阅读说明：本技术 氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法 (Preparation method of amino acid-based polyester ammonia electrostatic spinning nanofiber tissue engineering skin scaffold ) 是由 吴德群 李梦娜 仇威王 王倩 韩华 李发学 王学利 俞建勇 于 2019-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法,其特征在于,合成氨基酸基二胺、对二硝基苯活性酯；将氨基酸基二胺与对二硝基苯活性酯两种单体进行溶液缩聚,得到氨基酸基聚酯氨聚合物；将氨基酸基聚酯氨聚合物进行静电纺得到氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架。本发明不仅具有稳定的形态,均匀的直径分布,还具备优良的生物相容性,且方法简单易行,绿色环保,可大规模生产。在伤口抗菌、伤口修复等生物医用领域具有潜在的应用。(the invention discloses a preparation method of amino acid base polyester ammonia electrostatic spinning nanofiber tissue engineering skin scaffold, which is characterized in that amino acid base diamine and p-dinitrobenzene active ester are synthesized; carrying out solution polycondensation on two monomers, namely amino acid-based diamine and p-dinitrobenzene active ester to obtain an amino acid-based polyester ammonia polymer; and (3) carrying out electrostatic spinning on the amino acid-based polyester ammonia polymer to obtain the amino acid-based polyester ammonia electrostatic spinning nanofiber tissue engineering skin scaffold. The invention has stable shape, uniform diameter distribution and excellent biocompatibility, and the method is simple and easy to implement, green and environment-friendly and can be used for large-scale production. Has potential application in the biomedical fields of wound antibiosis, wound repair and the like.)

氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备 方法

技术领域

本发明涉及一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

在生物医用领域种，由于缝合线、外科植入物、药物控释制剂和组织工程支架等的需求越来越多，要求越来越高，可生物降解聚合物的开发是一个日益重要的研究领域。聚酯氨是一种具有良好机械性能和优良生物相容性的高分子化合物，兼具聚酯和聚酰胺的特点，而受到最多关注。

聚酯氨有两类，一类是由非氨基酸衍生而来，例如脂肪族二胺。另一类由氨基酸衍生而来，例如L-苯丙氨酸，L-亮氨酸和L-赖氨酸。氨基酸基聚酯氨分子链中具有酰胺键和酯键，赋予其聚合物既具有聚氨酯的特性，又具有蛋白质特性，即酶催化的表面侵蚀生物降解，将机械、物理和生物相容性结合到单个实体中。基于α-氨基酸的聚氨酯聚酯氨是新一代的合成材料，具有多功能性，表现出良好的加工性能，优良的机械性能，还表现出良好的生物相容性和低炎症反应，并且可能潜在地增强细胞-物质相互作。作为潜在的可生物降解聚合物家族，氨基酸基聚酯氨分子链中含有天然的氨基酸片段，可生物降解，其对水解和水解的敏感性酶促降解，降解的产物具有低毒性源，氨基酸可被蛋白水解酶，被人体所吸收。另外值得一提的是，它们结构中硬和软链段的可设计改变和可调的酰胺键/酯键比，可以调控其降解周期以适应不同伤口的愈合。

众所周知，天然细胞外基质(ECM)是一种极其复杂的流体环境，它由纤维形成蛋白质组成(如胶原蛋白和弹性纤维)以及非纤维形成蛋白(蛋白多糖，糖胺聚糖和可溶性蛋白聚糖)，是细胞提供赖以生存的微环境。静电纺丝已广泛用于组织工程，主要是因为他们的微观结构可以通过简单的静电纺丝过程轻松调节细胞外基质(ECM)式结构。纳米纤维膜具有较的高表面积与体积比，良好的水汽透过率，其孔径结构能够刺激细胞粘附，迁移和增殖。在静电纺丝过程，很多物质(如表皮生长因子、抗菌剂等)可以很容易掺杂在纤维中，提高了伤口愈合效率和生物活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：合成氨基酸基二胺，由色氨酸和二醇酯化反应获得；

