阅读说明：本技术 一种利用σ70非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法 (Method for realizing stable high yield of isobutyraldehyde by using sigma 70 independent stress-resistant promoter ) 是由 霍毅欣 马晓焉 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：一种利用σ~(70)非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法,为最大化细胞工厂生产异丁醛的产量并使产率接近理论值,异丁醛合成途径必须能够持续高效地表达,以便最小化菌体生物量的增长及副产物的生成对资源的消耗。解除合成途径对σ~(70)的唯一性依赖,增强其对σ~(38)的兼容性是实现生产途径持续表达的关键。以σ~(70)非依赖型抗胁迫启动子gadA替代常规的σ~(70)型启动子驱动异丁醛的合成,实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达。(In order to maximize the yield of isobutyraldehyde produced by a cell factory and enable the yield to be close to a theoretical value, an isobutyraldehyde synthesis pathway must be capable of being continuously and efficiently expressed so as to minimize the growth of biomass of thalli and the consumption of resources caused by the generation of byproducts, the unique dependence of the synthesis pathway on sigma 70 is removed, the key for realizing the continuous expression of the production pathway is to enhance the compatibility of the synthesis pathway on sigma 38 , and the sigma 70 independent stress-resistant promoter gadA replaces a conventional sigma 70 promoter to drive the synthesis of isobutyraldehyde, so that the stable expression of the isobutyraldehyde synthesis pathway under the conditions of a stable period and acid stress is realized.)

一种利用σ70非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的 方法

技术领域

本发明涉及一种抗胁迫启动子高产异丁醛的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

异丁醛工业上主要是加氢生产异丁醇，异丁醇是一种新型生物燃料，具有高能量密度、低吸湿性等优势；此外，异丁醛也用作氨基酸、维生素等药物的中间体；用于合成纤维素酯、香精、香料等；还可用于制造橡胶硫化促进剂和防老剂、异丁酸等。

为最大化细胞工厂生产异丁醛的产量并使产率接近理论值，异丁醛合成途径必须能够持续高效地表达，以便最小化菌体生物量的增长及副产物的生成对资源的消耗。理想状况下，菌体只进行一定程度的生长繁殖，在此期间合成异丁醛生产所需的前体物质及辅因子，当细胞数量达到生产需求时生长停止，合成途径开始高效表达。如果消除了生长对资源的竞争，途径酶可将前期累积的全部生产资源直接转化为目标化合物，此时细胞工厂的生产能力达到顶峰。然而，这一高产阶段通常难以维持。这是因为合成途径的表达一般依赖于看家型的σ⁷⁰因子，这类σ因子主导必需基因的转录，在对数生长期效用最强。当细胞进入稳定期后，胞内与胞外环境胁迫随之出现，此时胁迫响应σ³⁸因子大量生成，与σ⁷⁰竞争数量有限的RNAP 核心酶。且稳定期DNA超螺旋程度下降，谷氨酸盐类抗胁迫物质累积等胞内环境的变化也更有利于σ³⁸与核心酶的结合。因此，途径基因的转录通常与生长相偶联，一旦细胞生长停滞，合成途径的表达也随即下降，胞内资源开始大量分配给胁迫抵御等生存维持活动。因此，解除合成途径对σ⁷⁰的唯一性依赖，增强其对σ³⁸的兼容性是实现生产途径持续表达的关键。

以σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gadA替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达。机理研究发现gadA启动子不受菌体生长期转变时胞内σ因子更替的影响，可被σ⁷⁰及σ³⁸型RNAP分别转录，表现出对低pH、谷氨酸盐累积、DNA超螺旋松弛等胁迫条件的抵御能力，能够在几乎整个细胞生长周期及胁迫条件下发挥转录活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实现异丁醛稳定高产的方法，利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gadA替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达，最终通过摇瓶发酵实验确定菌株最终的异丁醛产量，为实现异丁醛稳定高产提供新的方法。

按照本发明提供的技术方案，一种利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法，采用

以下方法步骤：

1、以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，扩增包括上游完整非编码区(–1至–183)的gadA启动子 P_gadA183

2、异丁醛合成途径由alsS-ilvC/D和kivd两个操纵子组成，分别在pSA69和pSA65两个质粒上，通过Gibson assembly将PgadA183***至alsS-ilvC/D操纵子的RBS上游，替换原始启动子PLlacO1，得到质粒pMX1。

