阅读说明：本技术 一种从海葡萄中酶法制备活性β-1,3-木寡糖的方法 (Method for preparing active beta-1, 3-xylo-oligosaccharide from sea grape by enzyme method ) 是由 张光亚 刘婷 葛慧华 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从海葡萄中酶法制备活性β-1,3-木寡糖的方法,括如下步骤：(1)从海葡萄中提取β-1,3-木聚糖；(2)获得重组β-1,3-木聚糖酶；(3)以上述重组β-1,3-木聚糖酶水解步骤(1)所得的物料,以获得所述活性β-1,3-木寡糖。现有技术中的木聚糖都是β-1,4-木聚糖及β-1,4-木寡糖(低聚木糖),而本发明从来源于海葡萄的β-1,3-木聚糖中利用酶法制备β-1,3-木寡糖,填补了国内空白,同时经过测验,本发明制得的β-1,3-木寡糖与β-1,4-木寡糖相比,具有更好的活性。(The invention discloses a method for preparing active beta-1, 3-xylo-oligosaccharide from sea grapes by an enzyme method, which comprises the following steps: (1) extracting beta-1, 3-xylan from the vitis amurensis; (2) obtaining recombinant beta-1, 3-xylanase; (3) hydrolyzing the material obtained in the step (1) by the recombinant beta-1, 3-xylanase to obtain the active beta-1, 3-xylo-oligosaccharide. In the prior art, the xylan is beta-1, 4-xylan and beta-1, 4-xylooligosaccharide (xylooligosaccharide), while the beta-1, 3-xylooligosaccharide is prepared from beta-1, 3-xylan derived from Vitis amurensis through an enzyme method, so that the domestic blank is filled, and meanwhile, through tests, the prepared beta-1, 3-xylooligosaccharide has better activity compared with the beta-1, 4-xylooligosaccharide.)

一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法

技术领域

本发明属于木寡糖制备技术领域，具体涉及一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法。

背景技术

自然界中植物藻类有一种主要的组成部分，半纤维素，半纤维素是第二大丰富的多聚糖，仅次于纤维素，含量约占20％～30％，其主要成分是1，4-木聚糖。可以用酸性水解和酶水解两种方法水解木聚糖获得低聚木糖或木糖，且均可提高木聚糖的利用率和经济价值。酸性水解需在高温高压下进行，产品回收率和仪器成本较高，同时，由于该方法在加工过程中会产生副产物，从而减少木聚糖的水解转化率。而酶解法具有特异性高，加工条件温和，产品易于回收的特点。除用于生产1，4-低聚木糖外，该方法也泛用于食品和化妆品工业、制药生物技术、农业、环境保护和污水处理。需要指出的是，目前常说的木聚糖或者低聚木糖都是指1，4-木聚糖或者1，4-木寡糖。而某些海藻中含有特殊1，3-键连接的1，3-木聚糖，和现有的1，4-木聚糖在结构和活性上存在明显差异，是不同于1，4-木聚糖的另外一种物质。从中获得的1，3-低聚糖具有许多生物活性，其活性受分子量(MW)和化学键的影响，在医学方面例如抗癌、抗病毒以及抗氧化等都有一定的效果。海藻多糖是一种较易提取的生物成分，在分子结构上存在很大的差异。近年来，藻类多糖降解的寡糖已被应用于治疗慢性疾病，一些报道揭示了β-1，3-木聚糖的抗癌、抗病毒和抗炎活性，例如诱导MCF-7人乳腺癌细胞凋亡。

β-1，3-木聚糖是由β-1，3键连接D-木糖组成的，是某些海藻细胞壁特有的多糖组分，主要存在于如Caulerpa、Bryopans、Bangia、紫菜和Palmaria spp等大型藻类中。β-1，3-木聚糖分子大量存在藻类细胞的细胞壁中，主要以右手三股螺旋结构结合成六角晶体微纤维的形式存在，这些微纤维随机的分布在海藻细胞的周围，具有重要的保护作用。大多数以β-1，3-木聚糖作为细胞壁结构主要组成成分的藻类都与人类活动密切相关：据已有的研究可知，管藻目绿藻中含有β-1，3-木聚糖，其中有两种蕨藻较为常见，一种是目前已经可以人工养殖的可使用的长颈蕨海葡萄，另一种是高度入侵物种杉叶蕨藻，所以通常选择长颈蕨海葡萄作为提取β-1，3-木聚糖的实验原料。