步骤2)：将二酰氯与对硝基苯酚反应，得到对二硝基苯活性酯；

步骤3)：将氨基酸基二胺与对二硝基苯活性酯两种单体进行溶液缩聚，得到氨基酸基聚酯氨聚合物；

步骤4)：将氨基酸基聚酯氨聚合物进行静电纺得到氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架。所述纳米纤维支架不仅具有稳定的形态，均匀的直径分布，还具备优良的生物相容性，且方法简单易行，绿色环保，可大规模生产。

优选地，所述步骤1)具体为：将L-色氨酸、二醇、对甲苯磺酸直接混合，将混合物置于装有甲苯的容器中；然后将固-液反应混合物加热至70-130℃，保持回流16-24小时；将反应混合物冷却至室温，除去甲苯，最后在去离子水中反复溶解、沉淀三次来化纯产物，过滤收集白色物质，真空干燥，密封保存。

更优选地，所述二醇为碳原子数目是3-8个中的链状脂肪二醇中的任意一种；所述二醇、L-色氨酸、对甲苯磺酸投料摩尔比为1：(2～4)：(4～6)；甲苯的体积为固体体积的10-30倍。

优选地，所述步骤2)具体为：将对硝基苯酚溶解在有机溶剂中，然后加入催化剂，逐滴滴加二酰氯，在机械搅拌作用下，反应过夜，过滤，干燥，得到针状灰白色固体，密封，干燥皿中保存。

更优选地，所述的有机溶剂为丙酮、DMF、DMAC、THF和CHCl₃中的任意一种或几种；所述的催化剂为碱性催化剂，采用DMAP，DIEA，ET₃N和吡啶中的任意一种或几种；所述的二酰氯为脂肪二酰氯，包括丁二酰氯、戊二酰氯、己二酰氯和癸二酰氯中的任意一种；所述反应的温度为-90～-30℃。

优选地，所述步骤3)具体为：将氨基酸基二胺和对二硝基苯活性酯溶解在有机溶液中，并加入催化剂，进行聚合反应，在乙酸乙酯中沉淀，过滤，用索氏提取法提纯聚合物，得到白色固体，密封于干燥皿中保存。酯键和酰胺键等多个酶降解位点及降解速率，通过改变酶的种类，酶的浓度，降解时间，从而与伤口愈合周期相吻合。

更优选地，所述的有机溶液为DMF、DMAC、DMSO和THF中的任意一种或几种；所述聚合反应的温度为60～100℃，反应时间为6～24小时。

优选地，所述步骤4)具体为：将聚合物溶解在有机溶剂中，制得纺丝液，将其用静电纺丝技术获得纳米纤维膜，将膜置于通风处干燥，根据伤口形状，裁剪纳米纤维膜，制备氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架。

更优选地，所述纺丝液中聚酯氨的质量浓度为5-35％；所述的有机溶剂为DMF、DMSO、TFA和HFIP中的任意一种。

更优选地，所述静电纺丝的工艺参数为：温度25～45℃，相对湿度15～45％，注射速度0.5～3mL/h，接收距离10～25cm；制得的纳米纤维膜中纤维的直径为500～1000nm。

本发明所述的氨基酸基聚酯氨纳米纤维支架是用静电纺技术制备而成，本发明所述的氨基酸基聚酯氨是两种单体经溶液缩聚合成聚酯氨聚合物，聚合物中的氨基酸、活性酯片段，酶降解以后对人体和环境无毒无害，具有良好的生物相容性。

由静电纺制得的纳米纤维膜支架不仅具有稳定的形态，均匀的直径分布，还具备优良的生物相容性，且方法简单易行，绿色环保，可大规模生产。在伤口抗菌、伤口修复等生物医用领域具有潜在的应用。

与现有的聚酯氨材料相比，本发明的有益效果是：

脂肪族聚酯是研究最广泛的家族可生物降解的聚合物，尽管基于乙醇酸，L-乳酸，ε-己内酯及其共聚物的脂族聚酯的几种聚合物，已被用作可生物降解的生物材料，它们仍缺乏某些最佳性能。例如，由于大多数这些聚酯是由单一合成，不能容易地调节脂族聚酯的降解速率单体。此外，已经表明这些聚酯的酸性降解副产物对某些细胞有毒，限制了它们作为功能性组织工程支架的用途。

