阅读说明：本技术 一种3d打印技术制备的松质骨仿生支架的设计与应用 (Design and application of cancellous bone bionic scaffold prepared by 3d printing technology ) 是由 孙晗笑 利时雨 于 2018-06-06 设计创作，主要内容包括：本发明通过3D-Voronoi算法和随机分布微孔算法构建了新型仿生支架模型,并运用生物3D打印技术制作了高精度的该组织工程支架。运用磷酸二氢铵二次煅烧法煅烧牛股骨,在实现异体骨脱脂脱钙去抗原的基础上,去除了羟基磷灰石等无机成分,使余物为高纯度的β-磷酸三钙,保留了天然松质骨形态的同时消除了实验中因基质材料带来的变量差异。通过表征检测、结构分析、体外实验、体内植入等多种实验,全面地评价不同支架结构对细胞增殖粘附和体内骨修复效果的影响,为骨组织工程支架的仿生结构设计提供了可靠支架模型和有效检测手段,可用于临床各种骨缺损的使用。(The invention constructs a novel bionic scaffold model by a 3D-Voronoi algorithm and a random distribution micropore algorithm, and manufactures the high-precision tissue engineering scaffold by applying a biological 3D printing technology. The bovine femur is calcined by using an ammonium dihydrogen phosphate secondary calcination method, inorganic components such as hydroxyapatite are removed on the basis of realizing the degreasing, decalcification and antigen removal of the allogeneic bone, the remainder is high-purity beta-tricalcium phosphate, the form of the natural cancellous bone is reserved, and the variable difference caused by the matrix material in the experiment is eliminated. Through various experiments such as characterization detection, structural analysis, in vitro experiments, in vivo implantation and the like, the influence of different scaffold structures on cell proliferation adhesion and in vivo bone repair effects is comprehensively evaluated, a reliable scaffold model and an effective detection means are provided for the bionic structure design of the bone tissue engineering scaffold, and the scaffold can be used for various clinical bone defects.)

一种3d打印技术制备的松质骨仿生支架的设计与应用

技术领域

本发明属组织工程领域，更具体地说，本发明涉及一种新型仿生支架模型的应用。

背景技术

人体的骨骼系统具有维持运动、保护体内脏器、支撑体重等重要功能。我国每年由于创伤、感染、肿瘤、手术切除等原因造成的骨缺损病例众多，骨缺损修复面临着巨大的临床需求，且一直呈现不断上涨趋势。骨缺损的修复材料较多，根据来源可分为自体材料、异体材料植和人工材料。

自体骨移植是治疗骨缺损的金标准，具有无免疫排斥、可完全吸收、有效诱导骨重建的优点，目前临床上少量骨缺损可用骨碎屑、骨粉进行填充修复；大段下颌骨缺损修复主要用血管化髂骨瓣、腓骨瓣或非血管化髂骨、肋骨游离后移植。但因自体骨来源有限，取骨需要开辟第二术区从而造成新的骨缺损，容易引发感染、血肿、神经损伤等并发症，且在修复过程中易出现二次损伤以及新的骨缺损，造成在临床上的应用受到了限制，自体骨移植尚不能满足庞大的临床需求。异体骨较自体骨来源相对广泛，通常经过加工处理工序来降低抗原性和便于储藏，但即便如此，仍有一些患者出现异体骨排斥反应，以及吸收、不愈合的现象。

人工材料作为一种新型的骨缺损修复材料，可有效地实现骨缺损填充和结构支持作用，解决了供骨量有限、避免了免疫排斥反应，且较易塑形，便于匹配缺损区域的解剖结构。在临床上，医用人工骨修复材料可分为金属材料和非金属材料。医用金属材料有不锈钢、钛基合金、钴基合金等。以钛合金为例，其力学强度好、生物相容性好，术后感染率低。在手术中可以由医生根据病人缺损部位的大小和形状手工剪切钛网板，手工塑形，再用螺钉固定实现缺损修补。也可以结合三维重建技术在术前调整好贴合患者颅部解剖结构的钛网，从而大大缩短手术时间。

骨缺损的修复愈合是一个复杂的病理及生理过程，骨组织工程支架为了有效地负载生长因子和种子细胞，在植入后积极地促进骨生长、血管生成、营养代谢，避免感染、免疫排斥等问题，对于支架的基质材料和三维结构有着一定的要求。总结以往的研究观点，理想的骨组织工程支架应具备以下特性：（1）良好材料可塑性，具有一定的机械强度，使材料在一定时间内可以维持形态结构，并与植入部位原本骨组织的生物力学性质相匹配；（2）良好的生物相容性和表面活性，有利于种子细胞在材料表面黏附、增殖、分泌细胞外基质；（3）良好的骨传导性，有利于新骨组织、血管组织的长入；（4）良好的骨诱导性，能够材料上、刺激植入部位周围的细胞向软骨细胞和成骨细胞分化，形成新骨组织；（5）具有三维多孔结构，有连通的微孔和较高的孔隙率，有利于种子细胞、生长因子的黏附，以及营养物质、代谢产物的交换。

