
ggacgatggc cgcgagcggc caccggctgg ctcgcttcgc tcggcccgtg gacaaccctg 3240
ctggacaagc tgatggacag gctgcgcctg cccacgagct tgaccacagg gattgcccac 3300
cggctaccca gccttcgacc acatacccac cggctccaac tgcgcggcct gcggccttgc 3360
cccatcaatt tttttaattt tctctgggga aaagcctccg gcctgcggcc tgcgcgcttc 3420
gcttgccggt tggacaccaa gtggaaggcg ggtcaaggct cgcgcagcga ccgcgcagcg 3480
gcttggcctt gacgcgcctg gaacgaccca agcctatgcg agtgggggca gtcgaaggcg 3540
aagcccgccc gcctgccccc cgagcctcac ggcggcgagt gcgggggttc caagggggca 3600
gcgccacctt gggcaaggcc gaaggccgcg cagtcgatca acaagccccg gaggggccac 3660
tttttgccgg agggggagcc gcgccgaagg cgtgggggaa ccccgcaggg gtgcccttct 3720
ttgggcacca aagaactaga tatagggcga aatgcgaaac atatg 3765
<210> 2
<211> 499
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
catatgcatg catgtcgacg gtaccccccc atgtcagccg ttaagtgttc ctgtgtcact 60
caaaattgct ttgagaggct ctaagggctt ctcagtgcgt tacatccctg gcttgttgtc 120
cacaaccgtt aaaccttaaa agctttaaaa gccttatata ttcttttttt tcttataaaa 180
cttaaaacct tagaggctat ttaagttgct gatttatatt aattttattg ttcaaacatg 240
agagcttagt acgtgaaaca tgagagctta gtacgttagc catgagagct tagtacgtta 300
gccatgaggg tttagttcgt taaacatgag agcttagtac gttaaacatg agagcttagt 360
acgtgaaaca tgagagctta gtacgtacta tcaacaggtt gaactgctga tcttcagatc 420
ctctacgccg gacgcatcgt ggccggggtt cgaaatcgat gagctcgggg ggggggggga 480
aagccacgtt gtgcatatg 499
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ggaattccat atgcctcgct aacggattca cc 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ggaattccat atgtttcgca tttcgcccta t 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ggaattccat atgcatgcat gtcgacggta c 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
ggaattccat atgcacaacg tggctttccc 30
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
ccggaattct cagcaccacc gcaagg 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
ccgctcgagt gaagccactc cgcacc 26
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
cgcggatccc ctcgtgaaga aggtgttg 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ccggaattca agccacgttg tgtctcaa 28
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
tgctctagac ttcaaggtcg cggcga 26
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
cgcggatccc gtattcgccg taccacc 27
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
attgaagcga atggaaccg 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
gctgctggaa agcgaactg 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
ttgcacagca gctcaccc 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
cccttcgcca gtaccagaa 19
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
ccggaattcg catggcatca ttttgcc 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
ccgctcgagc cctgcggaac ctctatt 27
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
ctagtctaga ttgtcgacgt agtcgatc 28
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
cgcggatccc gggtttcggt gtcctga 27
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
caccatgccc agttccg 17
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
tcgaccacga gcaaatcc 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
ctgaagcagt cttgctcgtc t 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
cctatgtttg ttgcgtggtt at 22
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