一种从甲酸到甲醛和/或甲醇的生物合成方法
阅读说明：本技术 一种从甲酸到甲醛和/或甲醇的生物合成方法 (Biosynthesis method from formic acid to formaldehyde and/or methanol ) 是由 马延和 蔡韬 孙红兵 吕娟博 王钦宏 于 2020-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从甲酸合成甲醛和/或甲醇的新途径,通过不同化学反应的组合,实现了甲酸到甲醛和/或甲醇的高效合成。本发明的新途径需要的能量更少(每生产1摩尔甲醛需要消耗1摩尔ATP到ADP),且效率更高,1小时即可生产2mM甲醛或4.83mM甲醇。本发明的新途径可通过与已有途径整合,实现利用二氧化碳、生物质、天然气等原料合成复杂化合物和液体燃料的目的。(The invention discloses a new way for synthesizing formaldehyde and/or methanol from formic acid, which realizes the high-efficiency synthesis of the formic acid to the formaldehyde and/or the methanol by the combination of different chemical reactions. The new route of the invention requires less energy (1 mole ATP to ADP is consumed per 1 mole formaldehyde produced) and is more efficient, producing 2mM formaldehyde or 4.83mM methanol in 1 hour. The new way of the invention can be integrated with the existing way, and the purpose of synthesizing complex compounds and liquid fuels by utilizing raw materials such as carbon dioxide, biomass, natural gas and the like is realized.)
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种从甲酸生产甲醛和/或甲醇的生物合成方法。
背景技术
甲酸、甲醛、甲醇是二氧化碳不同程度还原的产物，它们是重要的一碳原料，可以被用来合成多种化合物。甲醛和甲醇的化学活性比甲酸更高，更有利于后续的转化和应用。
目前已经报道的方法主要是通过自然途径中甲醛脱氢酶或甲醇脱氢酶来实现甲酸到甲醛或甲醇的转化。但是这种方法由于自由能不利，需要大量的还原力才能获得少量的甲醛或醇积累。
除天然途径外，由乙酰辅酶A合成酶和乙醛脱氢酶组成的人工途径实现了甲酸还原为甲醛，但需要消耗较多的能量(每生成1摩尔甲醛需要消耗1摩尔ATP到AMP)。
另外，利用乙酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的人工途径虽然消耗能量更少(每生产1摩尔甲醛需要消耗1摩尔ATP到ADP)，但是甲醛产量较低，只有0.0163mM。
因此，现有技术中需要一种耗能少、产量高的从甲酸到甲醛和/或甲醇的生物合成方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，一方面，本发明提供一种从甲酸到甲醛的生物合成方法，包括以下步骤：
步骤(1)：甲酸或其盐为原料，在酶的催化下，转化为甲酰磷酸；
步骤(2)：步骤(1)得到的甲酰磷酸在酶的催化下转化为甲酰辅酶A；以及
步骤(3)：步骤(2)得到的甲酰辅酶A在酶的催化下转化为甲醛。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中所使用的酶为具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶。
根据本发明的实施方案，所述甲酸盐为甲酸的碱金属盐或碱土金属盐，例如甲酸钠、甲酸钾、甲酸锂、甲酸镁、甲酸钙等。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中所使用的酶为具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中所使用的酶为具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶。
根据本发明的实施方案，步骤(1)至步骤(3)可以分步进行，也可以其中任何相邻的两个或三个步骤同步进行。
根据本发明的实施方案，步骤(1)至步骤(3)同步进行，例如反应体系包含底物甲酸或甲酸盐、具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶，具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶和具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶。
根据本发明的实施方案，所述反应体系还包含NaCl、Mg2+、Zn2+、ATP、NADH、CoA、巯基乙醇等。
根据本发明的实施方案，所述反应体系pH为6.5-8.5，例如7-8，例如以Hepes缓冲液提供所述pH环境。
根据本发明的实施方案，其中步骤(3)的反应体系或者步骤(1)至(3)同步进行的反应体系中还可任选地包含用于辅助NADH再生的辅助酶，例如甲酸脱氢酶(FDH)。
另一方面，本发明还提供一种从甲酸到甲醇的生物合成方法，包括以下步骤：
