阅读说明：本技术 一种合欢皮新木脂体单体化合物的制备方法 (Preparation method of albizzia bark neolignan monomer compound ) 是由 邱丽颖 史学林 艾敏 蔡维维 李忠杰 刘艺筱 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种合欢皮新木脂体单体化合物的制备方法,属于生物化学技术领域。本发明制备的化合物可有效治疗FFAs诱导的脂代谢紊乱及脂肪变性,在给药浓度为20μM,给药24h可以使脂滴面积减少约3倍；并可显著增强HUVEC的细胞活性,显著促进细胞的自我复制,从而促进内皮细胞HUVEC增殖。在给药40μM,给药24h后,可使细胞活力为达到对照的242.233％。本发明制备的化合物可显著抑制HUVEC细胞因HG诱导的活性氧簇(ROS)的产生,可使HG组平均荧光强度由818.37％降低至176.36％。(The invention discloses a preparation method of a albizzia bark neolignan monomer compound, belonging to the technical field of biochemistry. The compound prepared by the invention can effectively treat FFAs-induced lipid metabolism disorder and steatosis, and the administration concentration is 20 mu M, and the lipid drop area can be reduced by about 3 times after administration for 24 hours; and can obviously enhance the cell activity of HUVEC and obviously promote the self-replication of cells, thereby promoting the proliferation of endothelial cells HUVEC. At 40 μ M, 24h after administration, cell viability reached 242.233% of control. The compound prepared by the invention can obviously inhibit the generation of Reactive Oxygen Species (ROS) induced by HG (mercury-induced killer) of HUVEC (human embryonic kidney) cells, and can reduce the average fluorescence intensity of HG groups from 818.37% to 176.36%.)

一种合欢皮新木脂体单体化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种合欢皮新木脂体单体化合物的制备方法，属于生物化学技术领域。

背景技术

合欢皮(Albiziae Cortex)是豆科植物合欢(Albzia julibrissin Durazz)的树皮，是一种较为常用的中药，性味甘、平，具有解郁、和血、宁心和消肿之功效。近年来，随着学者对合欢皮的深入研究，其化学成分和药理药效活性不断的被发现。

目前对于合欢皮中活性化合物的研究主要是通过化学方法提取分离，例如采用乙醇等有机溶剂萃取，并通过大孔树脂洗脱、硅胶柱层析、反向C18色谱分离等技术。迄今为止，合欢皮中已分离出三萜、黄酮、木脂素类等化合物，由于各化合物所具备的药理药效活性尚不明确，且同类化合物分子量或官能团结构类似，对于针对性分离提取特定的化合物带来了一定的困难。

发明内容

本发明的第一个目的是提供合欢皮新木脂体化合物的分离方法，包括如下步骤：(1)将合欢皮粉碎，与浓度为70～80％的乙醇按照料液比为1:4～10的比例混合，70～90℃回流提取1～3次，每次1～3小时；(2)过滤除去合欢皮残渣，合并步骤(1)获得的提取液，冷冻干燥，收集粗提物，混悬后依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取；(3)回收正丁醇萃取液，干燥；(4)采用D101大孔吸附树脂，用不同体积分数的乙醇进行洗脱分离，分别富集各洗脱段；(5)对各洗脱段进行硅胶柱层析，采用不同体积分数的二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，经TLC检测合并相同组分，收集各洗脱段。

在一种实施方式中，所述合欢皮新木脂体化合物包括

在一种实施方式中，所述步骤(4)采用体积分数为30％、50％、70％和95％的乙醇进行洗脱分离，分别富集30％乙醇洗脱段、50％乙醇洗脱段、70％乙醇洗脱段、95％乙醇洗脱段。

在一种实施方式中，所述步骤(5)对洗脱段进行硅胶柱层析，采用40:1,20:1,16:1,10:1,8:1和6:1的二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，收集各洗脱段并分离合欢皮木脂体化合物。

在一种实施方式中，步骤(5)收集10:1洗脱段，对10:1洗脱组分过反向硅胶柱进一步纯化，最后采用X-Bridgec-18(5μm，10×250mm)色谱柱，流速4mL/min，以CH₃OH为A相，水为B相，按照如下半制备液相分离条件进行洗脱：