3D打印技术也称为快速成型技术或增材制造技术，是一种以数字三维模型为基础，通过将可粘合材料逐层打印、层层叠加的方式来制造立体实物的制造技术。近年来，因3D打印技术具有快速成型、精确复制、构造复杂结构等优点，逐渐受到了生物医学领域科研人员的青睐并得到应用，具体包括制作植入假物，手术器械，手术导板、生物细胞打印等。将3D打印技术用于构建骨组织工程支架，可以体现出3D打印技术的以下几点优势：（1）可利用三维设计软件设计复杂三维结构作为打印模板；（2）基于数字三维模型，精确打印等比例的立体实物，良好匹配骨组织解剖形态；（3）可以精确控制多孔支架的内部构造以及孔隙率；（4）可打印多种材料，高分子材料如聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸、聚乙醇酸、聚己内酯（PCL）等，生物陶瓷如羟基磷灰石（HA）、β-磷酸三钙（β-TCP）、生物活性玻璃（BG）等，金属材料如钛基合金、钴基合金等，生物材料如组织细胞。

作为3D打印的一个新兴的分类，可进行活细胞、生物活性材料打印的生物3D打印机为制作高精度组织工程支架提供了可能。在多种种类的生物3D打印机中，气压挤出式3D打印机由于便于材料储存、不损伤细胞材料、打印精度高、成型速度快、成型过程无污染等优点，受到企业和科研机构的青睐，特别是气压挤出式生物3D打印机在成型制备过程中不涉及化学变化，使成型的实体保持原有的理化性质。气压挤出式生物3D打印机可根据需求配置多种功能大打印喷头，在常规的制作流程中，打印喷头具有一定范围内的温控功能，根据需求在适当的温度下对凝胶状、浆料状的原材料施加气压压力，使材料从打印喷头挤出，数控电机根据预先设置的移动轨迹打印出特定的一层形状后，再上升一个平面开始打印第二层，这样依次层层堆叠，在工作平台上搭建出立体三维结构。利用3D打印技术实现人造骨修复材料的三维多孔支架的制备，是骨修复工程中前沿且重要的一部分，它可以负载干细胞，有利于干细胞的生长、分化，在特定的条件下促成新骨组织形成，提高成骨效果，实现良好的骨修复作用。

种子细胞是构建工程化组织不可缺少的一个重要部分，通过种子细胞的增殖分化成特定种类的细胞，为组织工程支架提供特定的细胞种类的生理功能。因此，获得适当类型、足够数量、增殖旺盛、不引起免疫排斥反应的种子细胞是构建工程化组织的前提和基础。干细胞在组织工程中被广泛用作种子细胞，它一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种类型的细胞。随着干细胞体外分离、培养和扩增技术日渐成熟, 干细胞作为组织工程种子细胞的研究已经获得了广泛的认可，取得了许多突破性的科研进展。

间充质干细胞是一类来源于发育早期中胚层的多能干细胞，具有分化为真皮组织、肌肉组织、骨骼及其他***和循环系统的潜能。以来源于骨髓的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal stem cell, BMSCs)为例，BMSCs在不同的诱导条件下，可分化为骨、软骨、脂肪组织等间质组织，它的多向分化能力尤其是成骨方向的分化，使其在骨组织工程研究中具有独特的优势，可用于培养新生骨组织，实现骨损伤愈合。BMSCs具有取材方便，体外分离培养方法简便的有点，经过数代扩增后仍具有分化能力,自体获取的BMSCs回输到体内后免疫排斥反应较小，不受伦理限制，被认为是骨组织工程的重要种子细胞。

发明内容

在本发明中，通过参数化三维建模方法，设计了一种模拟松质骨骨小梁结构的支架模型，实现了支架模型可调控微孔数量、微孔大小、孔隙率、孔壁形态等支架参数。运用水热法制备了β-磷酸三钙粉体并以此为主要原料，通过3D打印技术制备了仿生支架和网格支架。通过磷酸二氢铵煅烧处理牛股骨，制备了余物为高纯度β-磷酸三钙的松质骨支架。对仿生支架、网格支架、松质骨支架进行了表征检测和结构分析，进而附着骨髓间充质干细胞并诱导成骨分化，植入SD大鼠颅骨缺损8周，评价三种支架的体外生物相容性和体内骨再生效果，探究不同的支架仿生结构对细胞增殖粘附和体内骨修复效果的影响。

本研究创新性地通过3D-Voronoi算法和随机分布微孔算法构建了新型仿生支架模型，并运用生物3D打印技术制作了高精度的该组织工程支架。运用磷酸二氢铵二次煅烧法煅烧牛股骨，在实现异体骨脱脂脱钙去抗原的基础上，去除了羟基磷灰石等无机成分，使余物为高纯度的β-磷酸三钙，保留了天然松质骨形态的同时消除了实验中因基质材料带来的变量差异。通过表征检测、结构分析、体外实验、体内植入等多种实验，全面地评价不同支架结构对细胞增殖粘附和体内骨修复效果的影响，为骨组织工程支架的仿生结构设计提供了可靠支架模型和有效检测手段。

附图说明

图1-1 2D-Voronoi算法示意图。

图1-2 仿生支架建模过程。

图1-3仿生支架的结构参数调控。

图1-4 β-磷酸三钙粉体的红外吸收光谱。

图1-5 β-磷酸三钙粉体的X射线衍射图谱。

图1-6 β-磷酸三钙透射电镜图片。

图2-1经磷酸二氢铵煅烧的天然松质骨支架。

图2-2 支架模型三维重建。

图2-3不同结构支架的压缩模量。

图3-1 骨髓间充质干细胞培养（×50）。

图3-2 Giemsa染色（左：×100，右×200）。

图3-3 DNA含量检测。

图3-4碱性磷酸酶活性检测。

图3-5 RT-PCR检测成骨分化相关基因。

图4-1 Micro-CT扫描及三维重建。

图4-2 OCN免疫组化染色。

图4-3 番红固绿组织学染色。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1 松质骨仿生支架的设计及制备

