阅读说明：本技术 一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法及其应用 (Method for preparing polypeptide-wrapped anthocyanin microspheres based on microfluidics technology and application thereof ) 是由 徐江 张磊 张沁榕 桂仲争 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法及其应用。该方法包括以下步骤：制备微流体芯片；将花青素和多肽共溶的水溶液和乙酸乙酯溶液分别从水相入口和油相入口,通过调节水相流量与油相流量的流量比,获得均一可控的花青素乳液,注入微流体芯片,多肽起到表面活性剂的作用,同时也作为包裹层对花青素乳液进行包裹；所得花青素乳液和乙酸乙酯的混合物进行收集和静置分离,撇去上层的乙酸乙酯溶液,将花青素乳液移入冻干机,在-80℃下超低温干燥,得到多肽包裹的花青素微球。本方法利用两亲性多肽作为包裹材料,结合微流体乳化技术对桑葚花青素进行包裹,所得微球的稳定性强,所得花青素的应用领域广。(the invention discloses a method for preparing polypeptide-coated anthocyanin microspheres based on a microfluidics technology and application thereof. The method comprises the following steps: preparing a microfluid chip; respectively enabling an aqueous solution and an ethyl acetate solution in which anthocyanin and polypeptide are co-dissolved to flow from a water phase inlet and an oil phase inlet, adjusting the flow ratio of the flow of the water phase to the flow of the oil phase to obtain a uniform and controllable anthocyanin emulsion, injecting the uniform and controllable anthocyanin emulsion into a microfluid chip, wherein the polypeptide plays a role of a surfactant and is also used as a wrapping layer to wrap the anthocyanin emulsion; collecting and standing the mixture of the anthocyanin emulsion and ethyl acetate for separation, skimming the upper ethyl acetate solution, transferring the anthocyanin emulsion into a freeze dryer, and drying at ultralow temperature of-80 ℃ to obtain the polypeptide-coated anthocyanin microspheres. According to the method, the mulberry anthocyanin is wrapped by using the amphiphilic polypeptide as a wrapping material and combining a microfluidization emulsification technology, the stability of the obtained microspheres is strong, and the application field of the obtained anthocyanin is wide.)

一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法及其 应用

技术领域

本发明属于生物材料应用技术领域，具体涉及一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法及其应用。

背景技术

花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，是花色苷水解而得的有颜色的苷元。花青素具有营养和多种保健功能，在食品、药品和化妆品行业有着广阔的应用前景。但花青素的稳定性低，易降解；受温度、pH、光照等因素的影响较大。这些因素都会加快花青素的降解，限制了花青素在各行业中的应用。因此如何提高花青素的稳定性是拓展其应用的瓶颈。目前已报道提高花青素稳定性的方法有甲基化、酰基化，以及利用聚合物（比如脂质体）包裹等。氨基酸是人体的必需元素，氨基酸构成的多肽，具有生物相容性高、双亲性、组装结构易控制、合成便捷等优点。

有报道利用二氧化碳超临界流体作为溶剂从天然产物中提取并包裹花青素的方法，如DT Santos et al.等人（Food Research International. 2013 Mar 1;50(2):617-24）从嘉宝果果皮中提取花青素的研究。这种方法对工艺条件要求严苛（超高压），操作流程复杂，而且二氧化碳对于花青素的包裹能力较低，难以形成对空气和水的有效隔膜。PRobert et al.等人使用喷雾干燥的方法（International Journal of Food Science &Technology. 2010 Jul;45(7):1386-94.），将花青素和载体蛋白质的共混溶液在高温下高速喷出，使其瞬间干燥形成包裹颗粒。然而这种方法无法有效隔绝空气氧化，而且高温较易引起花青素变性。