但现有技术对于木寡糖(低聚木糖)的制备一般都是β-1，4-木聚糖的制备，例如CN108359696A公开的一种低聚木糖的制备方法，通过甘蔗渣发酵液生成2-10个木糖分子以(β-1-4)糖苷键连接而成的低聚糖；再如CN104762343A公开的一种酶法制备低聚木糖的方法，是由内切葡聚糖酶EG I基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)中表达，得到的内切葡聚糖酶EG I用于降解木聚糖制备低聚木糖，该低聚木糖同样是由2～10个木糖分子以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚合度糖类，其有效成分为β-1，4木二糖、β-1，4木三糖、β-1，4木四糖、β-1，4木五糖等。而现有技术对于β-1，3-木聚糖的制备和研究尚不够全面：国内尚没有1，3-低聚木糖的制备方法，也无法从市面上买到1，3-低聚木糖，国外的针对1，3-低聚木糖的制备不仅方法复杂而且效果不佳，而且也没有商品化的1，3-低聚木糖出售。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法。

本发明的技术方案如下：

一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法，包括如下步骤：

(1)从海葡萄中提取β-1，3-木聚糖；

(2)获得重组β-1，3-木聚糖酶；

(3)以上述重组β-1，3-木聚糖酶水解步骤(1)所得的物料，以获得所述活性β-1，3-木寡糖，具体包括：

a、将步骤(1)所得的物料加入到pH为6.9-7.2的Tris-HCl缓冲液，制成浓度为0.8-1.2wt％的β-1，3-木聚糖溶液；

b、将上述β-1，3-木聚糖溶液与适量上述重组β-1，3-木聚糖酶混合后，于44-46℃反应20-30h，接着置于95-100℃加热4-6min，使上述重组β-1，3-木聚糖酶失活；

c、将步骤b所得的物料于11000-13000rpm离心4-6min，所得上清液即为所述活性β-1，3-木寡糖。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)包括：

a、将海葡萄粉与适量NaOH溶液混合，边搅拌边加热并充分煮沸25-35min；

b、将步骤a所得物料以3500-4500rpm离心15-25min，将所得第一沉淀用蒸馏水充分洗涤；

c、在步骤b所得的物料中加入适量H₂SO₄溶液，以3500-4500rpm离心15-25min，获得第二沉淀；

d、在上述第二沉淀中加入适量NaOH溶液，冰浴条件下搅拌提糖1.5-2h，然后将所得物料进行离心，得上清液；

e、将该上清液与无水乙醇以1∶3-5的体积比混合，于3-5℃静置10-12h，经固液分离获得第三沉淀；

f、向上述第三沉淀中加入适量高氯酸钠溶液，边搅拌边脱色1.5-2.5h，再用蒸馏水充分洗涤，得第四沉淀；

g、将上述第四沉淀于9500-12000rpm离心12-20min，获得第五沉淀；

h、将上述第五沉淀用乙酸溶液充分吹洗，再用蒸馏水充分洗涤，获得β-1，3-木聚糖。

所述步骤(1)的步骤a中的海葡萄粉为经过预处理的海葡萄粉，该预处理的过程包括：

a1、将海葡萄粉与纯净水混合后，于亚临界水状态下萃取5min～20min，冷却至室温后离心收集上清液，然后冷冻干燥。

更进一步优选的，所述预处理的过程还包括：

a2、在室温下将蒸馏水13-14重量份、盐酸0.1-0.2重量份、葡萄糖4-5重量份、无水乙醇9-12重量份和正硅酸乙酯50-60重量份依次加入到反应容器中，迅速搅拌4-6min，液体依次经历透明-混浊-透明状变化，用室温水冷却降温，充分去除乙醇，以形成预水解凝胶；

a3、向预水解凝胶中加入16-17重量份的所述冷冻干燥后的物料，并用碱调节pH至5.4-5.6，低速搅拌25-35min后，于3-5℃静置45-50h，获得湿胶；

a4、将上述湿胶研磨粉碎，用蒸馏水充分洗涤以去除其中的葡萄糖，再经过滤、干燥和研磨粉碎过筛，即成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：从海葡萄中提取β-1，3-木聚糖，取其中适量β-1，3-木聚糖制成羟基醇β-1，3-木聚糖，再与剩下的β-1，3-木聚糖混合。