1.1松质骨仿生支架三维建模

Rhinoceros是一款常用的参数化三维模型设计软件，在本研究中，通过Rhinoceros 5软件( v.5.1.30103.145)和Grasshopper插件(v.August-27, 2014)算法功能设计具有可控结构的松质骨仿生模型。

本研究设计的仿生支架主要运用了三维的Voronoi算法，Voronoi图又叫泰森多边形，在单一平面内，在相邻两个点的连线中点做垂线，这些垂线把每个点分割成独立的区域。若将Voronoi算法运用于三维空间，则是在相邻两各点的连线中点做垂直面，这些垂直面将每个点围成一个独立的空间。将Voronoi算法用于构建多孔支架，其基本原理是以空间内分布的一定数量的点为中心形成微孔，围绕在微孔周围的垂直面经过形态转化形成具有连通通道的孔壁(图1-1)。

具体建模方法如下：首先，设定支架的形状和边长轮廓，由此得知支架的总体积（TV），通过Populate 3D指令在支架内设定随机分布的点，代表支架内的微孔（MP），点的数量可通过Number Slider指令进行增减（图1-2A）；通过Voronoi 3D指令，在支架中微孔的周围生成若干个围绕微孔的平面（图1-2B）；对每两个平面相交除线段进行赋值，将这些线段转化为具有体积的棱柱（图1-2C）；去除支架内的平面参数和点参数，保留棱柱，形成支架的骨架结构（图1-2D）；通过Weaverbird's Loop指令，对支架骨架结构进行***柔化，增大支架的内部表面积（图1-2E）；保存支架模型并导出为STL格式（图1-2F）。

因为仿生支架内微孔的大小、形态和分布是不规则的，因此导致孔壁形态、厚度也不均匀。根据软件功能，可以计算仿生支架的体积（BV）。因而，我们通过公式求得支架的理论孔隙率（P）：

对于支架内微孔的孔径大小（Φ），我们将微孔形状看作近似的球体，根据以往研究550-700um孔径更有利于成骨细胞的增殖和分化，因此将孔径设定为600um，根据调节支架内微孔数量（NMP）来实现对孔径的调控，计算参照以下公式：

1.2水热法制备β-磷酸三钙粉体与初步表征检测

本研究采用水热法合成β-磷酸三钙，将Ca/P物质的量比为1.5的比例将硝酸钙[Ca(NO₃)₂·4H₂O]和磷酸二氢铵[(NH₄)₂HPO₄]分别溶于500mL蒸馏水中，讲(NH₄)₂HPO₄溶液缓慢滴加到Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液中，在40℃水浴下，通过滴加氨水维持溶液pH=6。滴定完成后继续搅拌5h，然后陈化24h后过滤，分别用蒸馏水和乙醇洗涤，置于真空干燥箱中干燥。干燥后样品置于马弗炉中900℃煅烧4h。研磨后得到白色β-磷酸三钙粉末。

1.2.1红外光谱分析

β-磷酸三钙物质构成的定性分析使用傅里叶红外光谱仪进行检测。去少量β-TCP(0.002 g)与KBr(0.15 g)混合研磨成均匀粉末后压片，扫描范围4000-400cm^-1。

1.2.2 X射线衍射检测

采用X射线衍射分析仪（CuKα）进行测定。设定电子束能量为40kV，电子束电流为50mA，步宽（2θ）0.02°，扫描速度10°/min，扫描范围10°-80°。

1.2.3透射电子显微镜检测

β-磷酸三钙的粒径和微观形貌通过透射电子显微镜进行观察，操作电压为80kV。将粉体样品在乙醇中分散，超声1h后取样进行电镜分析。

1.3 3D打印技术制备支架

本研究使用3D bioplotter生物3D打印机（图 2-4）进行支架的打印制备。打印前，将β-磷酸三钙粉末再次研磨，与聚乙烯醇溶液[ω（PVA）= 10%]充分混合制成浆料。将原料导入料仓，选用超精细喷嘴（Φ= 100μm），在0.45MPa的压力下进行打印。

使用3D打印技术制备的支架有两种，一种是根据步骤2.3设计并导出的仿生支架STL模型，通过软件进行模型切片分层；另一种是生物3D打印系统Visual Mechanic软件自带的0°/90°网格结构的组织工程支架。

打印后从工作平台上取下支架，在90℃过夜干燥后，马弗炉500℃烧结3h以去除聚乙烯醇溶剂。随机抽取一个支架研磨成粉，重复上述步骤进行红外光谱和X射线衍射检测。

1.4实验结果

1.4.1 松质骨仿生支架三维建模

利用Rhinoceros软件参数化设计的仿生支架，根据一系列软件算法生成了类似松质骨骨小梁网的多孔结构，仿生支架的结构参数可以通过软件指令进行调整，在本研究中，通过参数话设计实现了仿生支架的微孔数量（NMP）可控（图1-3A）、孔壁厚度可控（图1-3B）、微孔通道大小（Φchannel）可控（图1-3C）、支架形态可控（图1-3D）。