微流体技术是一种上世纪末兴起的控制和操纵微尺度流体的技术，因为对于反应条件（温度，浓度，酸碱度，体积等）的精确控制能力，成为了目前的热门交叉研究领域（PTabeling, Introduction to Microfluidics. 2005）。其中，使用微流体平台制备尺度均一的单乳液来进行研究已经成为了生物、医学、物理化学等学科的重要技术手段，如RKShah et al.等人的研究（Materials Today. 2008 Apr 1;11(4):18-27）。因此，为提高花青素的稳定性、降低其降解速率，从而加强其在食品、药品、化妆品等行业中的应用，我们将通过微流体乳化技术包裹花青素, 使用自组装多肽作为包裹材料，从而减少花青素受到外界环境的干扰，为扩大花青素在食品、药品、化妆品等行业中的应用提供一个更加有效的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法及其应用，该方法利用两亲性多肽作为包裹材料，结合微流体乳化技术对桑葚花青素进行包裹，所得微球的稳定性强，所得花青素的应用领域广。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法，包括以下步骤：

步骤1，制备微流体芯片

步骤2，乳化

将花青素和多肽共溶的水溶液作为水相和乙酸乙酯溶液作为油相分别从水相入口和油相入口，注入微流体芯片；所述多肽：花青素的摩尔比为1:4-64，所述花青素浓度为1-10mg/ml，水相流量为0.1-100ml/hr，油相流量为0.2-200ml/hr，水相流量与油相流量的比例为1:2-20，通过调节水相流量与油相流量的流量比，获得尺寸大小均一可控的花青素乳液，其中多肽由于自身的两亲性会聚集在水/乙酸乙酯界面，起到表面活性剂的作用，同时也作为包裹层对花青素乳液进行包裹；

步骤3，冻干

对步骤2所得花青素乳液和乙酸乙酯的混合物进行收集和静置分离，撇去上层的乙酸乙酯溶液，将花青素乳液移入冻干机，在-80℃下超低温干燥，得到多肽包裹的花青素微球。

作为改进的是，所述微流体管道的制备方法，包括以下步骤：

第一步，利用工程制图软件AutoCAD设计深度为10-200微米，宽度为10-200 微米的微流体管道，并在透明塑料薄片上印刷为光刻模板，所述微流体管道有一个水相入口、一个油相入口和一个产物收集出口，所述水相入口和油相入口的口径为0.2-2mm；

第二步，使用软光刻技术将光刻模板打印在硅片基板上，光刻模板上的图案在硅片基板的投影尺寸比为1:1；

第三步，揭模

将A材料均匀涂抹于硅片基板上，A材料形成的层厚度为1mm-1cm,使用真空泵充分消除硅胶中残留的气泡之后，将A材料移入70℃的烘箱中加热1小时，揭模后即得管道，且硅片基板可以重复使用来进行揭模；所述A材料为PC、ABS、TEFLON、 PMMA或PDMS；

第四步，键合

将管道和玻璃基板放入等离子体反应箱中，使用紫外光照射表面1分钟后，使得A材料和玻璃基板表面充分羟基化，反应结束后迅速取出A材料和玻璃基板，使二者表面轻轻接触即可完成粘合，得到微流体芯片。

进一步改进的是，第一步中微流体管道模型的深度为100微米。

进一步改进的是，第二步中A材料形成的层厚度为5mm。

进一步改进的是，第三步中多肽与花青素的摩尔比为1:14，再此比例下，包裹效率和多肽利用率高。

作为改进的是，所述微流体芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤i，制管

取一根B材料的圆型毛细管作为内管，并使用毛细管拉伸机对其一端进行拉伸形成流线型收缩端口，端口尺寸为0.1毫米；再取另外一根的正方形B材料的毛细管作为外管；内管的外径须不大于外管的内径，且差值不大于0.5毫米，内管与外管在使用之前均充分清洗、烘干；所述B材料为玻璃、金属或工程塑料；

步骤ii, 组装

将步骤i所得的内管小心***外管约5毫米左右，在内管远端、内外管相接处以及外管远端分别连接到工程塑料转接口，并使用速干胶小心封装在透明塑料或玻璃薄板上；微流体平台整体长度约为8厘米，宽度为1厘米；内管远端、内外管相接处以及外管远端的三个转接口分别为水相入口，油相入口以及产物出口。