进一步优选的，所述羟基醇β-1，3-木聚糖占步骤(1)所得的物料的5-10wt％。

更进一步优选的，所述羟基醇β-1，3-木聚糖的制备方法包括：

I、将β-1，3-木聚糖溶解于NaOH溶液中，再加入适量二氯乙醇，冰浴搅拌0.8-1.5h，再于室温下搅拌20-25h；

II、在步骤I所得的物料中加入冰醋酸，于冰浴下中和，然后进行透析；

III、将步骤III所得的物料加热搅拌浓缩，再经冷冻干燥，即得所述羟基醇β-1，3-木聚糖。

本发明的有益效果是：

1、现有技术中的木聚糖都是β-1，4-木聚糖及β-1，4-木寡糖(低聚木糖)，而本发明从来源于海葡萄的β-1，3-木聚糖中利用酶法制备β-1，3-木寡糖，填补了国内空白，同时经过测验，本发明制得的β-1，3-木寡糖与β-1，4-木寡糖相比，具有更好的活性。

2、本发明采用海葡萄来产生β-1，3-木聚糖，并采用对β-1，3-木聚糖添加二羟基醇基团以增加其水溶性而获得的酶反应底物，可使后续β-1，3低聚木糖的制备的得率更高。

3、本发明通过改进原有的β-1，3木聚糖的制备工艺，使其通过碱性-酸性-碱性-酸性-酸性溶液进行依次处理，使制得的β-1，3木聚糖更加纯净且得率更高。

4、本发明对海葡萄粉进行亚临界水预处理以及分散处理的步骤，不仅达到简化工艺流程的目的，而且进一步提高了β-1，3-木聚糖的得率。

5、本发明通过选用海葡萄粉，并对海葡萄粉进行亚临界水预处理以及分散处理，处理后的海葡萄粉可大大提高不溶性底物的反应速度，可达到简化工艺流程的目的，且采用特定的β-1，3-木聚糖酶为催化剂，酶解β-1，3木聚糖来制备活性β-1，3木寡糖，可实现制备的活性β-1，3木寡糖中起主要作用的活性物质木二糖和木三糖的含量最优比，大大提高了抗氧化活性。

附图说明

图1为本发明实施例1中活性β-1，3-木寡糖，β-1，4低聚木糖以及标准木二糖标准溶液进行HPLC定性定量分析的结果示意图，其中，图1a为β-1，3木聚糖标准样品出峰时间色谱图，图1b为β-1，4木聚糖标准样品出峰时间色谱图。

图2为本发明实施例1中活性β-1，3-木寡糖、β-1，4低聚木糖及Vc对DPPH·的清除效果图。

图3为本发明实施例1中活性β-1，3-木寡糖、β-1，4低聚木糖及Vc对DPPH·的清除效果图。

图4为本发明实施例1中活性β-1，3-木寡糖、β-1，4低聚木糖及Vc对OH·的清除效果图。

图5为本发明实施例1中活性β-1，3-木寡糖、β-1，4低聚木糖及Vc对OH·的清除效果图。

图6为本发明实施例1中活性β-1，3-木寡糖、β-1，4低聚木糖及Vc对超氧阴离子的清除效果图。

图7为本发明实施例1中活性β-1，3-木寡糖、β-1，4木聚糖及Vc的还原能力的对比图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法，包括如下步骤：

(1)从海葡萄中提取β-1，3-木聚糖，取其中适量β-1，3-木聚糖制成羟基醇β-1，3-木聚糖，再与剩下的β-1，3-木聚糖混合，羟基醇β-1，3-木聚糖占步骤(1)所得的物料的10wt％；