进而分析因支架结构参数变化导致的支架体积变化和表面积变化：当孔壁、孔道参数不变时，增加支架内的微孔数量，支架的体积下降，孔隙率相应提高，表面积增大，孔径减小；当支架内微孔数量恒定时，使孔壁变薄变细，会使支架的体积下降，孔隙率则相应提高，表面积变化细微，孔径相应增大；当支架内微孔数量和孔壁形态恒定时，单独改变微孔通道的大小，微孔通道的缩小会使支架体积细微上升，孔隙率则细微下调，此时支架表面积增大较为明显，对孔径的影响也较为细小。

最终，根据以往组织工程支架结构研究，并结合3D打印机的成型精度，选择尺寸为高度2mm、直径6mm，微孔数为360个，理论孔隙率为70%的薄片状多孔支架用作后续的体外生物相容性研究和体内植入实验；选择尺寸为边长10mm，微孔数为6364各，理论空隙率为70%的立方体块状多孔支架用作支架结构分析。

1.5红外光谱分析

通过水热法制得的白色粉体的红外吸收光谱如图1-4。

从红外光谱的分析结果上来看，1042cm^-1、603cm^-1、579cm^-1的波数对应磷酸根基团的特征峰，3420cm^-1处有羟基官能团，与β-磷酸三钙红外光谱的标准谱图有较好的一致性。

1.6.1 X射线衍射检测

X射线衍射测定结果如图1-5。

样品图谱的特征主峰2θ=31.0°，次强峰2θ=27.8°、34.5°、16.9°，与标准比对卡（JCPDS 09-0169）特征峰全部吻合，说明生成产物为β-磷酸三钙。

1.6.2透射电子显微镜检测

透射电子显微镜观察结果如图1-6。

β-磷酸三钙的透射电子显微镜观察结果显示β-磷酸三钙颗粒粒径呈纳米级，形态规则、大小均匀，晶体粒径范围为50-300nm，分体颗粒呈现少量的团聚现象。

1.6.3 3D打印制备仿生支架

β-磷酸三钙粉体经过与聚乙烯醇混合，成浆料状，经过生物3D打印机制成高2mm，直径6mm的薄片支架和边长10mm的立方体方块支架两种规格。3D打印技术良好的保持了模型的复杂立体结构，打印的支架具有贯通的多孔结构，同时仿生支架和网格支架都保持了多孔支架复杂的几何结构。打印完成的支架由工作平台上取下，放入干燥箱中90℃干燥过夜，干燥后支架仍保持原有结构，未发生较大的体积和形态变化，无开裂、破损变化。随机抽取的支架研磨成粉体后经过红外光谱和X射线衍射检测，显示支架材料仅为β-磷酸三钙，聚乙烯醇已完全去除。

1.7 小结

本章通过参数化三维建模设计了可控制支架参数结构的松质骨形态多孔仿生支架，根据以往关于组织工程仿生支架结构的研究，选择了600um的孔径大小，和较高的70%的孔隙率，用于后续研究。并以水热法制得的β-磷酸三钙为原料，使用气压挤出式高精度3D打印方法晶型逐层打印、层层叠加制备成型，最终制备得到松质骨仿生支架和0°/90°网格支架。为了确定水热法制备的粉体以及干燥后的支架为β-磷酸三钙材料，对材料进行了红外光谱、X射线衍射、透射电镜检测，结果表明支架材料为纳米级β-磷酸三钙，能很好的应用满足骨组织工程材料的需要。

实施例2磷酸二氢铵法煅烧天然牛松质骨及支架结构检测

2.1磷酸二氢铵法煅烧牛松质骨骨块

2.1.1 骨块准备及预处理

从本地市场购得新鲜成牛股骨，用钢锯从股骨的两端锯下股骨颈以上、内外侧髁，常温常压下用0.5M/L氢氧化钠浸泡3h，煮沸30min，用钢锯锯成10×10×10mm大小松质骨骨块若干，再用0.5M/L氢氧化钠浸泡24h，烘干。

2.1.2 磷酸二氢铵法煅烧骨块

将骨块置于马弗炉中，缓慢升温（6℃/min）至900℃，维持4h，待冷却后取出。用0.5M磷酸二氢铵浸泡24h，烘干后再置于马弗炉中，缓慢升温（6℃/min）至1000℃，维持4h。待冷却后取出，随去抽取煅烧骨一块，研磨成粉体，进行后续材料表征检测。

2.1.3 红外光谱分析

煅烧骨物质构成的定性分析使用傅里叶红外光谱仪进行检测。去少量β-TCP(0.002 g)与KBr(0.15 g)混合研磨成均匀粉末后压片，扫描范围4000-400 cm^-1。

2.1.4 X射线衍射检测

采用X射线衍射分析仪（CuKα）进行测定煅烧骨成分。设定电子束能量为40kV，电子束电流为50mA，步宽（2θ）0.02°，扫描速度10°/min。

2.2 支架结构检测

2.2.1 Micro-CT扫描及三维重建

将3D打印制备的松质骨仿生支架、0°/90°网格支架、煅烧骨支架用Micro-CT进行扫描，Micro-CT的操作电压设置为80kV，电流为200mA，扫描层厚为48μm。扫描后用Mimics（v17.0）软件导入CT影像进行三维图像重建。

2.2.2 扫描电子显微镜检测

利用扫描电子显微镜观察三种不同结构支架的微观结构。真空干燥支架后喷金，操作电压设置为15kV。

2.2.3 力学性能检测

取三种不同结构的支架置于万能材料试验机两加载头之间，10KN传感器，加载速度1.0mm/min，压缩3.0mm时加载停止，得到应力应变的测试结果。通过拟合应力应变曲线（初始5%）的斜率作为压缩模量。

