阅读说明：本技术 2-吡啶甲酰胺类化合物的制备及应用 (preparation and application of 2-pyridine carboxamide compound ) 是由 唐启东 郑鹏武 朱五福 熊荷花 段永丽 张建清 邱玉凤 于 2019-03-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及Ⅰ式所示的2-吡啶甲酰胺类衍生物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和前药,其中取代基R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、X、Y具有在说明书中给出的含义。本发明还涉及通Ⅰ式的化合物具有强的抑制FLT-3激酶的作用,并且还涉及该类化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药在制备治疗由于FLT-3激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途,特别是在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。(The invention relates to 2-pyridine carboxamide derivatives shown as formula I, and pharmaceutically acceptable salts, hydrates, solvates and prodrugs thereof, wherein a substituent R 1 、R 2 X, Y have the meaning given in the description. The invention also relates to a compound of the general formula I, which has strong FLT-3 kinase inhibition effect, and also relates to application of the compound and pharmaceutically acceptable salts, hydrates, solvates or prodrugs thereof in preparing medicaments for treating diseases caused by abnormally high expression of FLT-3 kinase, in particular to application in preparing medicaments for treating and/or preventing cancers.)

2-吡啶甲酰胺类化合物的制备及应用

技术领域

本发明涉及新的2-吡啶甲酰胺类化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或其前药的制备方法以及含有所述化合物的药物组合物，及其在制备治疗和/ 或预防癌症的药物中的用途。

背景技术

AML(急性髓性白血病)是由骨髓造血祖细胞的恶性增殖引起的疾病，其总发病率为每10万人4.1例。细胞遗传学水平的复杂发病机制和预后特征增加了治疗急性髓性白血病的风险。

FLT-3(FMS样酪氨酸激酶)是干细胞酪氨酸激酶，是III型受体酪氨酸激酶家族的成员。研究人员发现FLT-3蛋白在大多数AML患者中高表达，并极大地促进了造血干细胞的存活和增殖。FLT-3蛋白的基因位于染色体13q12，属于III型受体酪氨酸激酶(RTK)家族，与KIT、FMS及血小板源生长因子受体(PDGFR)具有高度结构同源性。FLT-3在造血祖细胞的生长和分化过程中有着确切的作用。FLT-3的表达通常限定在CD34⁺胞中，在这种细胞中其配体几乎无处不在，像其他RTKs一样， FLT-3受体与配体的结合导致受体在细胞膜上形成二聚体，致使自身磷酸化，激活一系列下游信号传导途径如RAS/MEK/PI3K/AKT/mTOR和STAT-5通路，它们在促进细胞周期进程，抑制细胞凋亡和促进细胞分化过程中有着多种作用。突变的FLT-3 通常表现出较高的活性，并失去了与CD34⁺的关联性，且能在没有配体结合的情况下，自身磷酸化激活下游信号通路。

FLT-3基因的突变是AML中最常见的遗传改变，并且作为骨髓恶性肿瘤发展的重要驱动突变而众所周知。最普遍的FLT-3突变体是内部串联重复改变(FLT3-ITD 突变)，它影响着受体的近膜区域。FLT3-ITD突变有着不同的长度和位置，大约23％ AML患者中存在这一突变。其他重要突变发生在酪氨酸激酶结构域(FLT3-TKD) 中，通常发生在激活环(AL)残基D835，该位置的天冬氨酸被酪氨酸残基取代从而稳定了活化位点与ATP结合的构象，提高了其活性。这些突变存在于所有AML患者中的约30％，并导致更差的预后。鉴于FLT-3突变AML疗效普遍较差的现状，FLT-3 受体酪氨酸激酶靶向抑制剂的研究己经成为药物研究的重点。

为了研制出新型高效的FLT-3受体酪氨酸激酶抑制剂，本发明人对吡啶类FLT-3抑制剂化合物进行了进一步研究，对多个结构位点进行修饰和改造，合成了一系列结构新颖的2-吡啶甲酰胺类衍生物。体外抗肿瘤活性筛选试验表明，该类化合物具有抗肿瘤活性。