作为改进的是，所述多肽包括定向设计氨基酸序列的多肽（常在N端或者C端带电荷）、蚕丝水解多肽（包含丝素多肽和丝胶多肽）或ABS蛋白；此类多肽具有以下特性：1）双亲性（包含亲水区域和疏水区域）；2）此类多肽易于组装成微球形态或者杆状形态，可用于小分子的包裹；3）此类多肽一般带有电荷，易于形成最终的组装形态，易于稳定的存在于水溶液中。

上述包裹青花素微球在食品、化妆品或保健品上的应用。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法及其应用的优势在于：

（1）花青素包率高，95%以上的花青素

可以被有效包裹，而传统的乳液方法的包裹率一般低于50%。这是由于花青素在水相和大部分油相溶剂中的溶解度都较好，极易从包裹颗粒中溶解扩散，而本方案采取的乙酸乙酯溶剂为花青素不良溶剂，且能促进多肽形成稳定的两亲性自组装纳米结构，而且微流体乳化技术能制造大小均一的乳液液滴，极大地降低了奥斯瓦尔德熟化效应，当多肽为蚕丝多肽时效果更好；

（2）花青素稳定性高，多肽包裹的花青素微球能在真空干燥包装条件下维持花青素活性达一年以上，多肽-花青素冻干粉溶于水溶液之后也可以，起到缓释花青素的作用（24小时内释放率为93%），有效地延长了花青素的生物活性和使用期限。这些优点都是以往的生产和保存方法不具备的；

（3）多肽生物学活性高，易被人体吸收，体现出良好的保湿、抗菌、抗氧化、抗紫外损伤等功能。

（4）微流体生产平台对原料的利用率高（>99%），能耗低，生产过程绿色环保，对产物的尺寸、产量可以实现精确的调控。而且微流体芯片的制备过程简单易重复，具有很强的放大规模生产的潜力。

附图说明

图1为本发明的一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法；

图2为多肽：花青素不同摩尔比时，微球的纳米粒径和电位情况，其中，（a）为纳米粒径，（b）为电位；

图3为本发明是实施例1制备的花青素纳米颗粒微球的电镜图片,参照标尺为200 nm；

图4为分别在50℃下，pH10，Fe²⁺的浓度为1 mol/l的环境下，微球的稳定性情况；

图5为实施例1的PDMS硅胶微流控平台，白色参照标尺为1cm，其中，1-水相入口，2-油相入口，3-产物收集出口；

图6为实施例2的玻璃毛细管微流控平台，白色参照标尺为1cm，其中，1-水相入口，2-油相入口，3-产物收集出口。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法，制备步骤如下：

（1）制图：使用工程制图软件AutoCAD设计微流体管道，其中有一个水相进口，一个油相进口，一个产物收集出口，进出口的直径为1毫米，管道深度为50微米，宽度为100微米；微流体管道的结构如图5所示；

（2）制模：将步骤（1）所得的光刻模板使用软光刻技术（soft lithography）等比例投影打印在硅片基板上，尺寸比为1：1。管道由SU-8 2100光刻胶构成，管道深度为50微米，宽度控制为100微米；

（3）揭模：将二甲基硅氧烷单体和固化剂按10：1的比例混合均匀后，倾涂于步骤（2）所得硅片模板上，PDMS硅胶厚度为5毫米。使用真空泵消除硅胶中残留的气泡1小时之后，将硅胶移入70度的烘箱中加热1小时，揭模后即得PDMS管道；

（4）键合：将PDMS管道和一片普通的显微镜载玻片放入等离子体反应箱中，使用紫外光照射表面1分钟。反应结束后迅速取出PDMS和玻璃基板，使二者表面轻轻接触即可完成键合，得到微流体芯片。芯片总尺寸为5cm×2cm；

（5）乳化：将含有10mL花青素(1mg/mL)和定向设计的含有18个氨基酸的多肽C6M1的水溶液和乙酸乙酯溶液分别从水相入口和油相入口注入步骤（4）所得的微流体芯片。其中水：乙酸乙酯的体积流速比为1mL/hr:5mL/hr，所产生的花青素乳液为大小均一，约为200微米的单分散乳液。水溶液中的花青素：多肽的摩尔比为14：1；