步骤(1)：甲酸或其盐为原料，在酶的催化下，转化为甲酰磷酸；
步骤(2)：步骤(1)得到的甲酰磷酸在酶的催化下转化为甲酰辅酶A；
步骤(3)：步骤(2)得到的甲酰辅酶A在酶的催化下转化为甲醛；以及
步骤(4)：步骤(3)得到的甲醛在酶的催化下转化为甲醇。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中所使用的酶为具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶。
根据本发明的实施方案，所述甲酸盐为甲酸的碱金属盐或碱土金属盐，例如甲酸钠、甲酸钾、甲酸锂、甲酸镁、甲酸钙等。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中所使用的酶为具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中所使用的酶为具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶。
根据本发明的实施方案，步骤(4)中所使用的酶为具有催化甲醛转化为甲醇功能的酶。
根据本发明的实施方案，步骤(1)至步骤(4)可以分步进行，也可以其中任何相邻的两个、三个或四个步骤同步进行。
根据本发明的实施方案，步骤(1)至步骤(4)同步进行，反应体系包含底物甲酸或甲酸盐、具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶，具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶、具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶和具有催化甲醛转化为甲醇功能的酶。
根据本发明的实施方案，所述反应体系还包含NaCl、Mg2+、Zn2+、ATP、NADH、CoA、巯基乙醇等。
根据本发明的实施方案，所述反应体系pH为6.5-8.5，例如7-8，例如以Hepes缓冲液提供所述pH环境。
根据本发明的实施方案，其中步骤(3)或步骤(4)的反应体系或者步骤(1)至(4)同步进行的反应体系中还可任选地包含用于辅助NADH再生的辅助酶，例如甲酸脱氢酶(FDH)。
在本发明的上下文中，当采用“具有催化A物质转化为B物质功能的酶”这样的表述时，是指所述酶可以催化A物质转化为B物质的反应，所述反应可以为一步反应也可以为多步反应，所述酶可以是由A物质生成B物质中任一步反应所需的酶，因此，所述酶可以是催化一步反应的单一的酶，也可以是催化多步反应中的一步或多步的酶的组合。具有所述催化功能的酶的氨基酸序列和来源不受特别限制，只要它们能够实现所述催化功能即可。具体而言，“具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶”是指可以催化甲酸磷酸化的酶，包括但不限于乙酸激酶(ACKA，EC 2.7.2.1)和甲酸激酶(EC 2.7.2.6)，这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌、甲烷八叠球菌等不同的物种。“具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶”是指可以催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A的反应的酶，包括但不限于磷酸乙酰基转移酶(PTA，EC 2.3.1.8)，这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、梭菌、热袍菌、甲烷八叠球菌等不同的物种。“具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶”是指可以催化甲酰辅酶A转化为甲醛的反应的酶，包括但不限于乙醛脱氢酶(ACDH，EC 1.2.1.10)，这些酶可以来源于但不局限于李斯特菌、假单胞菌、不动杆菌、贾第鞭毛虫属等不同的物种。“具有催化甲醛转化为甲醇功能的酶”是指可以催化甲醛还原为甲醇的反应的酶，包括但不限于醇脱氢酶(ADH，EC 1.1.1.1；EC 1.1.1.2；EC 1.1.1.71；EC 1.1.2.8)、甲醇脱氢酶(EC1.1.1.244；EC 1.1.2.7；EC 1.1.2.B2)、L-苏氨酸-3-脱氢酶(EC 1.1.1.103)、环己醇脱氢酶(EC 1.1.1.245)和正丁醇脱氢酶(EC 1.1.2.9)，这些酶可以来源于但不局限于毕赤酵母、假丝酵母、链霉菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、红球菌、陶厄氏菌等不同的物种。
在本发明的上下文中所使用的酶可以是粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式。所述粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞可商购获得或者按照文献中已知的方法或者本领域的常规方法制备；例如所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶；所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶，得到的重组细胞即为所述全细胞。
在本发明的上下文中，所述“分步进行”是指前一步反应结束后，进行或不进行产物的纯化，再投入催化后一步反应的酶或所需组分进行后一步反应；所述“同步进行”是指在反应开始时，将催化所涉及的各个反应的酶与底物一起投入反应器中进行反应。所述“相邻的”步骤，是指前一步骤的产物可用作后一步骤的反应物，则这两个步骤可称之为“相邻的”。
有益效果