2.3实验结果

经过磷酸二氢铵二次煅烧的松质骨骨块呈白色，肉眼可见存在大量不规则的多孔腔隙，提示经磷酸二氢铵煅烧处理的牛股骨，保留了松质骨的多孔结构（图 2-1）。

红外光谱和X射线衍射结果说明，通过对比β-磷酸三钙的红外特征峰和X射线衍射标准比对卡，发现天然松质骨经过磷酸二氢铵法煅烧后的余物为高纯度的β-磷酸三钙。

经过Micro-CT扫描并三维重建的支架模型（图2-2），通过Rhinoceros 5软件剪裁支架模型为10×10×10mm大小，通过软件分析支架的体积、表面积、微孔连通率等结构参数，分析结果如表 2-3。

表 2-3支架几何构结构参数比较（n=20，±S）

Table.3-3 Comparison of the geometric structure parameters of thescaffolds（n=20，±S）

项目	仿生支架	网格支架	煅烧骨
				孔隙率（%）	68.60±3.16	53.01±2.26	66.53±13.07
表面积（mm<sup>2</sup>）	5910.47±501.26	4614.10±253.88	7521.41±1428.70
				微孔连通率（%）	97.52±2.33	100±0.00	92.77±3.09
孔径大小（μm）	535.2±113.51	836.11±37.01	339.40±59.72
				微孔形状	不规则球形	圆柱形	不规则腔隙

松质骨仿生支架、0°/90°网格支架、煅烧骨支架，三种不同结构的支架在相同尺寸大小下，表现出不同的结构参数：仿生支架的孔隙率为68.60±3.16%，复合参数化设计的理论空隙率70%，且和煅烧骨支架的孔隙率66.53±13.07%相近，两组的差异无统计学意义（p=0.35>0.05），网格支架的孔隙率较低，为53.01±2.26%，与另外两组差异有统计学意义（p<0.05）；煅烧骨支架的表面积7521.41±1428.70mm²为三组中最大，仿生支架的表面积次之，为5910.47±501.26mm²，网格支架的表面积最小，为4614.10±253.88mm²；微孔连通率通过和10×10×10mm大小的立方体实体进行布尔运算后分析，网格支架的微孔连通率为100%，仿生支架为97.52±2.33%，煅烧骨支架为92.77±3.09%。

根据Micro-CT数据三维重建的支架模型结构分析，可见仿生支架和煅烧骨支架都有较高的孔隙率和表面积，较高的孔隙率意味着单位体积的支架中会有更多的空间，有利于负载大量的细胞、细胞外基质和生长因子，而较大的表面积以为着有更大的面积可以供细胞进行增殖和粘附；网格支架的孔隙率和表面积较低，但微孔联通率为100%，即支架中没有密闭的空腔，有利于支架内细胞的生长、营养物质的运输、废物的排出。但仿生支架的微孔联通率未达到100%，和参数化模型的无密闭空腔的结构不符，考虑是因仿生支架模型较网格支架更为精细、复杂，在3D打印成型的过程中，可能因为材料塌陷、材料挤出不均匀、支架烧结时产生细微形变，从而造成少量支架存在少量密闭空腔。而网格支架因为结构简单，支架受重力影响造成材料塌陷的情况不明显。煅烧骨支架内存在密闭空腔的原因，考虑一是因为在煅烧过程中，因为有机物质被烧结，骨组织的无机成分也受到了一定程度的破坏，因此产生了密闭空腔。二是因为Mimics软件建模后因为煅烧骨支架内部结构复杂，重建的三维模型出现了模型大面积融合，未能将部分相邻的骨小梁区分开，造成了三维模型中的密闭空腔。

不同的支架结构对其力学性能有一定影响，三组支架的压缩测试结果如图 2-3所示。网格结构较仿生支架和松质骨支架具有更高的压缩模量，为19.83±0.37MPa，仿生支架的压缩模量为12.60±4.05MPa，煅烧骨支架的压缩模量较低，为6.28±1.19MPa。

网格结构的材料纤维走向规则而紧密，在压缩试验中表现出来的承重能力更强，且根据结构参数比较，在相同体积下网格支架的孔隙率较低，因而所含材料较多，因此在压缩试验中表现出更高的模量。仿生支架和煅烧骨支架因材料纤维是无序、不规则的，且孔隙率较高，因此在压缩试验中表现出较低的压缩模量，造成煅烧骨支架的压缩模量低的原因，考虑到还可能因为煅烧使得有机物流式，造成骨组织部分松散、缺失，使得力学性能较差。另一方面，因β-磷酸三钙生物陶瓷原本的机械性能较差，因而三种β-磷酸三钙材料支架表现出的力学性能都不可观。

2.4 小结

本章内容通过磷酸二氢铵二次煅烧法处理牛股骨，经材料表征检测，获得了高纯度的β-磷酸三钙天然松质骨支架，证明磷酸二氢铵二次煅烧法除了牛股骨可作为成熟的制备β-磷酸三钙天然松质骨支架的实验方法。并由此把第2章中制备的仿生支架、网格支架的支架材料进行了统一，排除了无关变量，基于以上的研究分析，通过Micro-CT扫描和三维重建，以及抗压测试，对支架的架构参数和力学性能进行了研究。