时间	CH<sub>3</sub>OH体积百分数	H<sub>2</sub>O体积百分数
			0	10％	90％
4	10％	90％
			5	26％	74％
45	28％	72％
			60	32％	68％
70	50％	50％
			80	100％	0％

收集保留时间为26.50min处的化合物，即得

在一种实施方式中，步骤(5)收集8:1洗脱段，对8:1洗脱组分过反向硅胶柱进一步纯化，最后采用X-Bridgec-18(5μm，10×250mm)色谱柱，流速4mL/min，以CH₃OH为A相，水为B相，按照如下洗脱条件进行半制备洗脱分离：

收集保留时间为31.75min处的化合物，即得

在一种实施方式中，步骤(5)收集8:1洗脱段，采用C18色谱柱，以CH₃OH为A相，水为B相，按照如下洗脱条件进行洗脱：

时间	CH<sub>3</sub>OH体积百分数	H<sub>2</sub>O体积百分数
			0	10％	90％
4	10％	90％
			5	23％	77％
50	23％	77％
			55	100％	0％
60	100％	0％

收集保留时间为35.20min处的化合物，即得

在一种实施方式中，步骤(5)收集8:1洗脱段，用反向硅胶柱进一步纯化，最后采用X-Bridgec-18(5μm，10×250mm)色谱柱，流速4mL/min，以CH₃OH为A相，水为B相，按照如下洗脱条件进行半制备洗脱分离：

时间	CH<sub>3</sub>OH体积百分数	H<sub>2</sub>O体积百分数
			0	10％	90％
4	10％	90％
			5	23％	77％
50	23％	77％
			55	100％	0％
60	100％	0％

收集保留时间为41.0min处的化合物，即得

在一种实施方式中，步骤(5)收集8:1洗脱段，用反向硅胶柱进一步纯化，最后采用X-Bridgec-18(5μm，10×250mm)色谱柱，流速4mL/min，以CH₃OH为A相，水为B相，按照如下洗脱条件进行半制备洗脱分离：

时间	CH<sub>3</sub>OH体积百分数	H<sub>2</sub>O体积百分数
			0	10％	90％
4	10％	90％
			5	27％	73％
50	27％	73％
			55	100％	0％
60	100％	0％

如图5所示，收集保留时间为37.25min处的化合物，即得

有益效果：本发明提供了一种合欢皮来源化合物的制备方法，能够针对性地分离出 五种化合物，纯度均可达96％以上。

附图说明

图1为10:1洗脱段分析型高效液相色谱图。

图2为10:1组分Davisil C18反向柱42％CH₃OH洗脱段半备型高效液相色谱图。

图3为化合物Aj4的¹H-NMR色谱图。

图4为化合物Aj4的¹³C-NMR色谱图。

图5为albioside A的HR-ESI-MS色谱图。

图6为8:1洗脱段分析型高效液相色谱图。

图7为Davisil C18反向柱32％CH₃OH洗脱段的成分Aj5在半备型高效液相色谱检测下的色谱图。

图8为化合物(+)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside(Aj5)的ESI-MS色谱图。

图9为(+)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside(Aj5)的¹³C-NMR色谱图。

图10为(+)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside(Aj5)的HR-ESI-MS色谱图；

