一种α-葡聚糖寡糖的制备方法
阅读说明：本技术 一种α-葡聚糖寡糖的制备方法 (Preparation method of alpha-glucan oligosaccharide ) 是由 马江锋 姜岷 张振龙 方艳 吴昊 董维亮 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于寡糖的制备技术领域,具体涉及一种酶法制备α-葡聚糖寡糖的方法。将从细丽毛壳菌中提取的α-D-右旋糖苷酶基因SEQ ID NO.1导入到毕赤酵母GS115中进行表达,然后用分离得到的右旋糖苷酶将低分子量右旋糖苷进行降解,通过控制酶的添加量和反应时间来控制合成α-葡聚糖寡糖,然后通过膜过滤、冷冻干燥得到分子量1kDa左右的α-葡聚糖寡糖。传统酸降解法具有耗能率高、氯化物残留高且设备易腐蚀等问题。该方法反应可控、工艺简单和原料利用率高等优点,且该方法产物均一,不产生还原性单糖。(The invention belongs to the technical field of oligosaccharide preparation, and particularly relates to a method for preparing alpha-glucan oligosaccharide by an enzyme method. The alpha-D-dextranase gene SEQ ID NO.1 extracted from chaetomium elegans is introduced into pichia pastoris GS115 for expression, then the dextran enzyme obtained by separation is used for degrading the low molecular weight dextran, the synthesis of alpha-glucan oligosaccharide is controlled by controlling the addition amount and the reaction time of the enzyme, and then the alpha-glucan oligosaccharide with the molecular weight of about 1kDa is obtained by membrane filtration and freeze drying. The traditional acid degradation method has the problems of high energy consumption rate, high chloride residue, easy corrosion of equipment and the like. The method has the advantages of controllable reaction, simple process, high utilization rate of raw materials and the like, and the product of the method is uniform and does not produce reducing monosaccharide.)
技术领域
本发明属于寡糖的制备技术领域，具体涉及一种酶法制备α-葡聚糖寡糖的制备方法。
背景技术
寡糖是由2-9个单糖聚合而成，通过糖苷键连接成直链或者带直链的低聚合度糖类物质，又可称为低聚糖，分子式一般可表示为(C6H10O5)n(n＝2-9)，分子量约300-2000道尔顿。寡糖独特的结构使其在理化性质、生理功能等方面与单糖及多糖有着显著的差异。寡糖及其衍生物是一类重要的具有生物活性的物质，能够促进双歧杆菌的生长，具有低热量、抗蛀牙、抗肿瘤和防治糖尿病等多种特点与功能，最近的研究发现，寡糖还具有抗凝血、抗氧化和调节免疫系统等作用。
寡糖在植物体中普遍存在，并且存在的方式多种多样，大多数植物的果实和种子中都含有较多的寡糖及其同类物质，构成寡糖的单糖主要包括木糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖等。现在已确定的寡糖有上千种，按照组成寡糖的单糖的不同可以分为同寡糖和杂寡糖，同寡糖是由同一种单糖聚合而成的寡糖，杂寡糖是由两种或两种以上不同种类的单糖聚合而成的寡糖。α-葡聚糖寡糖是由2-9个葡萄糖单体聚合而成的同寡糖，也具有寡糖所具有的多种生物学活性，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域中。
目前工业上α-葡聚糖寡糖的制备方法主要是通过酸或超声波将高分子量的葡聚糖降解为分子量较低的寡糖，而葡聚糖酶在制糖工业中用来降低多糖的粘度，未见相关文献研究将其用来制备葡聚糖寡糖。相较于酸法和超声波降解法，通过该酶催化来生产葡聚糖寡糖，酶催化反应温和，工艺更易控制、对设备要求较低，耗能更少。而且α-葡聚糖酶降解大分子量葡聚糖时具有一定选择性，当分子量小于一定量时，便不会再催化其降解，所以通过酶法制备出的葡聚糖寡糖产物分子量更加均一。该方法为实现工业上酶法大量制备葡聚糖寡糖提供了经验。
发明内容
本发明的目的是：提供一种酶法制备α-葡聚糖寡糖的方法。该方法工艺简单可控、α-葡聚糖寡糖制备效率高，对α-葡聚糖寡糖的结构和生物学活性影响小，且实现了寡糖混合物的分离和大量制备，为工业化生产α-葡聚糖寡糖的酶法制备提供可能。
本发明所述的α-葡聚糖寡糖的制备方法，有以下步骤组成：
（1）将α-D-右旋糖苷酶基因，如SEQ ID NO.1所示，整合到酵母蛋白表达质粒载体上，得到包含目的基因的重组质粒载体；