发明内容

本发明涉及通式Ⅰ所示的2-吡啶甲酰胺类化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中

R₁为甲基、二甲基、乙基、正丙基、异丙基、4-甲基吗啉基、氰基；

R₂选自1～4个相同或不同的氢、氟；

X为O、S；

Y为-Ar₁-Ar₂；

Ar₁为6元杂芳基，此杂芳基含有2个N的杂原子和1个O杂原子；

Ar₂为(C₆-C₁₀)杂芳基，Ar₂除与Ar₁相并外，还被有R₃取代的芳基取代；

R₃为1-2个选自氢、卤素、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、任选被卤代的(C₁-C₄) 烷基或(C₁-C₄)烷氧基、单或二(C₁-C₆烷基)取代的氨基、(C₁-C₆)烷基酰氨基、游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基、(C₁-C₆)烷基亚磺酰基、磺酰基、(C₁-C₆)烷基酰基、氨基甲酰基、被单或二(C₁-C₆烷基)取代的氨基甲酰基、(C₁-C₃)亚烷基二氧基的取代基。

本发明优选还涉及定义如下的通式Ⅰ化合物，或其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和/或水合物，其中

R₁为甲基、乙基、正丙基、4-甲基吗啉基；

R₂为H，其取代位为苯环上与X所连碳原子的邻位；

X为O；

Y为-Ar₁-Ar₂；

Ar₁为6元杂芳基，此杂芳基含有2个N的杂原子和1个O杂原子；

Ar₂为(C₆-C₁₀)杂芳基，Ar₂除与Ar₁相并外，还被有R₃取代的芳基取代；

R₃为1-2个选自氢、卤素、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、任选被卤代的(C₁-C₄) 烷基或(C₁-C₄)烷氧基、单或二(C₁-C₆烷基)取代的氨基、(C₁-C₆)烷基酰氨基、游离的、成盐的、酯化的和酰胺化的羧基、(C₁-C₆)烷基亚磺酰基、磺酰基、(C₁-C₆)烷基酰基、氨基甲酰基、被单或二(C₁-C₆烷基)取代的氨基甲酰基、(C₁-C₃)亚烷基二氧基的取代基。

本发明优选还涉及定义如下的通式Ⅰ化合物，或其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和/或水合物，其中

R₁为甲基、乙基、正丙基、4-甲基吗啉基；

R₂为H，其取代位为苯环上与X所连碳原子的邻位；

X为O；

Y为

R₃为1-2个选自氢、卤素、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基。

本发明非常特别优选的下列通式Ⅰ衍生物，包括其消旋体或旋光异构体，及其药学上可接受的盐和/或水合物，但这些化合物并不意味着对本发明的任何限制：

(1)4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-苯基-1,6- 二氢哒嗪-3-甲酰胺

(2)4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(3)1-(2-氯苯基)-4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代 -1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(4)1-(3-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代 -1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(5)4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(6)4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(7)1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(8)N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基 -1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(9)N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(10)1-(2-氯苯基)-N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基 -6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(11)N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基 -6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(12)N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(13)N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(14)1-(4-溴-2-氟苯基)-N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4- 甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(15)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(16)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(对-甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(17)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(18)1-(4-溴-2-氟苯基)-N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基 -6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(19)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(20)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(21)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(22)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基 -6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(23)1-(4-溴-2-氟苯基)-N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4- 甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(24)N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰

(25)4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(邻甲苯基)-1,6- 二氢哒嗪-3-甲酰胺

(26)4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(对甲苯基)-1,6- 二氢哒嗪-3-甲酰胺

(27)1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1,6- 二氢哒嗪-3-甲酰胺

(28)1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(29)4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-(三氟甲氧基) 苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(30)4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(31)4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(32)1-(3-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(33)1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基) 苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

(34)4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

按照本发明所属领域的一些通常方法，本发明的通式Ⅰ的2-吡啶甲酰胺类衍生物可以与酸生成它的药学上可接受的盐。酸可以包括无机酸或有机酸，与下列酸形成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、洒石酸、苯磺酸、苯甲酸或对甲苯磺酸等。此外，本发明还包括本发明化合物的前药。依据本发明，前药是通式Ⅰ化合物的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式) 被转化成相应的生物活性形式。