(1)本发明所制备的氨基酸基聚酯氨材料，大量的酰胺键和酯键，能够被多种酶降解，酯键和酰胺键等降解位点及降解速率通过改变酶的种类，酶的浓度及降解时间，以便与伤口修复的周期相吻合。

(2)本发明所制备的氨基酸基聚酯氨，赋予其聚合物既具有聚氨酯的特性，又具有蛋白质特性(大量酰胺键)，即酶催化的表面侵蚀生物降解，将机械、物理和生物相容性结合到单个实体中。基于α-氨基酸的聚氨酯聚酯氨是新一代的合成材料，具有多功能性，表现出良好的加工性能，优良的机械性能，还表现出良好的生物相容性和低炎症反应，并且可能潜在地增强细胞-物质相互作。

(3)本发明所制备的氨基酸基聚酯氨纳米材料，作为支架材料，能够很好地模拟天然细胞质基质，而且具有较的高表面积与体积比，良好的水汽透过率，其孔径结构能够刺激细胞粘附，迁移和增殖。在静电纺丝过程，很多物质(如表皮生长因子、抗菌剂等)可以很容易掺杂在纤维中，提高了伤口愈合效率和生物活性。

(4)本发明所制备的氨基酸基聚酯氨纳米纤维支架，静电纺制得，工艺简单，生产效率高，环保安全。能够很好地模拟天然细胞质基质，而且具有较的高表面积与体积比，良好的水汽透过率，其孔径结构能够刺激细胞粘附，迁移和增殖。在静电纺丝过程，很多物质(如表皮生长因子、抗菌剂等)可以很容易掺杂在纤维中，提高了伤口愈合效率和生物活性。

附图说明

图1为氨基酸基二胺的合成示意图；其中，n＝1～3，表示二醇中碳原子个数；

图2为氨基酸基聚酯氨的合成示意图；其中，m＝1～3，表示二醇中碳原子个数；k＝2～8，表示酰氯中碳原子的个数；

图3为氨基酸基聚酯氨纳米纤维膜的扫描电镜图。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1

一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法：

1、氨基酸基二胺的制备

将L-色氨酸(0.1mol)、1,4-丁二醇(0.05mol)、对甲苯磺酸(0.1mol)直接混合，置于装有甲苯(400mL)的三颈圆底烧瓶。将固-液反应混合物加热至120℃，保持回流16小时。然后将反应混合物冷却至室温，除去甲苯，最后通过在去离子水中反复溶解、沉淀三次来纯化产物，过滤收集白色物质，真空干燥，密封保存。

2、对二硝基苯活性酯的制备

在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100mL丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80mL丙酮中的丁二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000mL蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶三次纯化。

3、氨基酸基聚酯氨的制备

氨基酸基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5mL无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将三乙胺(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥。

4、纳米纤维支架的制备

将氨基酸基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为25％的溶液，采用静电纺丝技术得到纳米纤维膜，静电纺工艺参数为：温度30℃，相对湿度35％，接收距离15cm，推进速度0.5cm/h。制得纳米纤维膜烘干后，裁剪成一定大小作为皮肤组织工程支架。

实施例2

一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法(所述的氨基酸基二胺中二醇为1,5-戊二醇)：

1、氨基酸基二胺的制备

将L-色氨酸(0.1mol)、1,5-戊二醇(0.05mol)、对甲苯磺酸(0.1mol)直接混合，置于装有甲苯(400mL)的三颈圆底烧瓶。将固-液反应混合物加热至120℃，保持回流16小时。然后将反应混合物冷却至室温，除去甲苯，最后通过在去离子水中反复溶解、沉淀三次来纯化产物，过滤收集白色物质，真空干燥，密封保存。

2、对二硝基苯活性酯的制备

在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100mL丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80mL丙酮中的丁二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000mL蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶三次纯化。

3、氨基酸基聚酯氨的制备

氨基酸基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5mL无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将三乙胺(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥。

4、纳米纤维支架的制备

将氨基酸基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为25％的溶液，采用静电纺丝技术得到纳米纤维膜，静电纺工艺参数为：温度30℃，相对湿度35％，接收距离15cm，推进速度0.5cm/h。制得纳米纤维膜烘干后，裁剪成一定大小作为皮肤组织工程支架。