本章研究表明，松质骨仿生支架和煅烧骨支架都拥有较高的孔隙率和表面积，优于传统组织工程使用的网格支架结构，说明松质骨仿生支架在结构参数上和天然松质骨组织相近，虽然形态上存在一定差异，但其出色的结构特征可为其用作组织工程支架模型提供理论依据。

实施例3体外生物学评价

3.1大鼠骨髓间充质干细胞提取及培养

选取4周龄雄性SD大鼠1只，采用颈椎脱臼法处死，0.5%碘伏浸泡3min消毒后在无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，用低糖DMEM培养液冲出骨髓，所得细胞悬液在2000r/min转速下离心10min。后用15mL含10%胎牛血清，1%双抗的DMEM培养液重新悬浮，以1×10⁸L^-1密度接种于25cm²培养瓶中，置37℃、CO2恒温培养箱中培养。接种24h后首次半量换液，以除去未贴壁细胞。以后每3d全量换液1次。待贴壁细胞生长融合达90%以上，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养，按1∶3的比例传代培养。

3.2 Giemsa染色

在倒置相差显微镜下，自原代培养开始动态观察骨髓间充质干细胞在生长过程中的形态变化并拍照。将第2代细胞调整细胞浓度至5×10⁷L^-1，接种到24孔细胞培养板中，每孔接种0.75mL。待细胞分布均匀、约90%融合时，磷酸盐缓冲液清洗3次，甲醇固定10min，Giemsa染液染2min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。

3.3细胞接种于支架共培养

将三种不同结构的支架浸泡于70%的乙醇中2h，除去乙醇，用碱性磷酸酶缓冲溶液充分清洗，紫外光照射30min灭菌，转移至24孔组织培养板中，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液浸泡24h，将第2代细胞调整细胞浓度至5×10⁷L^-1，接种到24孔细胞培养板中，每孔接种1mL，孵育2h后，再在每孔中加入1mL全培。

3.4 DNA含量测定

在接种至支架1、7、14和21天后，根据PicoGreen dsDNA检测试剂盒说明，通过检测每个样品的DNA含量来进行细胞增殖检测。在24孔板中含样品的各孔中加入含5mM EDTA、5mM L-半胱氨酸、0.1M磷酸缓冲液、木瓜蛋白酶消化液（400lg/mL）在pH为6的环境下消化。加测试缓冲液补足到100μL，再向每孔中加入100μL PicoGreen反应试剂。用多功能酶标仪检测吸光值，采用双荧光激发，激发波长为360nm各460nm。对照标准DNA含量曲线计算出样品DNA含量。

3.5活/死细胞染色

在接种至支架1、7、14和21天后，去除培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗两次，将染色剂（1mMLive-Dye和205mg/mL 碘化丙啶）每孔加入0.25mL，于37℃二氧化碳恒温培养箱中孵育20分钟。除去染色剂，用磷酸盐缓冲液充分清洗，于倒置荧光显微镜下观察。

3.6成骨诱导分化

SD 大鼠骨髓间充质干细胞培养至***时用胰酶消化，以5×10⁷L^-1的细胞密度接种到每个支架上面，转移至37℃二氧化碳培养箱中培养3 h，使细胞粘附在多孔支架上面。3h之后往每个孔里面加1.0 mL含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全生长培养基，并在37℃二氧化碳培养箱中继续培养。24h之后将DMEM完全生长培养基更换为含10%胎牛血清和1%青/链霉素双抗，以及浓度为100 nM的***，10μg/mL的维生素C，10 mM的β-甘油磷酸钠的DMEM培养基。

3.7碱性磷酸酶活性检测

在成骨诱导1、7、14和21天后，通过对-硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶活性。将孔板中的培养基去除，用磷酸盐缓冲液冲洗2次，将样品取出后转移到2mL离心管中，加入对硝基酚溶液在37℃裂解2h，测量405 nm波长的吸光值，对照ALP标准曲线计算碱性磷酸酶活性。

3.8成骨相关基因表达检测

在成骨诱导1、7、14和21天后，测定细胞-支架表达成骨相关基因的水平，包括转录因子2（Runx2）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、I型胶原蛋白（COL1A1）。将孔板中的培养基去除，用磷酸盐缓冲液冲洗2次，液氮冷冻后将样品磨碎成粉末，用TaKaRa MiniBEST RNA提取试剂盒总提细胞RNA，使用PrimeScript^TM RT Master Mix试剂盒进行cDNA合成。逆转录完成后加入特定的成骨相关基因引物于实时荧光定量PCR分析仪中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达（GAPDH）作为一种内源性控制的管家基因，利用2^−ΔΔCT法计算相关基因的表达。引物列表见表3-2。

表3-2 qRT-PCR引物表

3.9统计学方法

应用SPSS（v17.0）进行统计学处理，以P<0.05为显著性标准。（*：P<0.05，**:P<0.01）

3.10实验结果

从SD大鼠骨髓腔冲洗分离的细胞经过第一次传代后培养24、48h于倒置相差显微镜下观察，少量细胞贴壁生长，尺寸大小均一，形状为长梭形，培养4d后细胞呈现纤维细胞样集落生长。部分时间点细胞培养图片见图 3-1。

