阅读说明：本技术 快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡及其制备方法 (Immunochromatography detection card for rapidly detecting Alzheimer disease related neurofilament protein AD7c-NTP and preparation method thereof ) 是由 林斯 柴诗缘 樊涛 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡,包括试纸条,所述试纸条包括检测线及质控线,所述检测线上包被有一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体,所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。本发明所提供的快速检测AD7c-NTP的免疫层析检测卡,其可用于尿液的检测,用于阿尔兹海默病的诊断。(The invention relates to an immunochromatography detection card for rapidly detecting Alzheimer disease related neurofilament protein AD7c-NTP, which comprises a test strip, wherein the test strip comprises a detection line and a quality control line, a mouse anti-human AD7c-NTP monoclonal antibody is coated on the detection line, and a goat anti-rabbit polyclonal antibody is coated on the quality control line. The immunochromatography detection card for rapidly detecting AD7c-NTP provided by the invention can be used for urine detection and Alzheimer disease diagnosis.)

快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析 检测卡及其制备方法

技术领域

本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡及其制备方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)，又称老年性痴呆，是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，具体表现为记忆力减退，认知能力下降以及运动障碍等，并伴随一系列精神症状，最终导致患者生活自理能力完全丧失。随着社会人口老龄化的进展，AD已严重威胁人类健康，庞大的患者群体给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担，但该病的发病机制目前尚未明确。尸检研究证实β淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque,SP)和神经元纤维缠结(nerve fiber tangles,NFT)是AD的两大病理特征，并且已经被列入AD的诊断标准。

目前AD的诊断主要依据患者临床表现、头颅CT或MRI等影像学资料、神经心理检查量表等综合评价，临床诊断率低。因此寻找高敏感度、特异度、无创的生物学指标以提高AD早期诊断率，为早期生活方式干预、药物干预及延缓病程提供帮助。

阿尔茨海默病相关神经丝蛋白(AD7c-NTP)是一种在神经元中表达的分子量约41kDa的跨膜磷蛋白。1996年麻省总医院的de la Monte教授首次发现AD7c-NTP在AD患者脑内表达水平升高，且出现在组织学尚完整的变性神经元中，证明异常AD7c-NTP表达增加是AD神经变性的早期事件。随后来自不同国家人群的大量研究证实AD7c-NTP存在于NFTs中，主要与诱发神经炎症及神经细胞死亡有关，是一种既能反应AD病理特点又具有较高灵敏性和特异性的AD生物标志物。基于尿液中AD7c-NTP与脑组织和脑脊液中的该蛋白具有相同的分子质量，并且检测结果具有相似性，尿AD7c-NTP可特异性反映大脑神经损伤，与AD7c蛋白具有同等效力。AD7c-NTP特异性分布大脑额叶、颞叶，只反映大脑神经元损伤；AD7c-NTP为神经元轴突跨膜蛋白，与AD7c蛋白共同定位；尿AD7c-NTP蛋白特异性反映脑神经元损伤，所以临床开展尿AD7c-NTP检测可以协助AD患者的早期发现及诊治。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物垫上包被有另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球，所述另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球的摩尔比为1:0.2～4。

在本发明的一个具体方案中，其中所述表面活化的荧光乳胶微球通过以下步骤制得：

1)取表面活性剂加入0.1～0.5mol/L，pH值为8～10的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％PEG2000)中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应；

2)取表面带有羧基的荧光乳胶微球的分散液，以硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)调pH值至8～10后，加入到步骤1)所得的产物中，在25℃下搅拌反应1～5h，反应完毕后，离心去除上清液，得到表面活化的荧光乳胶微球用硼酸-硼砂缓冲溶液复溶备用。

在本发明的一个具体方案中，其中所述表面活性剂包含有N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、聚乙二醇单月硅酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，四者的重量比为(0.5～6):(4～9):(0.8～3):(5～14)；所述表面活性剂与所述氨基表面的荧光乳胶微球的重量比为(0.5～120):1。