除非另外指出，本发明所用的术语“卤代”是指氟代、氯代、溴代或碘代；“烷基”是指直链或支链的烷基；“环烷基”是指取代或未取代的环烷基；“烯基”是指直链或支链的烯基；“炔基”是指直链或支链的炔基；“芳基”是指除去芳烃中的一个氢原子而得的有机基团，如苯基、萘基；5-10元杂芳基包括含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，其中每个杂芳基的环状体系可以是单环或多环的，环状体系是芳香性的，一共含有5-10个原子，可以举出例如咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、(1,2,3)- 和(1,2,4)-***基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、吡唑基、吡咯基、噻唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、吲哚基、喹啉基等；5-10元杂环基包括含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，其中每个杂芳基的环状体系可以是单环或多环的，但是是非芳香性的，环状体系一共含有5-10 个原子，可以任选包括1或2个碳碳双键或碳碳叁键，可以举出例如吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、噻唑啉基等。

本发明还涉及通式Ⅰ的化合物具有强的抑制FLT-3的作用，并且还涉及该类化合物及其药学上可接受的盐、水合物在制备治疗由于FLT-3激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途，特别是在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

下面合成路线1-3描述了本发明的通式Ⅰ化合物的制备，所有的原料都是通过这些反应式中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过这些反应式中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些反应式中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。

按照本发明的式Ⅰ化合物，Y为R₃如发明内容部分所定义，均可按在路线1的方法由中间体A和中间体B通过取代反应制得。

按照本发明的式Ⅰ化合物，中间体A的制备方法如路线2，其他取代基如权利要求中所定义。

按照本发明的式Ⅰ化合物，Y为中间体B的制备方法如路线3，其他取代基如权利要求中所定义。

以上三条路线中所有中间体的取代基R₁、R₂、R₃如权利要求中所定义。

具体实施方式

：

实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。化合物的核磁共振氢谱用BrukerARX-300测定，质谱用Agilent1100LC/MSD测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。

按照制备通法1，分别制得实施例1-34化合物(见表一)。

表一

实施例1

4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:455.16.

实施例2

4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:469.18.

实施例3

1-(2-氯苯基)-4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代 -1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:489.12.

实施例4

1-(3-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代 -1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:473.15.

实施例5

4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(3-(三氟甲基) 苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:523.15.

实施例6

4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

步骤一：4-氯吡啶酰氯的制备(2)

在150mL圆底烧瓶中先后加入吡啶甲酸(10g,0.081mol),NaBr(0.1g,0.001mol)和50mL氯化亚砜进行超声溶解，85℃下回流24h。将反应液冷却至室温后浓缩，加入适量甲苯待用，得到淡黄色液体为目标产物，产率约为97.5％。

步骤二：4-氯吡啶甲酸乙酯的制备(3)

在100mL圆底烧瓶中先后加入30mL二氯甲烷、乙醇(16.43g,0.17mol)和三乙胺(17.17g,0.17mol)，在冰浴条件下搅拌20min，逐滴加入上述关键中间体2(16.43 g,0.11mol)，冰浴条件下搅拌0.5h。将反应液加入到适量饱和食盐水中，再加入适量NaOH水溶液调节pH至9-10时，用二氯甲烷进行萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，加入少量石油醚，有大量淡黄色固体析出，抽滤得到目标产物，产率为80％。

步骤三：4-(4-硝基苯氧基)吡啶甲酸乙酯的制备(4)

在150mL圆底烧瓶中先后加上述关键中间体3(13.22g,0.071mol)和对硝基苯酚(3.61g,0.026mol)用40mL氯苯超声溶解后升温至130℃冷凝回流4h。待反应液冷却至室温后将反应液体倒入100mL冷的石油醚溶剂中常温搅拌10min，倒去上清液留黏稠液体。将黏稠液体用适量二氯甲烷溶解后再加入适量NaOH水溶液调节 pH至9-10时，用二氯甲烷进行萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，加入少量石油醚，有大量淡黄色固体析出，过滤得到目标产物，产率为80％。

步骤四：4-(4-硝基苯氧基)吡啶甲酸(5)

在100mL圆底烧瓶中加入中间体4(10g,0.035mol)溶于20mL乙醇中，室温下逐滴加入10％NaOH(22.8g,0.057mol)，室温搅拌1h。将反应液旋干大部分以后加入250mL饱和食盐水，室温搅拌，逐滴加入浓盐酸调节pH值至2-3后，有淡黄色固体析出，持续搅拌3h。抽滤，留固体，烘干，得淡黄色固体7.51g，产率83.2％。

步骤五：4-(4-硝基苯氧基)吡啶甲酰氯的制备(6)