培养1d后对细胞进行Giemsa染色，结果如图 3-2，细胞核染成***，细胞质和核仁染成蓝紫色。

DNA含量检测结果如图 3-3。骨髓间充质干细胞在不同结构支架上的增殖情况通过DNA含量检测来测定，结果显示，经过21天的培养过程，在三组支架上表现出的DNA含量都随着时间的推移表现出了持续上升的趋势。其中在14、21天时，仿生支架上的DNA含量比网格支架和煅烧骨支架上的含量高出很多。网格支架在1、7天表现出更高的DNA含量，说明对于早期的细胞粘附有促进作用，表现出更高的初始粘附率。煅烧骨支架上细胞在1、7天表现的DNA含量较低，考虑因为支架具有较大的表面积，粘附细胞的初始密度较高，一部分细胞在接种到支架后出现了细胞凋亡，表现为1、7天DNA含量较低，14、21天DNA含量显著上升。

骨髓间充质干细胞在不同结构支架上的存活情况通过活/死细胞染色来测定，结果显示，在不同结构支架上SD大鼠骨髓间充质干细胞表现的细胞粘附效果不同。在不同时间点，细胞粘附数量和DNA含量结果相似，实验结果表明骨髓间充质干细胞在支架上凋亡后因不能粘附在支架上而脱落并被洗涤去除。随着培养时间的增加，骨髓间充质干细胞逐渐由粘附在支架表面转向支架内部迁移，支架表面的细胞粘附数量较内部多。实验表明三种结构的支架均适合骨髓间充质干细胞粘附和迁移。

碱性磷酸酶活性结果如图3-4。骨髓间充质干细胞经成骨诱导，通过碱性磷酸酶活性测定来检测成骨分化效果。结果显示，碱性磷酸酶活性在21天里经过了先升后降的变化，在不同结构支架上培养到14天后，碱性磷酸酶活性达到最大值，其中煅烧骨支架上表现的碱性磷酸酶活性最大，仿生支架次之，网格支架最小。继续培养到21天，碱性磷酸酶活性降低。

成骨相关基因表达结果如图3-5。骨髓间充质干细胞经成骨诱导，通过检测成骨相关基因转录因子2（Runx2）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、I型胶原蛋白（COL1A1）的表达水平变化来检测成骨分化效果。Runx2的表达在三种不同结构的支架上都经历了先升后降的趋势，在7天达到最高值，最后逐渐下降。OCN的表达在三种不同结构的支架上都经历了先升后降的趋势，在培养14天后表达达到最高值，仿生支架的OCN表达两明显高于煅烧骨支架和网格支架。在网格支架和煅烧骨支架上，OPN的表达水平呈现逐渐上升趋势，在培养后21天达到最高值，而仿生支架的OPN表达水平则是呈现先升后降趋势，在14天达到最高值，21天表达水平下调，在1、7、14天时间点，仿生支架中表达的OPN水平高于煅烧骨支架和网格支架。COL1A1的表达在三种不同结构的支架上都经历了逐渐上升的趋势，其中煅烧骨支架表现出的表达水平略高于仿生支架，明显高于网格支架。

3.11 小结

本章研究通过分离提取SD大鼠的骨髓间充质干细胞并进行体外培养和鉴定，实验表明提取的骨髓间充质干细胞生长良好，增殖旺盛，具有成骨分化的潜能。在接种于三种不同结构支架以后进行成骨诱导分化，经过21天的体外共培养，三种支架均表现出了良好的细胞生物相容性，在初步的体外成骨诱导分化实验中，不同结构的支架表现出了不同成骨的成骨分化潜能，具体来说，仿生支架比煅烧骨支架和网格支架表现出了更加优异的骨髓间充质干细胞成骨分化潜能。

实施例4动物实验

4.1动物实验分组及造模

本动物实验研究已获得南方医科大学实验动物中心批准，实验选用16只10周龄的Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠作为实验动物，麻醉后用直径为6mm的环钻在颅骨中央区域钻出6mm直径的圆形缺损，钻出的颅骨厚度约2mm，将第2章制备的高2mm，直径6mm的薄片状仿生支架和网格支架，以及打磨剪裁成同样大小的煅烧骨支架与骨髓间充质细胞共培养并诱导成骨分化后用于植入。

16只大鼠分为4组，每组4只大鼠，分为仿生支架组、网格支架组、煅烧骨支架组和空白对照组。前三组分别植入负载了细胞的仿生支架、网格支架和煅烧骨支架，第四组仅制造骨缺损后缝合，不植入材料。植入大鼠体内4周和8周后将大鼠处死进行进一步研究。

4.2颅骨缺损修复动物实验

麻醉前称重，按照75mg/kg***、10mg/kg甲苯噻嗪给予腹腔注射麻醉。麻醉后备皮消毒，在无菌条件下进行手术，沿颅骨中线切开皮肤，牵拉皮肤暴露视野。用直径6mm换钻在颅骨中央区域钻孔，造成6mm圆形颅骨缺损。用无菌生理盐水固定冲洗下去除缺损颅骨，对缺损区域边缘进行检查，确定无残留骨。根据分组放入支架进行填充修补，支架放置与硬脑膜接触，防止完毕缝合软组织及皮肤。术后分笼饲养。

在4周、8周两个时间点，每一次选取每组各2只大鼠，麻醉过量死，用10%多聚甲醛在4℃进行固定，用作进一步研究。

4.3 Micro-CT分析

实验动物水平放置在样品架上进行Micro-CT扫描，扫描参数为：电压59kV，电流167mA，扫描层厚18um，扫描后选择骨缺损区域用Micro-CT骨分析的软件软件进行骨矿化密度分析。将Micro-CT图像数据导入Mimics（v17.0）软件进行三维图像重建。