在本发明的一个具体方案中，其中所述另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球通过以下步骤制得：

取表面活化的荧光乳胶微球加入碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中室温搅拌2～6h，然后加入另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，室温下搅拌1～4h，再加入10～50mg BSA封闭液，继续搅拌1～4h；在2～8℃下，离心，除去上清液；最后，用0.01M～0.5M的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶，再加入Proclin300在4℃下保存待用。

在本发明的一个具体方案中，其中所述表面活化的荧光乳胶微球与另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体的质量比例为1：(0.01～4)。

在本发明的一个具体方案中，其中所述快速检测AD7c-NTP的免疫层析检测卡还包括用于卡设试纸条的卡壳。

在本发明的一个具体方案中，其中所述卡壳包括：

底槽，其连接于所述PVC板；

上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述样品垫上加样的加样孔；

观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。

一种快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡的制备方法，包括以下步骤：

1)包被垫的制备：将一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别包被到硝酸纤维素膜上，干燥备用；

2)标记物垫的制备：将另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球混合后，喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥备用；

3)组装试纸条：在PVC板上粘接包被垫，并在靠近该包被垫上的质控线的一端搭接吸水垫，在靠近该包被垫上的检测线的一端搭接标记物垫及其连接的样品垫；然后将其切成所需宽度的试纸条，之后将该试剂条放入卡壳。

本发明的有益效果为：

1、本发明所提供的快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡，其可用于尿液的检测，以用于阿尔兹海默病的诊断。

2、本发明所提供的快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡，其能够通过尿液检测AD7c-NTP，避免了穿刺获取脑脊液的风险，易于被患者接受，检测在5～20min之内即可完成，线性检测范围为0.25ng/mL-10ng/mL，极大地提高了检测效率。

3、本发明所提供的快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡，其灵敏度高、稳定性强、线性范围宽，具有优异的准确性和精密度。

4、本发明所提供的快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡，其通过采用表面活化的荧光乳胶微球，克服了市面上荧光染料灵敏度差和湿式荧光微球稳定性差的缺陷，能够保证颗粒间的相对距离不易团聚，无需缓冲液，加入尿液样本后能即刻复溶并顺利层析。

附图说明

图1为本发明所提供的快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析试纸条示意图；

图2A为本发明所提供的快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡中一种上盖的内部结构示意图；

图2B为本发明所提供的快速检测阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的免疫层析检测卡中一种底槽的内部结构示意图；

图3为本发明实施例1中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的校准曲线；

图4为本发明实施例2中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的校准曲线；

图5为本发明实施例3中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的校准曲线；

图6为本发明实施例4中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP的校准曲线；

其中，1-PVC板，2-包被垫，3-标记物垫，4-吸水垫，5-检测线，6-质控线，7-标记物结合处，8-样本，9-样品垫，11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗，15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部，20-第三限定部。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。

实施例1：

1.阿尔茨海默病相关神经丝蛋白AD7c-NTP免疫层析检测卡(以下简称AD7c-NTP免疫层析检测卡)的制备

1)表面活化的荧光乳胶微球的制备：

N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、聚乙二醇单月硅酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，四者的重量比为1:6:3:7。

①取表面活性剂(包含1mg的N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、6mg的聚乙二醇单月硅酸酯、3mg的十二烷基苯磺酸盐和7mg的月桂酰谷氨酸盐)加入0.2mol/L pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)中，再加入1mL二甲基甲酰胺、1mg的N,N’-二环己基碳二亚胺和0.5mgN-羟基琥珀酰亚胺，在120r/min的搅拌速度下进行反应；

②取1mL含1wt％的表面带有羧基的荧光乳胶微球分散液(购自上海甄准生物技术有限公司)，用10mL 0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)稀释分散均匀后，加入到步骤①所得的产物中，在25℃，120r/min的搅拌速度下反应3h，反应完毕后，按照12000r/min的转速离心30min去除上清液，得到表面活化的荧光乳胶微球，用0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液复溶至1mL备用。