在50mL圆底烧瓶中加入上述中间体5(5g,0.019mol)用15mL氯化亚砜进行超声溶解后升温至85℃搅拌10min后滴加DMF(0.073g,0.001mol)，持续搅拌40 min。将反应液进行浓缩，加入适量甲苯待用。得到淡黄色液体为目标产物，产率约为98.0％。

步骤六：4-氯-N-甲基吡啶酰胺的制备(7)

在100mL烧杯中先后加入30mL二氯甲烷、30％甲氨水溶液(5.66g,0.0377mol) 和三乙胺(3.81g,0.0377mol)，冰浴条件下搅拌20min后逐滴加入上述关键中间体6 (5.24g,0.0188mol)，冰浴条件持续搅拌0.5h。将反应液加入到适量饱和食盐水中，再加入适量NaOH水溶液调节pH至9-10，用二氯甲烷进行萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，加入少量石油醚，有大量黄褐色固体析出，抽滤得到目标产物7，产率为85％。

步骤七：4-氯-N-甲基吡啶酰胺的制备(A)

在50mL圆底烧瓶中先后加入上述关键中间体7(4.37g,0.016mol)、活性炭(1.92g,0.16mol)和FeCl₃·6H₂O(0.43g,0.0016mol)用20mL乙醇超声溶解，90℃冷凝回流0.5h后逐滴加入80％水合肼(8.0g,0.128mol)，持续搅伴3-4h。将溶液趁热抽滤，留滤液，旋干，加入适量异丙醇和石油醚有褐色固体析出，抽滤得到目标产物8，产率为70％。

步骤八：(E)-2-(2-(3-甲氧基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(9)

在250mL的三口瓶(A瓶)中加入10mL水、40mL乙醇和无水乙酸钠超声至溶解，加入乙酰乙酸乙酯(21.06g,0.162mol)，室温搅拌2h备用。在另一250mL(B 瓶)三口瓶中加入3-甲氧基苯胺(10g,0.081mol)和10mL水混匀，室温搅拌，逐滴加浓盐酸调节pH至2-3，滴毕后用冰盐浴降温至-5℃时滴加50％亚硝酸钠水溶液20 mL，保持溶液温度低于0℃，搅拌30min。若溶液内有固体则补加少量的水，使得重氮盐溶液保持澄清。将A瓶的混合溶液降温至0℃以下，机械搅拌10min后将B 瓶的重氮盐溶液缓慢滴入，反应液内会有大量的黄色固体产生，滴毕后补加100mL 饱和食盐水，温度保持0℃以下反应2h。抽滤，留黄色固体，用适量水洗涤，干燥，得23.4g黄色固体，产率93％。

步骤九：1-(3-甲氧基苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-羧酸乙酯(10)

在100mL圆底烧瓶中先后加入中间体9(5g,0.0214mol)、乙氧羰基亚甲基三苯基磷(9.39g,0.027mol)、Et₂NH(0.28mL,0.0027mol)和30mL DMSO，超声溶解后升温至85℃反应4h，中间体10反应不完。将反应液冷却至室温后倒入500mL水中，二氯甲烷萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋干，得棕色油状物，产品中会残留中间体9。产率约为70％。

步骤十：1-(3-甲氧基苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-羧酸(11)

在50mL圆底烧瓶中加入中间体10(3g,0.0116mol)溶于20mL乙醇中，室温下滴加10％NaOH(7.0g,0.0174mol)，升温至60℃搅拌1h。待反应完全旋干溶剂后加入50mL饱和食盐水，室温搅拌，逐滴加入浓盐酸调节pH值至2-3，有淡黄色固体析出，抽滤，烘干，得淡黄色固体2.22g，产率83％。

步骤十一：1-(3-甲氧基苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-碳酰氯(B)

在100mL圆底烧瓶中先后加入中间体11(1g,0.0043mol)、10mL甲苯、吡啶(0.679g,0.0086mol)和10mL氯化亚砜，超声溶解，升温至85℃反应6h。将反应液冷却至室温，减压蒸除甲苯和氯化亚砜，得到油状液体酰氯。产率约为78％

步骤十二：4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(I)