（2）制备E.coli Dh5α感受态；
（3）将步骤（1）得到的含有α-D-右旋糖苷酶基因的质粒导入到E.coli Dh5α中；
（4）将步骤（3）得到的E.coli Dh5α扩大培养，然后从E.coli Dh5α中提取质粒；
（5）将步骤（4）提取的质粒进行线性化；
（6）制备毕赤酵母GS115感受态；
（7）将步骤（5）得到的线性化质粒导入到毕赤酵母GS115中；
（8）将步骤（7）得到的包含α-D-右旋糖苷酶基因的毕赤酵母GS115进行发酵培养，离心得到右旋糖苷酶的粗酶液；
（9）将步骤（8）得到的粗酶液与低分子量的右旋糖苷溶液按一定比例混合反应；
（10）将步骤（9）中反应一定时间的反应液进行膜过滤，得到α-葡聚糖寡糖的溶液；
（11）将步骤（10）得到的α-葡聚糖寡糖的溶液旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后，就可得到分子量1k左右的α-葡聚糖寡糖。
其中：
步骤（1）中所述的α-D-右旋糖苷酶基因来源于细丽毛壳菌 Chaetomium gracile（编号CGMCC3.3783）。
步骤（1）中所述的酵母为毕赤酵母GS115，所述酵母蛋白表达质粒载体为pPIC9k。
步骤（4）中所述的E.coli Dh5α扩大培养所用的培养基为LB培养基。LB培养基配方为：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L。
步骤（5）中所述的线性化所用的酶简称ScaⅠ。
步骤（7）中所述的导入方法为毕赤酵母的电转化法，电击条件为2000V，200Ω，25μF，放电时间为4.9ms。
步骤（8）中所述的发酵培养所用到的菌种活化培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基简称YPD培养基，种子培养基为BMGY培养基，发酵培养基为BMMY培养基。
步骤（9）中所述的低分子量的右旋糖苷的分子量为8kDa左右，是由实验室前期制备。
步骤（10）中所述的膜过滤所用的滤膜为孔径可以截留分子量1k的滤膜。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明所述的酶法制备α-葡聚糖寡糖的制备方法，工艺简单可控，制备效率高，对α-葡聚糖寡糖的结构和生物学活性影响小，且不产生还原性单糖，可以实现α-葡聚糖寡糖的高效分离。
附图说明
图1 是本发明的低分子量葡聚糖底物和葡聚糖寡糖产物的高效液相色谱图。
图2 是本发明产物α-葡聚糖寡糖的傅里叶红外光谱图。
图3 是本发明产物α-葡聚糖寡糖的核磁共振氢谱。
图4 是本发明产物α-葡聚糖寡糖的碳谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例1所述的产右旋糖苷酶的工程菌构建方法包括以下步骤：
包含目的基因的重组质粒表达载体的构建；
重组质粒表达载体的扩增与线性化；
毕赤酵母GS115感受态的制备；
将线性化的重组质粒载体导入到毕赤酵母GS115；
步骤（1）中所述的目的基因来自细丽毛壳菌Chaetomium gracile（编号CGMCC3.3783）的α-D-右旋糖苷酶基因，如SEQ ID NO.1所示，。
步骤（1）中所述的酵母蛋白表达质粒载体为pPIC9k。将α-D-右旋糖苷酶基因插入到pPIC9k的SnaBⅠ、EcoRⅠ的酶切位点之间，交由金斯瑞公司进行合成。
步骤（2）中所述的重组质粒表达载体的扩增方法为将重组质粒导入到大肠杆菌Dh5α中，通过培养Dh5α来扩增重组质粒表达载体。准备LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L。Dh5α转化实验：将1μl重组质粒载体加入装有Dh5α感受态细胞的离心管中。冰浴20min后，42℃水浴90s，再冰浴5min。加入800μlLB培养基，37℃、60r/min摇床，温浴45min。150涂布氨苄青霉素抗性LB平板，37℃过夜培养。
步骤（2）中所述的重组质粒表达载体的线性化所用的酶为ScaⅠ。提取质粒：包含重组质粒表达载体的大肠杆菌Dh5α过夜培养后，按照质粒小量提取试剂盒提取质粒。线性化实验：酶切反应体系为重组质粒载体2000ng、ScaⅠ2μl、10*L5μl、ddH2O，总体积为50μl ，37℃反应3h。反应完成后通过凝胶电泳检测线性化是否完全，少量琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化表达载体片段。
步骤（3）中所述的毕赤酵母GS115感受态的制备方法为电转化法感受态细胞的制备。准备YPD培养基：葡萄糖22g/L、酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L，115℃、20min灭菌后备用。毕赤酵母感受态细胞制备：50μl毕赤酵母原始菌株接种于5mL YPD试管，30℃、200rpm过夜生长；然后取150μl转接250mL PYD摇瓶，30℃、200rpm培养至OD600为1.3~1.5; 将摇瓶中菌液转移到100ml离心管中，4℃、5000rpm离心10min，倒掉上清液后用50ml预冷的无菌双蒸水重悬细胞；如上离心，去除上清液后用25 ml预冷的无菌双蒸水重悬细胞；如上离心，倒掉上清液，用4ml预冷的1M山梨醇重悬细胞；如上离心，倒掉上清液，用100μl预冷的1M山梨醇重悬细胞；将制备好的感受态细胞每60μl分装到一个1.5mlEP管中。