2)另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照12000r/min的转速离心20min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

3)兔IgG多克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL mg羊兔IgG多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

4)包被垫的制备

将一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释成1mg/mL，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上进行划膜。含有一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体的作为检测线(T线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)6，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。

5)标记物垫的制备

①将玻璃纤维素膜在0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中浸泡6h，然后在35℃下干燥8h，备用。

②将摩尔比为1:1的另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球混合均匀后，按照10μL/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫上包被有另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球的地方叫做标记物结合处7。

设置标记物结合处7的目的在于：将待测尿液样本8滴加到样品垫9上，在吸水垫4的作用下，尿液样本向前层析，在标记物结合处7的尿液样本中的AD7c-NTP与标记物结合处包被的另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球反应，反应后的物质、未参加反应的另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的荧光乳胶微球、兔IgG标记的荧光乳胶微球随着尿液样本继续层析，在检测线处参加反应的另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球与检测线包被的一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体反应而停留在检测线，在质控线处兔IgG标记的荧光乳胶微球与质控线包被的羊抗兔多克隆抗体反应而停留在质控线，其他物质继续层析，最后通过荧光免疫层析仪分别采集检测线的荧光微球的信号(记作T)和质控线的荧光微球的信号(记作C)，计算T/C值，从AD7c-NTP的标准曲线中读取尿液样本中AD7c-NTP的浓度。

6)免疫层析检测卡的组装

首先在PVC板1上粘接包被垫2，然后在靠近包被垫2上的质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近包被垫2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1)，将试纸条放入卡壳中制备成AD7c-NTP免疫层析检测卡。

所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图2A、图2B所示)可以包括：底槽12，其连接于所述PVC板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上设置有用于向所述样品垫9上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上，用于检测线5和质控线6的数据采集。

如图2B所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18与所述第二限定部19围设成纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；

如图2A所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。

所述包被垫2的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测线5和质控线6，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述样品垫9相对应的位置处开设有加样孔，以用于样品垫9上滴加样本8。所述检测线距离加样孔15-25mm。

2.检测

取60μL的待测尿液样本滴加到步骤1制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡的加样孔13(对应试纸条的样品垫9)中，室温静置15min，进行免疫层析反应，然后将AD7c-NTP免疫层析检测卡***到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。

3.标准曲线的建立

配置不同浓度的AD7c-NTP标准品(0、0.25、1、2、5、10ng/mL)，用本发明步骤1中制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡按照步骤2的检测过程依次进行检测，空白检测限不高于0.25ng/mL，检测范围为0.25～10ng/mL。检测结果如表1所示，以样本浓度为横坐标，检测线与质控线的比值(T/C)为纵坐标，用logistic(四参数)进行曲线拟合，拟合度R²为0.9998，n＝6，制备的AD7c-NTP校准曲线如图3所示，T/C值与校准品在浓度为0.25～10ng/mL的范围内具有良好的相关性。

表1检测数据

标准浓度ng/mL	0	0.25	1	2	5	10
							T/C值	0.1124	1.8421	2.6673	3.1463	3.6247	3.9655

4.精密度

抽取三个AD7c-NTP免疫层析检测卡，分别检测浓度为1.5、3.5、5ng/mL的样本进行检测，每个浓度点平行测定10次，计算三个批号检测试纸条的批内变异系数和批间变异系数，从表2中可以看出批间和批内变异系数均小于10.79％，说明AD7c-NTP荧光免疫层析检测卡的精密度较高。

表2检测数据

5.回收率

取三批次浓度为10ng/mL的AD7c-NTP校准品，分别加入到浓度接近于0的阴性样本中，其中所加入的AD7c-NTP校准品与阴性样本的体积比为1：9，重复测定3次，计算回收率。三批样本校准品回收率的结果分别为94.11％、109.88％、97.93％，回收率均在90％-110％之间，说明测定结果符合标准。