上述β-1，3-木聚糖的提取过程包括：

a、将5g经预处理后的海葡萄粉与250mL 0.3M NaOH溶液混合，边搅拌边加热并充分煮沸30min；

b、将步骤a所得物料以4000rpm离心20min，将所得第一沉淀用蒸馏水充分洗涤两遍；

c、在步骤b所得的物料中加入250mL 0.25M H₂SO₄溶液，以4000rpm离心20min，获得第二沉淀；

d、在上述第二沉淀中加入200mL 2.5M NaOH溶液，冰浴条件下磁力搅拌提糖1.5h，然后将所得物料进行离心，得上清液；

e、将该上清液与无水乙醇以1∶4的体积比混合，于4℃静置10-12h，经固液分离获得第三沉淀；

f、向上述第三沉淀中加入1％高氯酸钠溶液，边磁力搅拌边脱色2h，再用蒸馏水充分洗涤三遍，得第四沉淀；

g、将上述第四沉淀于10000rpm离心15min，获得第五沉淀；

h、将上述第五沉淀用5.7M乙酸溶液充分吹洗，再用蒸馏水充分洗涤两遍，获得β-1，3-木聚糖；

上述步骤a中的预处理包括如下步骤：

a1、将海葡萄粉与纯净水混合后，于亚临界水状态下萃取5min～20min，冷却至室温后离心收集上清液，然后冷冻干燥；

a2、在室温下将蒸馏水13.75wt％、盐酸0.15wt％、葡萄糖4.1wt％、无水乙醇10wt％、正硅酸乙酯55wt％份依次加入到反应容器中，迅速搅拌5min，液体依次经历透明-混浊-透明状变化，用室温水冷却降温，充分去除乙醇，以形成预水解凝胶；

a3、向预水解凝胶中加入17wt％的所述冷冻干燥后的物料，并用碱调节pH至5.5，低速搅拌30min后，于3-5℃静置48h，获得湿胶；

a4、将上述湿胶研磨粉碎，用蒸馏水充分洗涤2遍以去除其中的葡萄糖，再经过滤、干燥和研磨粉碎过筛，即成；

上述羟基醇β-1，3-木聚糖的制备方法包括：

I、将1g β-1，3-木聚糖溶解于50mL14wt％NaOH溶液中，再加入6mL二氯乙醇，冰浴搅拌1h，再于室温下搅拌24h；

II、在步骤I所得的物料中加入冰醋酸，于冰浴下中和，然后进行透析(放入加蒸馏水的盆中大约20h，在此期间至少更换三次蒸馏水)；

III、将步骤III所得的物料加热搅拌浓缩，再经冷冻干燥，即得所述羟基醇β-1，3-木聚糖；

(2)从含有重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)制备基因序列如SEQ IDNO.01所示的重组β-1，3-木聚糖酶：收集IPTG诱导表达后的菌液，离心后弃上清，菌体用缓冲液清洗2遍后用超声波破碎细胞，离心弃沉淀，上清液用镍柱纯化即得纯化的重组β-1，3-木聚糖酶；上述重组质粒为含有SEQ ID NO.01所示的核苷酸序列的pET-22b，该核苷酸序列通过Nde I和HindIII限制性酶切位点连接于pET-22b中；

(3)以上述重组β-1，3-木聚糖酶水解步骤(1)所得的物料，以获得所述活性β-1，3-木寡糖，具体包括：

a、将0.1g步骤(1)所得的物料加入到10mL pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中，制成浓度为1wt％的β-1，3-木聚糖溶液；

b、将350μL上述β-1，3-木聚糖溶液与50μL上述重组β-1，3-木聚糖酶混合后，于45℃水浴反应24h，接着置于100℃水浴加热5min，使上述重组β-1，3-木聚糖酶失活；

c、将步骤b所得的物料于12000rpm离心5min，所得上清液即为所述活性β-1，3-木寡糖。

(4)取3个体积为2mL的离心管，向管中加入10μL上述活性β-1，3-木寡糖的溶液，再补加390μL蒸馏水使溶液总体积为400μL，再向管中加入400μL DNS试剂，搁置水浴锅中沸水浴5min，冷却后，先用移液枪往石英比色皿中加入1.6mL蒸馏水，再用分光光度计设置540nm波长测吸光度。