实施例3

一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法(所述的氨基酸基二胺中二醇为1,6-己二醇，对二硝基苯活性酯的制备中的二酰氯戊二酰氯)：

1、氨基酸基二胺的制备

将L-色氨酸(25g，0.1mol)、1.6-己二醇(5g，0.05mol)、对甲苯磺酸(25g，0.1mol)直接混合，置于装有甲苯(400mL)的三颈圆底烧瓶。将固-液反应混合物加热至130℃，保持回流18小时。然后将反应混合物冷却至室温，除去甲苯，最后通过在去离子水中反复溶解、沉淀三次来纯化产物，过滤收集白色物质，真空干燥，密封保存。

2、对二硝基苯活性酯的制备

在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100mL丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80mL丙酮中的戊二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000mL蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶三次纯化。

3.氨基酸基聚酯氨的制备

氨基酸基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5mL无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将三乙胺(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥。

4.纳米纤维支架的制备

将氨基酸基聚酯氨溶解在THF中形成质量分数为25％的溶液，采用静电纺丝技术得到纳米纤维膜，静电纺工艺参数为：温度30℃，相对湿度35％，接收距离15cm，推进速度0.5cm/h。制得纳米纤维膜烘干后，裁剪成一定大小作为皮肤组织工程支架。

实施例4

一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法(所述的氨基酸基二胺中二醇为1,6-己二醇，对二硝基苯活性酯的制备中的二酰氯己二酰氯)：

1、氨基酸基二胺的制备

将L-色氨酸(25g，0.1mol)、1，6-己二醇(5g，0.05mol)、对甲苯磺酸(25g，0.1mol)直接混合，置于装有甲苯(400mL)的三颈圆底烧瓶。将固-液反应混合物加热至130℃，保持回流18小时。然后将反应混合物冷却至室温，除去甲苯，最后通过在去离子水中反复溶解、沉淀三次来纯化产物，过滤收集白色物质，真空干燥，密封保存。

2、对二硝基苯活性酯的制备

在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100mL丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80mL丙酮中的己二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000mL蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶三次纯化。

3.氨基酸基聚酯氨的制备

氨基酸基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5mL无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将三乙胺(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥。

4.纳米纤维的制备

将氨基酸基聚酯氨溶解在THF中形成质量分数为25％的溶液，采用静电纺丝技术得到纳米纤维膜，静电纺工艺参数为：温度30℃，相对湿度35％，接收距离15cm，推进速度0.5cm/h。制得纳米纤维膜烘干后，裁剪成一定大小作为皮肤组织工程支架。

实施例5

一种氨基酸基聚酯氨静电纺纳米纤维组织工程皮肤支架的制备方法(所述的氨基酸基二胺中二醇为1,4-丁二醇，对二硝基苯活性酯的制备中的二酰氯癸二酰氯，所使用的纺丝液浓度为35％)：

1/氨基酸基二胺的制备

将L-色氨酸(25g，0.1mol)、1,4-丁二醇(5g，0.05mol)、对甲苯磺酸(25g，0.1mol)直接混合，置于装有甲苯(400mL)的三颈圆底烧瓶。将固-液反应混合物加热至130℃，保持回流18小时。然后将反应混合物冷却至室温，除去甲苯，最后通过在去离子水中反复溶解、沉淀三次来纯化产物，过滤收集白色物质，真空干燥，密封保存。

2.对二硝基苯活性酯的制备

在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100mL丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80mL丙酮中的癸二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000mL蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶三次纯化。

3.氨基酸基聚酯氨的制备

氨基酸基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5mL无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将三乙胺(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥。

4.纳米纤维支架的制备

将氨基酸基聚酯氨溶解在THF中形成质量分数为25％的溶液，采用静电纺丝技术得到纳米纤维膜，静电纺工艺参数为：温度30℃，相对湿度35％，接收距离15cm，推进速度0.5cm/h。制得纳米纤维膜烘干后，裁剪成一定大小作为皮肤组织工程支架。