实施例2

1.AD7c-NTP免疫层析检测卡的制备

1)表面活化的荧光乳胶微球的制备：

N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、聚乙二醇单月硅酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，四者的重量比为5:4:1.5:9。

①取表面活性剂(包含5mg的N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、4mg的聚乙二醇单月硅酸酯、1.5mg的十二烷基苯磺酸盐和9mg的月桂酰谷氨酸盐)加入0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)中，再加入1mL二甲基甲酰胺、1mg的N,N’-二环己基碳二亚胺和0.5mgN-羟基琥珀酰亚胺，在120r/min的搅拌速度下进行反应；

②取1mL含1wt％的表面带有羧基的荧光乳胶微球的分散液(购自上海甄准生物技术有限公司)，用10mL 0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)稀释分散均匀后，加入到步骤①所得的产物中，在25℃，120r/min的搅拌速度下反应3h，反应完毕后，按照12000r/min的转速离心30min去除上清液，得到表面活化的荧光乳胶微球，用0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液复溶至1mL备用。

2)另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

3)兔IgG多克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL mg羊兔IgG多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

4)包被垫的制备

将一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释成1mg/mL，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上进行划膜。含有一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体的作为检测线(T线)，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。

5)标记物垫的制备

①将玻璃纤维素膜在0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中浸泡6h，然后在35℃下干燥8h，备用。

②将摩尔比为1:1的另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球混合均匀后，按照10μL/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫上包被有另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球的地方叫做标记物结合处7。设置标记物结合处7的目的同实施例1。

6)免疫层析检测卡的组装

首先在PVC板1上粘接包被垫2，然后在靠近包被垫2上的质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近包被垫2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条，将试纸条放入卡壳中制备成AD7c-NTP免疫层析检测卡。所述卡壳的结构同实施例1。

2.检测

取60μL的待测尿液样本滴加到步骤1制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡的加样孔(对应试纸条的样品垫9)中，室温静置15min进行免疫层析反应，然后将AD7c-NTP免疫层析检测卡***到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。

3.标准曲线的建立

配置不同浓度的AD7c-NTP标准品(0、0.25、1、2、5、10ng/mL)，用本发明步骤1中制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡按照步骤2的检测过程依次进行检测，空白检测限不高于0.25ng/mL，检测范围为0.25～10ng/mL。检测结果如表3所示，以样本浓度为横坐标，检测线与质控线的比值(T/C)为纵坐标，用logistic(四参数)进行曲线拟合，拟合度R²为0.9995，n＝6，制备的AD7c-NTP校准曲线如图4所示，T/C值与校准品在浓度为0.25～10ng/mL的范围内具有良好的相关性。

表3检测数据

标准浓度ng/mL	0	0.25	1	2	5	10
							T/C值	0.0113	1.4365	2.3063	2.7252	3.2247	3.6655

4.精密度

抽取三个AD7c蛋白免疫层析检测卡，分别检测浓度为1.5、3.5、5ng/mL的样本进行检测，每个浓度点平行测定10次，计算三个批号检测试纸条的批内变异系数和批间变异系数，从表4中可以看出批间和批内变异系数均小于10.96％，说明AD7c蛋白荧光免疫层析检测卡的精密度较高。

表4检测数据

5.回收率

取三批次浓度为10ng/mL的AD7c-NTP校准品，分别加入到浓度接近于0的阴性样本中，其中所加入的AD7c-NTP校准品与阴性样本的体积比为1：9，重复测定3次，计算回收率。三批样本校准品回收率的结果分别为97.34％、104.15％、90.12％，回收率均在90％-110％之间，说明测定结果符合标准。

实施例3

1.AD7c-NTP免疫层析检测卡的制备

1)表面活化的荧光乳胶微球的制备：

N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、聚乙二醇单月硅酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，四者的重量比为4:7:2:11。