在50mL圆底烧瓶(A瓶)中先后加入将中间体A(0.05g,0.00021mol)、N,N- 二异丙基乙胺(0.5mL,0.003mol)和10mL二氯甲烷。在50mL圆底烧瓶(B瓶)中将中间体B(0.2g,0.00071mol)溶于5mL二氯甲烷中。冰浴条件下将B瓶溶液逐滴加至A瓶溶液中，滴加完毕，缓慢升至室温，反应0.5h。反应完毕后，加入5mL 5％的氢氧化钠水溶液，调节pH至9-10，用二氯甲烷进行萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，加入少量石油醚，有大量米白色固体析出，抽滤得到目标产物，产率为70％。

ESI-MSm/z:539.14；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.35(s,1H),9.01(s,1H), 8.95(d,J＝4.1Hz,1H),8.66(d,J＝5.1Hz,1H),8.13(d,J＝10.7Hz,1H),8.03(d,J＝ 7.0Hz,1H),7.87(d,J＝7.0Hz,2H),7.82(d,J＝7.6Hz,2H),7.70(d,J＝8.6Hz,1H), 7.60(d,J＝8.7Hz,1H),7.55(s,1H),7.34(s,1H),2.92(s,3H),2.23(s,3H),1.35(s, 3H).

实施例7

1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:551.06；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.36(s,1H),8.93(d,J＝ 4.7Hz,1H),8.65(d,J＝5.5Hz,1H),8.10(d,J＝6.7Hz,1H),7.96(s,1H),7.94(s,1H), 7.92(s,1H),7.80(d,J＝8.6Hz,1H),7.74(d,J＝8.1Hz,1H),7.57(d,J＝9.0Hz,1H), 7.50(s,1H),7.32(d,J＝2.3Hz,1H),7.21(s,1H),2.61(s,3H),1.40(s,3H).

实施例8

N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基 -1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:473.15.

实施例9

N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:487.17.

实施例10

1-(2-氯苯基)-N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:507.11.

实施例11

N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:491.14.

实施例12

N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:541.14.

实施例13

N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:557.13.

实施例14

1-(4-溴-2-氟苯基)-N-(3-氟-4-((2-(甲基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基 -6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:569.05.

实施例15

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:483.19.

实施例16

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:483.19.

实施例17

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:487.17.

实施例18

1-(4-溴-2-氟苯基)-N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:565.08；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.87(s,1H),10.14(s,1H), 8.93(s,1H),8.62(d,J＝5.5Hz,1H),7.94(d,J＝8.8Hz,2H),7.81(d,J＝8.1Hz,1H), 7.75(d,J＝8.5Hz,1H),7.48(d,J＝6.3Hz,1H),7.34(d,J＝8.8Hz,2H),7.27(d,J＝ 3.0Hz,1H),7.20(s,1H),3.40–3.37(m,2H),2.51(s,3H),1.19(t,J＝7.1Hz,3H).

实施例19

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:553.16；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.83(s,1H),10.28(s,1H), 8.94(s,1H),8.61(d,J＝5.5Hz,1H),7.94(d,J＝8.9Hz,2H),7.76(d,J＝7.9Hz,1H), 7.70(d,J＝7.3Hz,2H),7.48(d,J＝2.2Hz,1H),7.34(d,J＝8.8Hz,2H),7.27(d,J＝ 2.4Hz,1H),7.20(s,1H),3.37(dd,J＝13.4,6.7Hz,2H),2.52(s,3H),1.19(t,J＝7.1Hz, 3H).

实施例20

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:501.18；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.67(s,1H),8.84(t,J＝5.8 Hz,1H),8.52(d,J＝5.5Hz,1H),7.84(d,J＝8.2Hz,2H),7.44(s,1H),7.41(s,2H), 7.38(d,J＝12.4Hz,2H),7.24(d,J＝8.5Hz,2H),7.17(d,J＝3.7Hz,1H),7.07(s,1H), 3.32–3.26(m,2H),2.42(s,3H),2.14(s,3H),1.10(t,J＝7.0Hz,3H).

实施例21

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:501.18；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.83(s,1H),8.96(s,1H), 8.65(s,1H),7.99(s,1H),7.97(s,1H),7.72(d,J＝8.1Hz,2H),7.51(d,J＝2.0Hz,1H), 7.45(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(d,J＝8.8Hz,2H),7.30(d,J＝2.9Hz,1H),7.17(s,1H), 3.40(dd,J＝13.2,6.7Hz,2H),2.63(s,3H),2.52(s,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,3H).