3、以类似2、3方法将pSA65质粒上的PLlacO1替换为PgadA183，得到质粒pMX2。

4、以JCL260菌株作为异丁醛生产的底盘宿主，将pMX1、pMX2转入JCL260感受态细胞中，涂于平板上培养。

5、将步骤4中转化得到的单菌落转接到少量培养基中培养得到种子液。

6、将种子液接入发酵培养基中进行发酵验证。

油醇可以从水相中高效萃取异丁醛，培养前在发酵瓶中加入同发酵液体积相同的油醇，监测产量时分别从油相与水相等体积取样。

异丁醛发酵所用M9培养基配方为：6.0g/l Na₂HPO₄，3.0g/l KH₂PO₄，1.0g/l NH₄Cl，0.5g/l NaCl， 1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/l vitamin B1，8.5％葡萄糖，1％酵母提取物，调节pH至7.0。另加入 100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素。

附图说明

图1：gadA启动子是一种生长期独立型抗胁迫启动子，可以在各类生理条件下驱动生物燃料合成途径的高效表达；

图2：葡萄糖添加量，初始pH，发酵液体积，油醇萃取对gadA启动子驱动下异丁醛生产的产量 (a)，葡萄糖消耗量(b)，OD₆₀₀(c)及产率(d)的影响。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、一种利用gadA启动子实现异丁醛稳定高产的方法

异丁醛合成途径由alsS-ilvC/D和kivd两个操纵子组成，分别装载于pSA69和pSA65两个骨架上。以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，扩增包括上游完整非编码区(–1至–183)的gadA启动子PgadA183，通过Gibson assembly将其***至alsS-ilvC/D操纵子的RBS上游，替换原始启动子PLlacO1，得到质粒 pMX1。以类似方法将pSA65质粒上的PLlacO1替换为PgadA60，得到质粒pMX2。

基因PCR体系为：FastPfu Fly Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物2μL，FastPfu Fly DNA Polymerase 1μL,模板1μL，蒸馏水32μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃预变性5分钟 (1个循环)；95℃变性5分钟，55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。连接体系：1.5μL PCR扩增产物、1μL pSA69载体片段，7.5μL Gibson Master Mix(购自 NEW ENGLAND BioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50μL DH5α感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激30秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μL SOC 培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。因为pSA69骨架含有氨苄青霉素抗性基因，取200μL 菌液涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养。待LB平板上长出单菌落后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明pMX1质粒构建正确，用类似方法构建pMX2 质粒。

以前期构建的JCL260菌株作为异丁醛生产的底盘宿主，将pMX1、pMX2两质粒化转JCL260感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激90秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃、200rpm 摇床中震荡培养1小时。因为pMX1、pMX2含有氨苄青霉素、卡那青霉素抗性基因，取200μL菌液涂于含有氨苄青霉素、卡那青霉素的LB平板上，过夜培养。

将单菌落接种至5ml LB培养基，于37℃，250rpm下培养12h，得到种子液。取400μl接种至20 ml发酵培养基中(2％v/v)，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，于250ml密闭三角瓶条件，30℃，250 rpm下发酵。

采用可以从水相中高效萃取高级醇的油醇进行油提法发酵。油醇用量与发酵液体积相同，在培养前随发酵液一同加入发酵瓶，监测产量时从油相与水相等体积取样。补料连续发酵时，每次取样后补充等体积的新鲜油醇与M9培养基。

样品于4000×g离心5min，吸取上清液，采用气相色谱法检测生成的异丁醛。所用色谱仪为Agilent 6890，配备火焰离子化检测器，色谱柱为安捷伦DB-FFAP毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)，氮气为载气。采用分流进样法，吸样量0.2μl，分流比50:1。对于水相中的异丁醇，升温程序为：80℃3min， 115℃/min升温至230℃，维持1min，120℃/min升温至235℃，维持2min。对于油相中的异丁醇，升温程序为：90℃0.5min，20℃/min升温至110℃，维持0.5min,120℃/min升温至235℃，维持2min。进样口与检测器温度分别为250℃和280℃。异丁醛标样浓度为1g/l，并以1g/l的正戊醇为内标。

异丁醛发酵所用M9培养基配方为：6.0g/l Na₂HPO₄，3.0g/l KH₂PO₄，1.0g/l NH₄Cl，0.5g/l NaCl， 1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/l vitamin B1，8.5％葡萄糖，1％酵母提取物，调节pH至7.0。另加入100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素。