①取表面活性剂(包含4mg的N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、7mg的聚乙二醇单月硅酸酯、2mg的十二烷基苯磺酸盐和11mg的月桂酰谷氨酸盐)加入pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)中，再加入1mL二甲基甲酰胺、1mg的N,N’-二环己基碳二亚胺和0.5mgN-羟基琥珀酰亚胺，在120r/min的搅拌速度下进行反应；

②取1mL含1wt％的表面带有羧基的表面的荧光乳胶微球的分散液(购自上海甄准生物技术有限公司)，用10mL 0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)稀释分散均匀后，加入到步骤①所得的产物中，在25℃，120r/min的搅拌速度下反应3h，反应完毕后，按照12000r/min的转速离心30min去除上清液，得到表面活化的荧光乳胶微球，用0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液复溶至1mL备用。

2)另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

3)兔IgG多克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL mg羊兔IgG多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

4)包被垫的制备

将一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释成1mg/mL，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上按照1mg/mL的浓度进行划膜。含有一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体的作为检测线(T线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)6，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。

5)标记物垫的制备

①将玻璃纤维素膜在pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中浸泡6h，然后在35℃下干燥8h，备用。

②将摩尔比为1:1的另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球混合均匀后，按照10μL/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫上包被有另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球的地方叫做标记物结合处7。设置标记物结合处7的目的同实施例1。

6)免疫层析检测卡的组装

首先在PVC板1上粘接包被垫2，然后在靠近包被垫2上的质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近包被垫2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条，将试纸条放入卡壳中制备成AD7c-NTP免疫层析检测卡。所述卡壳的结构同实施例1。

2.检测

取60μL的待测尿液样本滴加到步骤1制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡的加样孔(对应试纸条的样品垫9)中，室温静置15min进行免疫层析反应，然后将AD7c-NTP免疫层析检测卡***到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。

3.标准曲线的建立

配置不同浓度的AD7c-NTP标准品(0、0.25、1、2、5、10ng/mL)，用本发明步骤中制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡按照步骤2的检测过程依次进行检测，空白检测限不高于0.25ng/mL，检测范围为0.25～10ng/mL。检测结果如表5所示，以样本浓度为横坐标，检测线与质控线的比值(T/C)为纵坐标，用logistic(四参数)进行曲线拟合，拟合度R²为0.9997，n＝6，制备的AD7c-NTP校准曲线如图5所示。T/C值与校准品在浓度为0.25～10ng/mL的范围内具有良好的相关性。

表5检测数据

标准浓度ng/mL	0	0.25	1	2	5	10
							T/C值	0.0048	1.0135	1.9846	2.5892	3.1384	3.4739

4.精密度

抽取三个AD7c-NTP免疫层析检测卡检测试纸条，分别检测浓度为1.5、3.5、5ng/mL的样本进行检测，每个浓度点平行测定10次，计算三个批号检测试纸条的批内变异系数和批间变异系数，从表6中可以看出批间和批内变异系数均小于10.67％，说明AD7c-NTP免疫层析检测卡荧光免疫层析检测卡的精密度较高。

表6检测数据

5.回收率

取三批次浓度为10ng/mL的AD7c-NTP校准品，分别加入到浓度接近于0的阴性样本中，其中所加入的AD7c-NTP校准品与阴性样本的体积比为1：9，重复测定3次，计算回收率。三批样本校准品回收率的结果分别为92.12、109.11％、105.01％，回收率均在90％-110％之间，说明测定结果符合标准。

实施例4

1.AD7c-NTP免疫层析检测卡的制备

1)表面活化的荧光乳胶微球的制备：

N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、聚乙二醇单月硅酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，四者的重量比为6:9:3:5。

①取表面活性剂(包含6mg的N，N'-双月桂酰基乙二胺二丙烯酸钠、9mg的聚乙二醇单月硅酸酯、3mg的十二烷基苯磺酸盐和5mg的月桂酰谷氨酸盐)加入pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)中，再加入1mL二甲基甲酰胺、1mg的N,N’-二环己基碳二亚胺和0.5mgN-羟基琥珀酰亚胺，在120r/min的搅拌速度下进行反应；