本发明的甲酸或其盐合成甲醛和/或甲醇的新途径，通过不同化学反应的组合，实现了甲酸或其盐到甲醛和/或甲醇的高效合成。本发明的新途径需要的能量更少(每生产1摩尔甲醛需要消耗1摩尔ATP到ADP)，且效率更高，1小时即可生产2mM甲醛或4.83mM甲醇。本发明的新途径可通过与已有途径整合，实现利用二氧化碳、生物质、天然气等原料合成复杂化合物和液体燃料的目的。
附图说明
图1示出了本发明的从甲酸合成甲醛的新途径与天然途径和乙酰辅酶A合成酶途径的甲醛产量的比较。
图2示出了本发明的从甲酸合成甲醇的新途径的甲醇产量。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的从甲酸合成甲醛和甲醇的方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1从甲酸合成甲醛的新途径
从甲酸合成甲醛的新途径如下所示：
首先，选择可以催化途径中各化学反应的催化剂(即酶)(见表1)，但并不限定于表1列出的催化剂。然后，将不同的催化剂组合，建立相应的反应体系，反应一段时间后，检测甲醛的产量。
实施例1中所用酶的信息在表1中列出，乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、甲酸脱氢酶通过PCR或基因合成的方式获得，并通过Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNAMultimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法分别克隆至pET20b、pET21b和pET28a载体(Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET28a-ACKA、pET28a-PTA、pET21b-ACDH、pET20b-FDH。这四个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并进行蛋白的表达与纯化。
表1甲酸到甲醛新途径化学反应所用的催化剂
甲醛产量按照以下方法检测：在200μL水中，加入50μL适当稀释的待测溶液，再加入25μL乙酰丙酮溶液(100ml乙酰丙酮溶液含有0.5mL乙酰丙酮，50g乙酸铵和6mL冰乙酸)，在60℃，反应15min后，离心取200μL上清液检测OD414值，并根据甲醛标准曲线计算新途径产生甲醛的量。
此外，还测试了天然途径和已经公开的乙酰辅酶A合成酶人工途径转化甲酸合成甲醛的能力，分别作为对比例1-1和对比例1-2。
实施例1的新途径1-2-3：反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM，NaCl 100mM，Mg2+5mM，Zn2+ 10μM,50mM甲酸钠，10mM ATP，0.5mM NADH，0.1mM CoA，2mM巯基乙醇，0.24mg/mLACKA，1.2mg/mL PTA，0.2mg/mL ACDH，0.024mg/mL FDH(甲酸脱氢酶，辅助NADH再生)。反应1小时，甲醛产量为2mM。
对比例1-1的天然途径：反应体系是反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM，NaCl100mM，Mg2+ 5mM，Zn2+ 10μM，FADH 4mg/mL，NADH 100mM，甲酸钠250mM。反应3小时，甲醛产量为0.1mM。
对比例1-2的乙酰辅酶A合成酶途径：反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM，NaCl100mM，Mg2+ 5mM，Zn2+ 10μM，ATP 2mM，NAD+ 1.5mM，CoA 0.1mM，ACS 3.7mg/mL，ACDH 0.2mg/mL，FDH 0.024mg/mL(甲酸脱氢酶，辅助酶，用于再生NADH)，PPase 0.1mg/mL(无机焦磷酸酶，辅助酶)，甲酸钠50mM。反应1小时，甲醛产量为0.6mM。
实施例1的新途径与对比例1-1和对比例1-2的合成途径的甲醛产量的比较如图1所示。从图1中可以看出，与天然途径和乙酰辅酶A合成酶途径相比，本发明的从甲酸合成甲醛的新途径，在较短的时间内，获得了明显高的甲醛产量。
实施例2从甲酸合成甲醇的新途径
从甲酸合成甲醇的新途径如下所示：
首先，选择可以催化途径中各化学反应的催化剂(见表2)，但并不限定于表2列出的催化剂。然后，将不同的催化剂组合，建立相应的反应体系，反应一段时间后，检测甲醇的产量。
实施例2中所用酶的信息在表2中列出，醇脱氢酶购买自Sigma公司(https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland.html)。其余酶的构建和表达方式同实施例1。
表2甲酸到甲醇新途径化学反应所用的催化剂
甲醇产量按照以下方法检测：采用Agilent 7890A色谱仪(含FID检测器)，载气为氮气，压力为18kPa(0.4mL/min)，柱子为HP-FFAP(25m×0.32mm×0.5μm)，初始柱温为75℃，10min，注射器及检测器的温度分别为150℃以及300℃，进样量为1μL/针，根据标准曲线计算新途径生产甲醇的量。
反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM，NaCl 100mM，Mg2+ 5mM，Zn2+ 10μM,100mM甲酸钠，10mM ATP，0.5mM NADH，0.1mM CoA，2mM巯基乙醇，0.24mg/mL ACKA，1.2mg/mL PTA，0.2mg/mL ACDH，0.024mg/mL FDH(甲酸脱氢酶，辅助NADH再生)，0.15kU/mLADH；反应1小时，甲醇产量为4.83mM。甲醇的产量如图2所示。
以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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