在酶解过程中，木聚糖底物及木聚糖酶的种类均是影响低聚木糖混合液中木二糖和木三糖组分结构特性不可忽略的因素，为此，本发明特别的选择了对海葡萄来源的β-1，3-木聚糖。同时，本发明通过利用自行设计获得的1，3-木聚糖酶水解木聚糖制备活性β-1，3-木寡糖，不仅优化了制备工艺，而且还使得活性物质木二糖、木三糖的含量最优比，大大提高了其抗氧化活性。

同时，本发明还将通过上述步骤得到的活性β-1，3-木寡糖进行抗氧化活性测定并将1，3-低聚木糖的活性与1，4-低聚木糖的对比，来直观对比本发明的改进效果：

一、图1为HPLC图，是活性β-1，3-木寡糖，β-1，4低聚木糖以及标准木二糖标准溶液进行HPLC定性定量分析的结果示意图。将木二糖的HPLC图谱与活性β-1，3-木寡糖及β-1，4低聚木糖标样的HPLC图谱比较分析，确定活性β-1，3-木寡糖及β-1，4低聚木糖中木二糖，木三糖的出峰时间，以此判别低聚木糖中各组分的相对含量。由图1a可以看出，木二糖的出峰时间大约在8min左右，由图1b可看出，活性β-1，3-木寡糖，β-1，4低聚木糖分别在木二糖和木三糖的出峰时间均有峰出现，根据峰面积可以判断相对应的寡糖的浓度，分析结果表明，β-1，3-低聚木糖中木二糖，木三糖的浓度均比β-1，4-低聚木糖中的高。其中木二糖的浓度差别较大；而且活性β-1，3-木寡糖及β-1，4低聚木糖中均为木二糖的含量较高。

二、DPPH·法测定寡糖对DPPH自由基清除能力：

DPPH自由基是以氨为核心的一种人工合成的自由基，其在有机溶剂中的性质较为稳定，目前已被普遍应用于对动植物提取物进行抗氧化活性的测定。

由于DPPH·法测定抗氧化剂清除能力的原理为：DPPH·的孤对电子在517nm处有强吸收(呈深紫色)，当存在强清除剂时，孤对电子会进行配对，从而形成稳定的DPPH-H，使其517nm处的特征吸收光削弱或者消失，且吸光值的减弱程度与抗氧化剂的清除能力呈现出定量关系，清除率与寡糖浓度也存在量效关系。因而能够通过测定吸光值的削弱水平，来对自由基清除剂的清除能力进行评估。从图2可更直观的看出其清除能力，β-1，4低聚木糖对DPPH自由基清除能力弱，所以呈深紫色。而Vc为强的抗氧化剂，对DPPH自由基清除能力强，形成稳定的DPPH-H，肉眼可见的颜色变化呈淡黄色，因此其517nm处特征吸收光大幅减弱，同理活性β-1，3-木寡糖的也可看出明显的颜色变化，由此可看出，活性β-1，3-木寡糖的抗氧化活性显著高于β-1，4低聚木糖，且略低于Vc。先前有研究表明，-OH，-COOH和碳水化合物中的一些空间结构增强了抗氧化活性。

活性β-1，3-木寡糖，β-1，4低聚木糖及Vc对DPPH自由基的清除能力如图2、图3。由图3可以看出，活性β-1，3-木寡糖和Vc对DPPH自由基均有较强的清除能力，随着浓度的增加，对DPPH自由基的清除率均表现出先升高后逐渐趋于稳定，Vc的清除率保持在60％左右，活性β-1，3-木寡糖的清除率保持在45％以上，而β-1，4低聚木糖的DPPH自由基清除率则较低，不到20％。活性β-1，3-木寡糖对DPPH自由基的清除能力明显高于β-1，4低聚木糖，在0.25-1.5mg/mL的浓度范围内，活性β-1，3-木寡糖对DPPH自由基的清除率的趋势趋向于快速上升，而β-1，4低聚木糖并无此趋势，且活性β-1，3-木寡糖清除率始终高于β-1，4低聚木糖。当低聚木糖浓度为2mg/mL时活性β-1，3-木寡糖对DPPH自由基的清除能力尤其接近Vc。Xue等人的研究证明，低聚木糖的抗氧化活性会受到不同分子量大小的影响，王立东等学者研究证明低聚木糖中主要起抗氧化作用的是木二糖和木三糖，其含量的多少直接决定了低聚木糖的抗氧化活性的高低，活性β-1，3-木寡糖对DPPH自由基的清除率比β-1，4低聚木糖的高，可能与活性β-1，3-木寡糖中木二糖与木三糖所占比例相对较高有关。