步骤（4）中所述的转化方法为电转化法。毕赤酵母GS115电转化实验：取60μl酵母感受态细胞与10~15μl浓度为200ng/ml的线性化片段混合，转入预冷的0.2cm3电转杯中；冰上放置5min后点击，电击条件为2000V，200Ω，25μF，放电时间为4.9ms；电击后立即加入1ml预冷的1M山梨醇至电转杯中，将内容物转入灭菌离心管中；30℃静置2h；取100μl涂布遗传霉素G418YPD平板，3~4天挑取单菌落转板验证。
实施例2 产右旋糖苷酶工程菌的发酵实验
准备种子培养基BMGY：酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、K2HPO4 2.23g/L、KH2PO4g/L、甘油10ml/L、YNB 134g/L、生物素4*10-5g/L、组氨酸10g/L。
准备发酵培养基BMMY：酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、K2HPO4 2.23g/L、KH2PO4g/L、YNB 134g/L、生物素4*10-5g/L、组氨酸10g/L、甲醇2%。
定义酶活：每毫升酶液在1min内降解底物生成1μmol葡萄糖的量。
酶活检测实验:以pH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液为溶剂，将右旋糖苷TB7配制成质量分数为3%的糖溶液。取100μl粗酶液与900μl配好的糖溶液混合于2ml离心管中，在55℃水浴锅中反应15min。反应结束后，取100μl反应液于5ml离心管中，加入300μl水和300μl DNS溶液，煮沸5min，加水稀释到4ml。用紫外分光光度计在波长540nm下检测读数，通过标准曲线计算酶活。
发酵实验：取50ml保藏于-80℃的重组毕赤酵母工程菌接种5mlYPD试管；培养16h后，取500μl接种于50ml种子培养基BMGY培养；当种子液OD600为4~5时，将菌液转入灭过菌的100ml离心管中，4℃、6000rpm、离心10min；倒掉上清液后，用部分BMMY培养基重悬菌体后转入到100ml发酵培养基，在条件为30℃、200rpm下发酵，每天检测菌体浓度和酶活，待酶活增长幅度不明显时终止发酵；4℃、8000rpm、离心10min，收集上清液即为粗酶液，用于催化。
实施例3
本实施例3所述的α-葡聚糖寡糖制备的方法，由以下步骤组成：
（1）将发酵液离心得到的粗酶液与实验室前期准备的分子量8kDa左右的右旋糖酐TB7浓缩液混合于反应容器中，进行反应。
（2）反应结束后，将反应液取出，进行分离纯化。
（3）浓缩和结晶。
步骤（1）中所述反应器中反应体系为质量分数为10%右旋糖酐TB7 500ml,醋酸-醋酸钠缓冲液250ml,酶活为13U/ml的粗酶液450ml，总体积1.2L。整个催化体系的酶活浓度5U/L，调pH为5.0，在温度55℃条件下反应4h。
步骤（2）中所述的分离纯化实验为：将反应液从反应容器中取出煮沸10min，使反应液中的蛋白质变性，通过微滤膜过滤去除反应液中残留的菌体、变性的蛋白质以及一些其他的固体不容物。用膜孔经可以截留5kDa的超滤膜，去除一些蛋白质分子和大分子量的葡聚糖，收集含有α-葡聚糖寡糖的透过液。
步骤（3）中所述的浓缩操作为通过旋转蒸发仪蒸出大部分的水，浓缩α-葡聚糖寡糖溶液。将浓缩后的α-葡聚糖寡糖溶液冷冻结晶后，放入冷冻真空干燥机中2d，研磨成粉末。计算寡糖的总收率为65.65%。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种α-葡聚糖寡糖的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattacccat tgcccccagt acgatacgtc tatgtccaac tgacccaagg agtcagactg 60
gaagttactc atagtcactt gctcgccgcc tacagtccaa ttacttatcg ccacgccaaa 120
tttaagaccg gaggacgccg gcacaattga cttcccggtg cctatgctat tagcttgtag 180
gccgtccgga aacgcgacgt tttggatacg aaagtctctg tagttttgca ggggagtaat 240
tctcattaga gctggacaca aaccctcgca gactagatta ctgattgtca ttgaaataga 300
tttagcggga tcgaccgaac gaccaggcat gtagaatggt gacgctccga ttatggcgga 360
gggaacgtag gtctcacttt ttatgtagcg cgtatgaata atatacaggt cctgtaacgt 420
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ccatatagta gcacgtgtta cggttacccc actgtaatac gtctttatcg catcatcgtt 540
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gaagaaaaat gcgccgactt gtttataatc ggatatccga gttgtgatgt cgcttgaccc 660
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gagttgactg ttgcagaccg tatggttccc ggccctctga cggattgcat ggccaacggt 1740
cggttgaaat aagagccatc caagaagaac ggccgaaaac attacgta 1788
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