图11为Davisil C18反向柱32％CH₃OH洗脱段的成分Aj6在半备型高效液相色谱检测下的色谱图。

图12为(-)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside(Aj6)的ESI-MS色谱图。

图13为(-)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside(Aj6)的¹HNMR谱图。

图14为为(-)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside(Aj6)的¹³CNMR谱图。

图15为Davisil C18反向柱32％CH₃OH洗脱段的成分Aj7在半备型高效液相色谱检测下的色谱图。

图16为化合物Picraquassioside C(Aj7)的ESI-MS色谱图。

图17为化合物Picraquassioside C(Aj7)的¹HNMR谱图。

图18为化合物Picraquassioside C(Aj7)的¹³CNMR谱图。

图19为Davisil C18反向柱36％CH₃OH洗脱段的成分Aj8在半备型高效液相色谱检测下的色谱图。

图20为化合物Icariside E₅(Aj8)的ESI-MS色谱图。

图21为化合物Icariside E₅(Aj8)的¹HNMR谱图。

图22为化合物Icariside E₅(Aj8)的¹³CNMR谱图。

具体实施方式

实施例1化合物Aj4的制备

(1)提取：取干燥合欢皮20kg,粉碎，用5倍75％乙醇(水)即每次100L，80℃回流提取2次，每次2小时。过滤除去合欢皮残渣，合并合欢皮75％乙醇提取液，冷冻干燥，得合欢皮乙醇粗提物1.6kg。将粗提物研碎，混悬于2L去离子水中，使其尽可能溶解。混悬后依次用乙酸乙酯及饱和正丁醇萃取，萃取采用每次添加乙酸乙酯和饱和正丁醇少量多次的原则，分别合并乙酸乙酯相及饱和正丁醇相的萃取液，得乙酸乙酯部位和正丁醇部位提取物。

(2)分离：取正丁醇部位254g，用去离子水溶解混悬，采用D101大孔吸附树脂进行分离纯化，分别用2～3倍柱体积的乙醇-水混合溶液为流动相进行梯度洗脱，富集30％乙醇洗脱段、50％乙醇洗脱段、70％乙醇洗脱段、95％乙醇洗脱段。大孔吸附树脂30％乙醇洗脱段经硅胶硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇混合液为流动相，采用梯度溶剂二氯甲烷(CH₂Cl₂)：甲醇(CH₃OH)＝(40:1,20:1,16:1,10:1,8:1和6:1)进行梯度洗脱(流动相体积为3倍柱体积，通过TLC实时检测是否获得目的产物)，分别以4倍柱体积左右的流动相进行洗脱，用250ml锥形瓶分别收集洗脱液，经TLC检测合并相同组分，得各洗脱段。

对硅胶10:1洗脱段进行分析型高效液相(HPLC)检测(色谱柱为X-Bridge C18,5μm，4.6×250mm，流速为1ml/min，柱温30℃),紫外检测波长为254nm，洗脱条件：

时间 CH₃OH H₂O

0min 5％ 95％

60min 100％ 0％

其结果如图1所示。根据图1液相检测条件下化合物的保留时间，确定硅胶10:1洗脱段在C18反向柱(Davisil C18,50μm)上的洗脱条件所对应的保留时间为23min，30min，36min，60min，且各保留时间所对应的甲醇浓度为41％CH₃OH，52％CH₃OH，62％CH₃OH，100％CH₃OH。

将10:1洗脱段过反向硅胶柱(Davisil C18,50μm)，以甲醇和水为洗脱相进行洗脱。因为图1为分析型液相色谱图，色谱柱为X-Bridge C18(5μm,4.6×250mm),而DavisilC18反向柱填料为50μm，所以流动相甲醇浓度均减去10％。所以根据图1确定X-Bridge C18柱层析洗脱相组合为31％CH₃OH,42％CH₃OH,52％CH₃OH,100％CH₃OH。对洗脱组分分别进行HPLC检测，其结果显示42％CH₃OH洗脱段紫外吸收峰强度较大且较易于分离，根据分析型液相摸索42％CH₃OH洗脱段的分离条件，确定最佳分离条件，如表1所示。最后对42％CH₃OH洗脱段进行半制备液相分离(色谱柱为X-Bridge C18,5μm，10×250mm，流速为4ml/min，柱温30℃)，其结果如图2所示，保留时间t＝26.50min处的化合物命名为albiosideA(Aj4)。

表1半制备液相色谱的不同分离条件

在表1所示的分离条件中，条件一、条件二及条件三无法有效分离Aj4，其保留时间附近具有杂峰干扰，分离条件四可较为有效分离化合物Aj4，本实验采用的分离条件在条件四的基础上进一步优化的最佳分离方法，其分离效果如图2所示。收集保留时间t _R＝26.50min处的化合物，75℃减压旋蒸，回收溶剂，真空干燥箱干燥得Aj4单体化合物。

(3)结构鉴定(图3～5所示)：Aj4为淡黄色粉末，通过UPLC-ESI-MS检测，ESI-MS m/z 633.1932[M+Cl^-]，通过Monoisotopic Mass,Even Electron Ions确定其分子式为C₂₈H₃₈O₁₄。

将样品Aj4用氘代甲醇溶解于核磁管中，采用全数字化核磁共振波谱仪测定¹HNMR、¹³CNMR，其结果如下:

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ6.76(2H,s,H-2’,6’),6.74(2H,s,H-2,6),6.56(1H,d,J＝16.0Hz,H-7’),6.34(1H,dt,J＝15.8,5.5Hz,H-8’),4.81(1H,d,J＝7.2Hz,H-7),4.65(4H,s),4.29(1H,dd,J＝9.0,4.8Hz,H-1”),4.24(2H,d,J＝5.4Hz,H-9’),3.96–3.88(2H,m),3.85(6H,s,3,5-OMe),3.83(6H,s,3’,5’-OMe),3.77(1H,s),3.73–3.63(4H,m),3.60(1H,dd,J＝8.4,3.9Hz),3.56–3.39(4H,m),3.22(s,1H).¹³C NMR(101MHz,CD₃OD)δ153.08(C-3’,5’),152.39(C-3,5),138.12(C-4’),134.99(C-4),134.13(C-1’),133.30(C-1),129.95(C-7’),128.51(C-8’),104.62(C-2,6),104.26(C-1”),103.51(C-2’,6’),85.66(C-8),76.94(C-3”),76.37(C-5”),74.32(C-2”),72.64(C-7),69.92(C-4”),62.16(C-9),61.17(C-9’),60.23(C-6”),55.61(3’,5’-OMe),55.28(3,5-OMe)。

根据质谱及¹HNMR、¹³CNMR最终确定其结构如下，化学名2-[4-(3-Hydroxy-1-propenyl)-2,6-dimethoxy-phenoxy]-3-hydroxy-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxy-phenyl)propyl-β-D-glucopyranoside，对其命名为合欢新木脂苷A(albiosideA，Aj4)。

实施例2化合物Aj5的制备

提取和分离的步骤参照实施例1，根据图6的分析型高效液相色谱图中各组分的保留时间，确定对CH₂Cl₂:CH₃OH＝8:1洗脱段进行过反向硅胶柱(Davisil C18,50μm)的洗脱条件为t _R＝22min、24min、26min，60min时所对应的CH₃OH浓度39.8％、42.9％、46.2％、100％，因为所用C18填料直径为50μm,所以CH₃OH浓度均需减去10％，即29.8％、32.9％，36.2％，100％。以甲醇和水为洗脱相进行洗脱。根据图6确定洗脱相组合为29％CH₃OH(H₂O),32％CH₃OH(H₂O),36％CH₃OH(H₂O),100％CH₃OH.对各洗脱组分分别进行分析型HPLC检测，摸索分离条件，以确定最佳分离方法(如表2所示)。对32％CH₃OH洗脱段进行半制备液相分离，如图7所示(UV检测波长290nm),保留时间t _R＝31.75min处的化合物为(+)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside(Aj5)。

表2

在本研究所描述的液相分离方法中条件一至四虽然也能分离出目标单体化合物，但受杂质峰的干扰，所得产物Aj5纯度较差，在此基础上所优化的最佳分离条件可以排除杂质峰对目标产物的干扰，分离得到高纯度单体化合物，半制备分离色谱图如图7所示。

(3)结构鉴定

Aj5为白色粉末，通过UPLC-ESI-MS检测，其质谱图如图8所示。ESI-MS m/z 617[M+Cl^-]，通过Monoisotopic Mass,Even Electron Ions确定其分子式为C₂₈H₃₈O₁₃。

将样品Aj5用氘代甲醇溶解于核磁管中，采用全数字化核磁共振波谱仪测定¹HNMR、¹³CNMR，其结果如下(图9～10所示)：

¹HNMR(400MHz,MeOD)δ6.60(1H,s,H-8),6.45(2H,s,H-2’,6’),4.44(1H,d,J＝6.2Hz,H-4),4.30(1H,d,J＝7.7Hz,anomeric-H),3.95–3.81(6H,m,5,7-OMe),3.76(6H,s,3’,5’-OMe),3.67(2H,dd,J＝11.8,4.9Hz,H-3a),3.56(1H,dd,J＝10.9,6.6Hz),3.47(1H,dd,J＝9.8,3.9Hz),3.39(1H,t,J＝7.7Hz),3.36(3H,s),3.28–3.23(2H,m,H-2a),2.77–2.59(2H,m,H-1),2.09(1H,d,J＝5.7Hz,H-3),1.73(1H,s,H-2).¹³CNMR(101MHz,MeOD)δ147.59(C-3’,5’),147.24(C-5),146.19(C-7),137.95(C-1’),137.51(C-6),133.10(C-4’),128.81(C-9),125.03(C-10),106.47(C-8),105.55(C-2’,6’),103.43(C-1”),76.85(C-5”),76.54(C-3”),73.79(C-2”),70.27(C-4”),70.11(C-3α),64.84(C-2α),61.44(C-6”),58.80(5-OMe),55.48(3’,5’-OMe),55.23(7-OMe),45.30(C-3),41.39(C-4),39.22(C-2),32.43(C-1).