三、测定清除·OH自由基的作用

羟自由基(·OH)是一种化学性质极其活泼的自由基，可以与几乎所有的生物大分子进行反应，且其反应速率常数比较高，在所有的自由基中，其具备的毒性最大。在生物体内部，它能够通过脂质过氧化反应来直接侵害细胞膜，还可以使人体内部许多重要的酶降解甚至完全失去活性。羟自由基还可以损伤DNA，甚至还可导致细胞突变和死亡。

从图4可明显看出，Vc的OH·的清除效果非常好，Vc本身是无色的，有色物质在不同浓度的Vc的条件下几乎都是使有色物质全部消失，Vc浓度最低的情况也使有色物质明显减少。从图中也可明显看出活性β-1，3-木寡糖的OH·的清除效果也很好，活性β-1，3-木寡糖本身为黄色，不同浓度对OH·的清除效果均不错，都可使有色物质消失。而β-1，4低聚木糖对OH·清除效果极差，肉眼观察其有色物质并没有褪去，其颜色与参比的颜色并无明显差别，明显可看出β-1，4低聚木糖的OH·的清除能力极低。

图5结果表明，β-1，3-低聚木糖与Vc一样对OH·具有很强的清除作用，且清除率均随着二者的质量浓度增加而提高，呈明显的量效关系。研究结果还表明，质量浓度0.5-1.5mg/mL范围内，活性β-1，3-木寡糖对·OH的清除作用急剧上升可达到95.45％；当浓度为2mg/mL时，活性β-1，3-木寡糖对·OH的清除作用保持稳定，说明在1.5mg/mL活性β-1，3-木寡糖的清除效率已经达到最好。然而β-1，4低聚木糖在质量浓度0.25-1.5mg/mL范围内对OH·清除率为0，仅在质量浓度2mg/mL的条件下对·OH呈现出清除率为5.47％的微弱的清除作用，因而活性β-1，3-木寡糖对·OH也具有较好的抗氧化性，而活性β-1，3-木寡糖对·OH的抗氧化性极差。这与前面的清除DPPH自由基能力测定得到的结果略微不同，这说明，评价体系的性质不同、评价原理不同的情况下，即使是对同一对象的同一指标而言，也可能会出现不同的结果。

四、邻苯三酚法测定超氧阴离子自由基清除率

邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化而生成带色的中间产物当其释放出来的受到抑制或者清除时，可以阻止中间产物积累。因此，本实验通过测定活性β-1，3-木寡糖，β-1，4低聚木糖及Vc对邻苯三酚的自氧化抑制作用，即可反映其对清除作用。由图6可看出，质量浓度在0.25-1.5mg/mL范围内活性β-1，3-木寡糖与β-1，4低聚木糖对清除率略微上升，活性β-1，3-木寡糖对清除率的增加比β-1，4低聚木糖的稍快一些，质量浓度在1.5-2mg/mL范围内活性β-1，3-木寡糖对清除作用趋于平稳，清除率稳定在77.77％左右，而β-1，4低聚木糖对清除率均低于40％。Vc的质量浓度为0.25mg/mL时对清除率已经高达96.79％，可看出对照品Vc对有极强的清除作用，在质量浓度为2mg/mL时，活性β-1，3-木寡糖与Vc对超氧阴离子的清除率分别为97.42％、71.66％，相较于β-1，4低聚木糖的清除率，两者清除超氧阴离子的能力以较为接近，表明活性β-1，3-木寡糖有较好的超氧阴离子清除能力。