实施例22

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:505.16；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.84(s,1H),8.94(s,1H), 8.63(s,1H),7.97(d,J＝8.8Hz,2H),7.81(d,J＝10.2Hz,1H),7.74(d,J＝7.9Hz,1H), 7.69(d,J＝7.7Hz,1H),7.50(d,J＝2.3Hz,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,1H),7.36(d,J＝ 8.8Hz,2H),7.29(d,J＝2.5Hz,1H),7.19(s,1H),3.38(dd,J＝13.3,6.5Hz,2H),2.52 (s,3H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H).

实施例23

1-(4-溴-2-氟苯基)-N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基 -6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:583.07.

实施例24

N-(4-((2-(乙基氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:571.15.

实施例25

4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:497.21.

实施例26

4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:497.21.

实施例27

1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:501.18.

实施例28

1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1,6- 二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:579.09；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.99(s,1H),8.98(d,J＝ 5.9Hz,1H),8.69(d,J＝5.6Hz,1H),8.07(d,J＝12.8Hz,1H),7.99(d,J＝9.6Hz,1H), 7.82(s,1H),7.80(d,J＝2.6Hz,2H),7.75(d,J＝9.0Hz,1H),7.60(d,J＝8.9Hz,1H), 7.52(s,1H),7.37(d,J＝2.5Hz,1H),7.25(s,1H),3.41–3.33(m,2H),2.64(s,3H), 1.64(dt,J＝14.4,7.1Hz,2H),0.98(t,J＝7.4Hz,3H).

实施例29

4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:567.17.

实施例30

4-甲基-6-氧代-N-(4-((2-(丙基氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:551.18.

实施例31

4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(对甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:582.26.

实施例32

1-(3-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:586.62.

实施例33

1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:664.14.

实施例34

4-甲基-N-(4-((2-((3-吗啉代)氨基甲酰基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MSm/z:636.23.

体外抗肿瘤细胞活性

对按照本发明的上式Ⅰ的含吡啶类哒嗪衍生物进行了体外抑制人***细胞Hela、结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞MCF-7、肺腺癌细胞A549和白血病细胞 MV4-11活性筛选。

(1)细胞复苏并传代3-5次稳定后，用1mL胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化30s左右，加入培养液以终止消化，并转移进离心管。将离心管在1000r/min 下离心3min，弃去上清液后加入5mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10μL细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为10⁴个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔只加180μL培养基不加细胞外，其余皆加入180μL细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。

(2)用20μL二甲基亚砜溶解受试样品，然后加入适量培养液，使样品溶解成2 mg/mL药液，然后在24孔板中将样品稀释为20,4,0.8,0.16,0.032μg/mL。

每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只和为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养72h。

(3)将96孔板中带药培养液弃去，用磷酸缓冲溶液(PBS)将细胞冲洗两遍，在每孔中加入MTT(四氮唑)(0.5mg/mL)20μL放入培养箱中3.5h后，弃去MTT溶液，加入二甲基亚砜180μL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过Bliss法可求出药物IC₅₀值。

化合物的抑制***细胞Hela、结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞MCF-7、肺腺癌细胞A549和白血病细胞MV4-11活性结果(见表二)。

FLT-3酶活性试验

用于测量FLT-3激酶活性的试验基于酶联免疫吸附试验(ELISA)。具体操作是：

室温下，在0.25mg/mLPGT包被的板上，将实施例化合物、50pMc-Met(His- 标记的重组人FLT-3，通过杆状病毒表达和5μMATP在试验缓冲液中(25mMMOPS, PH7.4,5mMMgCl₂,0.5raMMnCl₂,100μM原钒酸钠，0.01％TritonX-100,1mMDTT，最后DMSO浓度1％(v/v))温育20分钟。通过冲洗除去反应混合物并用0.2μg/mL 缀合辣根过氧化物酶(HRP)的磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体(PY20)检测磷酸化聚合物底物。加入1M磷酸终止显色后，于450nm处通过分光光度法定量显色的底物 (TMB)的颜色。实施例化合物对FLT-3激酶的抑制数据(见表二)。

表二

从上述试验结果可以清楚地看出，本发明所要保护的通式Ⅰ的化合物，具有良好的体外抗肿瘤活性，相当或优于已上市的抗肿瘤药物顺铂。

尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。