根据质谱及¹HNMR、¹³CNMR最终确定其结构为化学名(+)-Lyoniresinol 9'-O-glucoside。

实施例3化合物Aj6的制备

提取、分离条件同实施例2，半制备分离色谱图如图11所示。对32％CH₃OH洗脱段进行半制备液相分离(色谱柱为X-Bridge C18,5μm，10×250mm，流速为4ml/min，柱温30℃)，如图15所示(UV检测波长290nm),收集保留时间t _R＝35.20min处的化合物，75℃减压旋蒸，回收溶剂，真空干燥箱干燥得Aj6单体化合物。

结构鉴定：Aj6为淡黄色粉末，通过UPLC-ESI-MS检测，其质谱图如图12所示。ESI-MS m/z 617[M+Cl^-]，通过Monoisotopic Mass,Even Electron Ions确定其分子式为C₂₈H₃₈O₁₃。

将样品Aj5用氘代甲醇溶解于核磁管中，采用全数字化核磁共振波谱仪测定¹HNMR、¹³CNMR，其结果如下(图13～14所示):

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ6.59(1H,s,H-8),6.43(2H,s,H-2’,6’),4.24(1H,d,J＝5.3Hz,H-4),4.15(1H,d,J＝7.7Hz,H-1”),3.87(3H,s,-OCH₃),3.84(3H,d,J＝3.6Hz,-OCH₃),3.77(6H,s,3’,5’-OCH₃),3.72(1H,d,J＝5.2Hz),3.69(1H,d,J＝5.1Hz),3.62(5H,dt,J＝22.8,6.5Hz),3.49(1H,dd,J＝12.5,7.2Hz),3.44–3.35(2H,m),3.30–3.13(3H,m),2.70(2H,t,J＝8.0Hz,H),2.13(1H,dd,J＝13.1,6.9Hz,H-3),1.70(1H,d,J＝6.3Hz,H-1).¹³C NMR(101MHz,CD₃OD)δ147.61(C-3’,5’),147.29(C-5),146.15(C-7),138.06(C-1’),137.49(C-6),133.21(C-4’),128.83(C-9),124.84(C-10),106.41(C-8),105.72(C-2’,6’),102.85(C-1”),76.79(C-5”),76.58(C-3”),73.67(C-2”),70.61(C-3α),70.16(C-4”),64.83(C-2α),61.31(C-6”),58.72(5-OMe),55.53(7-OMe),55.23(3’,5’-OMe),45.19(C-3),41.83(C-4),39.85(C-2),32.43(C-1)。

根据质谱及¹HNMR、¹³CNMR最终确定其结构为化学名(-)-Lyoniresinol-9'-O-glucoside。

实施例4化合物Aj7的制备

提取和分离的步骤参照实施例1，分离方法同实施例2。对32％CH₃OH洗脱段进行半制备液相分离(色谱柱为X-Bridge C18,5μm，10×250mm，流速为4ml/min，柱温30℃)，如图15所示(UV检测波长290nm),保留时间t _R＝41.0min处的化合物为迭鞘石斛C(Picraquassioside C)(Aj7)，

Aj7为白色粉末，通过UPLC-ESI-MS检测，其质谱图如图16所示。HR-ESI-MS m/z633.1688[M+Cl]^-，通过Monoisotopic Mass,Even Electron Ions确定其分子式为C₂₈H₃₈O₁₄。

将样品Aj7用氘代甲醇溶解于核磁管中，采用全数字化核磁共振波谱仪测定¹H-NMR、¹³C-NMR，其结果如下(图17～18):