与Vc相比，活性β-1，3-木寡糖与β-1，4低聚木糖对清除作用较弱，但活性β-1，3-木寡糖对清除能力介远远大于β-1，4低聚木糖。说明活性β-1，3-木寡糖具有很好的清除超氧阴离子的能力。

五、铁***还原法测定还原能力

根据铁***还原法测定还原能力，在波长700nm处测定的吸光值越大，表明样品的还原能力越强。由图7可知，在质量浓度0.25-2.0mg/mL范围内，活性β-1，3-木寡糖在700nm处吸光度随着浓度的升高而逐渐增大，说明活性β-1，3-木寡糖可以将Fe³+/铁氰化物络合物还原为亚铁形式(Fe²⁺)，其具有较强的还原能力，试验结果表明活性β-1，3-木寡糖和β-1，4低聚木糖均具有还原能力，而且还原能力随着二者的质量浓度增加而提高，随着浓度增加，活性β-1，3-木寡糖的清除率最高可达64.27％，呈显著的量效关系，且活性β-1，3-木寡糖的还原能力明显高于β-1，4低聚木糖，β-1，4低聚木糖清除率最高仅12.44％，Vc的清除率始终能够高于83％且最高可达86.24％，由此可知，二者的还原能力均明显低于Vc。

在实验中，通过薄层层析色谱法和HPLC可知β-1，3木聚糖水解产物以木二糖，木三糖为主，β-1，4木聚糖水解产物以木三糖，木四糖为主。活性β-1，3-木寡糖具备一定的抗氧化能力，在一定的样品浓度范围内，其抗氧化能力呈现出较为良好的量效关系。尤其是羟自由基的清除率最高可达到90％以上，但对DPPH自由基的清除能力较为有限，最高不超过50％。本实验通过研究在一定浓度范围内对DPPH自由基、超氧自由基、羟自由基的清除能力以及对铁离子的还原能力，发现抗氧化能力依次为还原能力＞羟自由基清除能力＞超氧阴离子清除能力＞DPPH自由基清除能力，以Vc作为对照，尽管其抗氧化活性均略低于Vc，但是均显著高于β-1，4低聚木糖，说明活性β-1，3-木寡糖具备更好的抗氧化活性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 一种从海葡萄中酶法制备活性β-1,3-木寡糖的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 1

catatgtatg gttgcctgcc gacaaaacct ctgccgaaca gcgagcgcaa gattgccaag 60

tttgaaccgg ccgacggcaa atgcctggtg tttattggcc aggagctgaa tgccatcggc 120

ggtctggacg actacaatga cggctatctg gaccacttcc agcagcgccc ggccggtttc 180

accgcatata ccgttctgac cccgggcagc gagagcttcg gtttcatcca taaaggcctg 240

gatggcgtga ccaccacaga cgattggggc gacaacaaaa gcaacatgag cctgcagctg 300

gccgacgagg actataaaaa catggccctg gccatcggtc tgggcatggt gcaccacgat 360

agcgcagtgg cctatggtaa acgtgaccag ctgatccgcg agctgggcaa tttcatcaag 420

gaacagagcc cgcgcccgat cttcctgcgc attggctacg agtttgacgg ccatgactgg 480

aaccattatg atcgcgataa ttacatcaaa gcctacaaac gtatcaaaaa tatttatgat 540

gagatggaga tcaccaacgt ggcctacgtg tggcagagtt gcggctttat gagcagcctg 600

gaagaactgg agaaatggta tccgggtgac gagtacgtgg attggtgtgc ctttagcttc 660

tttggcgcct ggaagaagca gaacatgatc gcctttgcca agcagaaggg caaaccggtg 720

tttatcgccg aagcaacccc ggccctggaa gagaacaaag agaccgttct gagcaatcaa 780

gatcaggcac gtgtggcctg ggataactgg ttcaccccgt tctttgccac cattcaccag 840

aatccggaaa ccgtgaaagc catcagctac attaattgta actggaaagc ccaccgcatg 900

tggtttgata atccgacctt taaatatatc gatagccgta tccagaccaa c 951