②取1mL含1wt％的表面带有羧基的荧光乳胶微球的分散液(购自上海甄准生物技术有限公司)，以0.2mol/L pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液(包含0.5wt％～3wt％的PEG2000)调pH至8.4后，加入到步骤①所得的产物中，在25℃，120r/min的搅拌速度下反应3h，反应完毕后，按照12000r/min的转速离心30min去除上清液，得到表面活化的荧光乳胶微球，用0.2mol/L，pH＝8.4的硼酸-硼砂缓冲溶液复溶至1mL备用。

2)另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

3)兔IgG多克隆抗体标记表面活化的荧光乳胶微球

取0.5mL步骤1)中制备的表面活化的荧光乳胶微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL mg羊兔IgG多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

4)包被垫的制备

将一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)进行稀释，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上按照1mg/mL的浓度进行划膜。含有一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体的作为检测线(T线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)6，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。

5)标记物垫的制备

①将玻璃纤维素膜在0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中浸泡6h，然后在35℃下干燥8h，备用。

②将摩尔比为1:1的另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球混合均匀后，按照10μL/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫上包被有另一株鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体标记的表面活化的荧光乳胶微球和兔IgG标记的表面活化的荧光乳胶微球的地方叫做标记物结合处7。设置标记物结合处7的目的同实施例1。

6)免疫层析检测卡的组装

首先在PVC板1上粘接包被垫2，然后在靠近包被垫2上的质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近包被垫2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条，将试纸条放入卡壳中制备成AD7c-NTP免疫层析检测卡。所述卡壳的结构同实施例1。

2.检测

取60μL的待测尿液样本滴加到步骤1制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡的加样孔(对应试纸条的样品垫9)中，室温静置15min进行免疫层析反应，然后将AD7c-NTP免疫层析检测卡***到荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。

3.标准曲线的建立

配置不同浓度的AD7c-NTP标准品(0、0.25、1、2、5、10ng/mL)，用本发明步骤1中制备的AD7c-NTP免疫层析检测卡按照步骤2的检测过程依次进行检测，空白检测限不高于0.25ng/mL，检测范围为0.25～10ng/mL，检测结果如表7所示，以样本浓度为横坐标，检测线与质控线的比值(T/C)为纵坐标，用logistic(四参数)进行曲线拟合，拟合度R²为0.9992，n＝6，制备的AD7c-NTP校准曲线如图6所示，T/C值与校准品在浓度为0.25～10ng/mL的范围内具有良好的相关性。

表7检测数据

标准浓度ng/mL	0	0.25	1	2	5	10
							T/C值	0.0578	1.2934	2.0948	2.5902	3.2948	3.6082

4.精密度

抽取三个AD7c-NTP免疫层析检测卡，分别检测浓度为1.5、3.5、5ng/mL的样本进行检测，每个浓度点平行测定10次，计算三个批号检测试纸条的批内变异系数和批间变异系数，从表8中可以看出批间和批内变异系数均小于12.05％，说明AD7c-NTP免疫层析检测卡的精密度较高。

表8检测数据

5.回收率

取三批次浓度为10ng/mL的AD7c-NTP校准品，分别加入到浓度接近于0的阴性样本中，其中所加入的AD7c-NTP校准品与阴性样本的体积比为1：9，重复测定3次，计算回收率。三批样本校准品回收率的结果分别为96.79％、109.93％、104.08％，回收率均在90％-110％之间，说明测定结果符合标准。

附：所需溶液配置

(1)0.2M磷酸盐缓冲溶液

NaH₂PO₄·H₂O 5.24g；

Na₂HPO₄·2H₂O 28.83g；

纯化水定容至1000mL；

(2)0.2M硼酸-硼砂缓冲溶液

硼砂 19.07g；

硼酸 12.37g；

PEG2000 5～30g；

纯化水定容至1000mL。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。