（6）冻干：对步骤（5）所得花青素乳液和乙酸乙酯的混合物进行收集，静置分离10分钟后，撇去上层的乙酸乙酯溶液，将剩余的花青素乳液移入冻干机，在-80度下超低温干燥24小时，得到多肽包裹的花青素微颗粒。

花青素乳液和花青素微颗粒的尺寸测定分别使用显微镜拍照和SEM投射电镜表征的方法，花青素包裹率的测定使用紫外吸收光谱对比法，测试结果表明本发明提供的花青素微球尺寸约为350纳米，花青素包裹率为95%，真空干燥包装下花青素稳定性超过1年。

实施例2

一种基于微流体技术制备多肽包裹的花青素微球的方法，制备步骤如下：

（1）制管：我们使用一根长度为2厘米，内径0.5毫米，外径0.7毫米的圆型玻璃毛细管（CM Scientific）作为内管，并使用毛细管拉伸机（P-97，Sutter Instrument Company）对其一端进行拉伸形成流线型收缩端口，端口尺寸为0.1毫米；我们使用另外一根长度为5厘米，内边长0.7毫米，外边长1毫米的正方形玻璃毛细管（CM Scientific）作为外管。内外管在使用之前均充分清洗、烘干。

（2）组装：将步骤（1）所得的内管小心***外管约5毫米左右，在内管远端、内外管相接处以及外管远端分别连接到工程塑料转接口（Nanoports），并使用速干胶小心封装在透明塑料或玻璃薄板上。微流体平台整体长度约为8厘米，宽度为1厘米。内管远端、内外管相接处以及外管远端的三个转接口分别为水相入口，油相入口以及产物出口。

（3）乳化：将含有10mL花青素(1mg/mL)和定向设计的含有18个氨基酸的多肽C6M1的水溶液和乙酸乙酯溶液分别从水相和油相管道入口注入步骤（2）所得的微流体芯片。其中水：乙酸乙酯的体积流速比为1mL/hr:5mL/hr，所产生的花青素乳液为大小均一，约为300微米的单分散乳液。水溶液中的花青素：多肽的摩尔比为14：1；

（4）冻干：对步骤（3）所得花青素乳液和乙酸乙酯的混合物进行收集，静置分离10分钟后，撇去上层的乙酸乙酯溶液，将剩余的花青素乳液移入冻干机，在-80度下超低温干燥24小时，得到多肽包裹的花青素微颗粒。

花青素乳液和花青素微颗粒的尺寸测定分别使用显微镜拍照和SEM投射电镜表征的方法，花青素包裹率的测定使用紫外吸收光谱对比法，测试结果表明本发明提供的花青素微球尺寸约为400纳米，花青素包裹率为95%，真空干燥包装下花青素稳定性超过1年。

需要补充说明的是，本例中内管适宜尺寸可在0.1毫米至2毫米之间，外管适宜尺寸可在0.5毫米至1厘米之间，本例所描述具体数值均为优化实验方案。

对比例1

有报道利用二氧化碳超临界流体作为溶剂从天然产物中提取并包裹花青素的方法，如DT Santos et al.等人（Food Research International. 2013 Mar 1;50(2):617-24）从嘉宝果果皮中提取花青素的研究。这种方法对工艺条件要求严苛（超高压），操作流程复杂，而且二氧化碳对于花青素的包裹能力较低，难以形成对空气和水的有效隔膜。P Robert etal.等人使用喷雾干燥的方法（International Journal of Food Science & Technology.2010 Jul;45(7):1386-94.），将花青素和载体蛋白质的共混溶液在高温下高速喷出，使其瞬间干燥形成包裹颗粒。然而这种方法无法有效隔绝空气氧化，而且高温较易引起花青素变性。

综上所述，本专利通过使用微流体乳化技术，在不同材料的微流体平台（如PDMS，玻璃毛细管）上均成功地制备了多肽包裹的花青素微球。与传统方法相比，微流体技术制备的多肽包裹的花青素微球具备多种优势，例如：生产流程简单易操作、生物安全性好、花青素微球大小均一可控、花青素包裹率更高、花青素稳定性更长久等。本专利为探索花青素在化妆品、保健品、食品添加剂等领域的广泛应用提供了可靠的技术方案。