4.4 免疫组化分析

取出的大鼠颅骨用4%多聚甲醛固定24小时后，用10%的EDTA在4℃进行脱钙，梯度浓度酒精进行脱水，浸蜡并包埋，在骨缺损区域中央由近向远中纵切，每个样本10张切片，进行组织染色和免疫组化染色。

4.5.1 H&E染色

脱蜡的样品切片放入苏木素染液中染色8 min后自来水冲洗，用1%盐酸酒精分化数秒后自来水冲洗，用0.6%氨水返蓝后流水冲洗。切片入伊红染液中染色2min。再将切片依次用95%乙醇、无水乙醇脱水各3min，浸入二甲苯I、II中透明各5min后晾干，用中性树胶封片在显微镜下进行观察拍照，采集图像信息并分析。

4.5.2 OCN染色

脱蜡的样品切片加入蛋白酶K溶液在37℃下孵育10 分钟，用pH 为7.4三乙醇胺缓冲盐水溶液（Tris-HCl缓冲盐溶液，pH为7.4）清洗3次，用含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液清洗2次。用含1%牛血清白蛋白的三乙醇胺缓冲盐水溶液封闭1h，三乙醇胺缓冲盐水溶液清洗。加入浓度为10μg/mL的OCN一抗，在4℃下孵育12h。用含0.2%吐温20的三乙醇胺缓冲盐水溶液清洗3次，加入浓度为5μg/mL的OCN二抗，常温孵育2h，再用0.2%吐温20的三乙醇胺缓冲盐水溶液清洗3次，加入浓度为1.0μg/mL的DAPI室温孵育3分钟。用三乙醇胺缓冲盐水溶液清洗后，在显微镜下进行观察拍照，采集图像信息并分析。

4.5.3 番红-固绿染色

脱蜡的样品切片放入苏木素染液中染色3min后自来水冲洗，用1%盐酸酒精（70%乙醇配制）分色15s后自来水冲洗，放入0.02%固绿染液中染色3min后用1%冰醋酸洗涤去出残留固绿，放入0.1%番红O染液中染色3min。依次用95%乙醇、无水乙醇脱水各3min，浸入二甲苯I、II中透明各5min后晾干，用中性树胶封片在显微镜下进行观察拍照，采集图像信息并分析。

4.5.4 CD31染色

对脱蜡的样品切片进行CD31特异性抗原染色。CD31一抗按1:100稀释配制工作液。用3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，0.01 M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波加热修复；用含1%牛血清白蛋白的三乙醇胺缓冲盐水溶液封闭1h，滴加CD31一抗工作液在4℃孵育12h。恢复至室温后用磷酸缓冲液洗涤，滴加相应二抗，DAB显色。在显微镜下进行观察拍照，采集图像信息并分析。

4.6 实验结果

麻醉及手术进行顺利，钻孔边缘平滑规整，去除缺损颅骨完整，术中硬脑膜完好，未破坏脑组织。术后予分笼饲养，给予止痛、抗感染喂食护理。

Micro-CT扫描和Mimics重建结果如图 4-1。三种不同结构支架在植入SD大鼠颅骨缺损4周后均有新骨组织形成，均可见新骨组织沿支架多孔孔隙长入，仿生支架和煅烧骨支架有更多新骨组织生长，空白对照组缺损区域、缺损区域边缘未见新骨组织生长。植入SD大鼠颅骨缺损8周后新骨组织生长体积更大，仿生支架组新骨组织几乎涨满整个支架孔隙，煅烧骨支架组新骨生长体积次之，网格支架组新生长体积再次之，空白对照组依旧未见新骨组织生长。

骨缺损新骨长成部位的骨矿化密度分析结果显示仿生支架组边线处更高的骨矿化密度，说明仿生支架结构有出尽新骨形成的效果，表现出更加良好的骨修复效果。

H&E染色用来检测成纤维细胞，软骨细胞和网状原始骨的形成以及其各自的形态。染色结果呈现为新骨组织被染成深粉红色，肥厚性软骨细胞则被染成紫色，成纤维细胞被染成棕色。

OCN染色结果如图4-2。染色呈阳性反应胞浆可见棕黄色颗粒分布，细胞核周围浓染，部分细胞核被棕黄色颗粒覆盖，其他细胞可见蓝色细胞核。

番红固绿染色结果如图4-3。可见绿染的骨组织和红染的软骨组织分布，新生的骨、软骨组织排列紊乱。空白对照组未见阳性染色，仅可见淡然的炎性细胞，未见骨组织和软骨组织修复。

CD31染色结果可见新生的骨组织中有少量阳性染色的呈环状排布的血管内皮细胞，管腔内的血小板也显示阳性染色

4.8小结

本章内容通过动物植入实验，运用影像学三维重建和组织学、免疫组化染色，分析不同结构支架对体内成骨效果的影响。通过Micro-CT与三维重建的分析结果可以显示，随着时间的延长，三种结构的支架均表现出了良好的成骨效果，其中仿生支架的成骨效果最优，在第8周时可见骨缺损区域的支架内部几乎长满了新生的骨组织，证明了仿生支架的三维支架结构有利于在植入骨缺损区域后引导骨组织生长。

同样，免疫组化和组织学染色也印证了仿生支架的出色体内成骨效果。并且通过CD31免疫组化染色，可见仿生支架内部有血管组织的生成，实现了组织工程骨有效的血管化，为新生骨组织的稳固生长、支架材料的逐步代谢、周围组织的物质交换提供了可能。