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ6.76(2H,s,H-2,6),6.74(2H,s,H-2’,6’),6.57(1H,d,J＝15.8Hz,H-7’),6.33(1H,dt,J＝15.8,5.5Hz,H-8’),4.94(1H,d,J＝5.6Hz,H-7),4.81(1H,d,J＝7.3Hz,H-1”),4.29(1H,dd,J＝9.0,4.8Hz,H-8),4.24(1H,d,J＝5.4Hz,H-9’),3.98–3.89(2H,m),3.87(1H,s),3.85(6H,s,3,5-OMe),3.83(6H,s,3’,5’-OMe),3.77(1H,s),3.73–3.58(4H,m),3.52–3.41(4H,m),3.37(1H,s),3.22(s,2H).¹³C-NMR(101MHz,CD₃OD)δ153.09(C-3’,5’),152.40(C-3,5),138.12(C-1),135.02(C-4’),134.17(C-4),133.31(C-1’),129.96(C-8’),128.53(C-7’),104.66(C-2,6),104.29(C-1”),103.55(C-2’,6’),85.68(C-8),76.94(C-5”),76.39(C-3”),74.34(C-2”),72.67(C-7),69.95(C-4”),62.17(C-9’),61.20(C-6”),60.25(C-9),55.63(3,5-OMe),55.31(3’,5’-OMe)。

根据质谱及¹HNMR、¹³CNMR最终确定其结构如下，中文名为迭鞘石斛C，英文名Picraquassioside C，与合欢新木脂苷A(albioside A)为互为同分异构体。

实施例5化合物Aj8的制备

提取和分离的步骤参照实施例1，分离方法同实施例2。对36％CH₃OH洗脱段进行半制备液相分离(色谱柱为X-Bridge C18,5μm，10×250mm，流速为4ml/min，柱温30℃)，如图19所示(UV检测波长254nm),保留时间t _R＝37.25min处的化合物为淫羊藿次苷E₅(Aj8)。

表3液相色谱分离条件

在表3所示的分离条件中，条件一、条件二及条件三无法有效分离Aj8，其保留时间附近具有较强杂峰干扰，本实验采用的分离条件在条件三的基础上进一步优化的最佳分离方法，可有效分离制备淫羊藿次苷E₅(Aj8)，其半制备色谱图如图19所示。收集保留时间t _R＝37.25min处的化合物，75℃减压旋蒸，回收溶剂，真空干燥箱干燥得Aj8单体化合物。

(3)结构鉴定

Aj8为白色粉末，通过UPLC-ESI-MS检测，其质谱图如图20所示。ESI-MS m/z557[M+Cl^-]，结合¹H-NMR及¹³C-NMR(图21～22)确定其分子式为C₂₆H₃₄O₁₁。

将样品Aj8用氘代甲醇溶解于核磁管中，采用全数字化核磁共振波谱仪测定¹HNMR、¹³CNMR，其结果如下:¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ6.94(2H,d,J＝4.8Hz,H-2,6),6.59(3H,t,J＝7.0Hz,H-2’,5’,6’),6.50(1H,d,J＝8.0Hz,H-7),6.32(1H,dt,J＝15.6,5.6Hz,H-8),4.69(2H,d,J＝7.2Hz),4.24(2H,d,J＝5.5Hz,H-9),4.03–3.94(1H,m),3.92–3.85(1H,m),3.84(3H,s,3-OMe),3.82–3.74(3H,m),3.72(1H,s),3.71(3H,s,3’-OMe),3.67(1H,d,J＝7.2Hz),3.62–3.35(4H,m),3.19–3.11(1H,m),2.99(1H,dd,J＝13.8,5.5Hz),2.74(1H,dd,J＝13.7,9.4Hz).¹³CNMR(101MHz,CD₃OD)δ152.05(C-3),147.02(C-3’),143.94(C-4’),143.61(C-4),137.53(C-5),134.01(C-1),131.82(C-1’),130.10(C-8),128.29(C-7),121.22(C-6’),117.76(C-6),114.29(C-5’),112.41(C-2’),107.75(C-2),103.97(C-1”),76.67(C-5”),76.46(C-3”),74.54(C-2”),69.85(C-4”),65.45(C-9’),62.27(C-9),61.06(C-6”),55.02(3’-OCH₃),54.89(5’-OCH₃),41.39(C-8’),37.76(C-7’)。根据¹HNMR、¹³CNMR及质谱最终确定Aj8为淫羊藿次苷E5(Icariside E₅)。其结果如下：

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。